Summary
En metod att odla en endotelcell monoskikt under hela inre 3D ytan av en mikrofluidanordning med mikrovaskulär storlek kanaler (<30 pm) beskrivs. Detta
Abstract
Advances in mikrotillverkningstekniker har möjliggjort produktion av billiga och reproducerbar mikrofluidiksystem för utförande biologiska och biokemiska experiment på mikro-och nanoscales 1,2. Dessutom har mikrofluidik också specifikt används för att kvantitativt analysera hematologiska och mikrovaskulär processer, på grund av deras förmåga att enkelt styra den dynamiska fluid miljö och biologiska förhållanden 3-6. Som sådan har forskare på senare tid används för mikroflödessystem system för att studera deformerbarhet blodkroppar, blodkroppar aggregering, mikrovaskulära blodflödet, och blod cell-endotel interaktioner 6-13. Dessa mikroflödessystem system antingen inte innehöll odlade endotelceller eller var större än sizescale relevant för mikrovaskulära patologiska processer. En mikrofluidisk plattform med odlade endotelceller som korrekt rekapitulerar den cellulära, fysikaliska och hemodynAmic miljö mikrocirkulationen behövs för att främja vår förståelse av den underliggande biofysiska patofysiologi hematologiska sjukdomar som involverar mikrocirkulation.
Här rapporterar vi en metod för att skapa en "endotelialiserade" in vitro modell av mikrovaskulaturen, med hjälp av en enkel, enhetlig process mask mikrofabrikation i samband med standard endotelceller cellodlingstekniker, för att studera patologiska biofysiska mikrovaskulära samspel som sker i hematologiska sjukdomar. Denna "mikrocirkulation-on-a-chip" ger forskaren en robust analys som tätt kontrollerar både biologiska och biofysiska förhållanden och drivs med en vanlig spruta pump och brightfield / fluorescensmikroskopi. Parametrar såsom förhållanden mikrocirkulatoriska hemodynamiska, endotelcell typ, blodkroppar typ (er) och koncentration (er), drog / hämmande koncentration etc. kan alla vara lätt att kontrollera. Som sådan tillhandahåller vår mikrosystemen metod för att kvantitativt undersöka sjukdomsprocesser som mikrovaskulära flöde nedsatts på grund av förändringar i cell adhesion, aggregation och deformerbarhet, en förmåga tillgänglig med befintliga analyser.
Protocol
1. Tillverkningen av Endothelial mikroanordning
- Skapa en fotomask genom att skicka ett datorstödd konstruktion (CAD) ritning av mikroflödessystem enheten till en extern mask leverantör. Masken användes bestod av en krom skikt på sodaglas. I detta fall är mikrofluidikkanal bredd var 30 pm.
- Rengöra en naken kiselskiva med Piranha (10:1 förhållande av svavelsyra och väteperoxid) under 15 minuter och doppa i fluorvätesyra under 30 sekunder. Skölj med avjoniserat (DI) vatten i ca 10 sekunder.
- Användning av en spinnbeläggare, spinn Microchem SU-8 2025 fotoresist på skivan till en höjd av 30 pm. För SU-8 2025, är ett centrifugeringsvarvtal på 3000 rpm rekommenderas. Andra viskositeten hos SU-8 är tillgängliga som kommer att uppnå denna höjd. Fullständiga instruktioner för SU-8 användas finns på www.microchem.com
- Placera skivan med SU-8 på en värmeplatta vid 95 ° C under5 minuter för att driva av överskott av lösningsmedel.
Obs: En ugn torkar rånet annorlunda än en värmeplatta och rekommenderas inte. - Placera en mask med den önskade funktionen formen över skivan, och utsättas för UV-ljus (160 mJ / cm 2 uppmätt vid 365 nm) i en maskuppriktare (Karl Suss, MA-6). Detta tvärbindningar fotoresisten.
- Placera skivan tillbaka på en värmeplatta vid 95 ° C under ytterligare 5 minuter för att ytterligare påskynda polymerisation av SU-8.
- Doppa den tunna skivan i SU-8 Utvecklare, sammansatt primärt av PGMEA (propylenglykol-metyleteracetat) under 4 minuter för att avlägsna den icke-tvärbundna SU-8.
- Skölj nyutvecklade wafern med 100% isopropylalkohol (IPA) under 10 s. Skivan kan sedan torkas med användning av trycksatt kväve eller genom att låta lösningsmedlet avdunsta från skivan i en ren dragskåp under flera minuter.
- Tejp kanter torr skivan med mönstrade SU-8 i en petriskål för att i förvägventilera rörelse.
- Tillämpas 1 ml Sigmacote till skivan med användning av en pipett, täck med den övre delen av Petri-skål och virvla skivan för att säkerställa fullständig beläggning av den tunna skivan, avlägsna höljet och låta skivan torka under flera minuter tills allt lösningsmedel har avdunstat.
2. PDMS (polydimetylsiloxan) Framställning
- Blandning PDMS-polymer och härdningsmedel vid en 10:01-förhållande (vikt / vikt) och avlägsna luftbubblor med användning av en vakuum-exsickator. Den tid som krävs för att avgasa PDMS varierar på styrkan av den tillgängliga vakuumsystem, men är vanligen inom området från flera minuter till en timme. För en sex tums petriskål utan tidigare hälldes PDMS, en total volym av 60 ml av polymeren är att rekommendera.
- Häll ut blandningen på skivan, ungefär 5 mm tjockt. Också häll ut på en plan botten skål för att skapa en tunn skiva av PDMS, ungefär 1 mm tjock. Härda vid 60 ° C i en ugn över natten.
- Med en kniv eller skalpell, skär ut runt cmätt PDMS enheten och ta bort den från skivan. Dessutom skärs en tunn skiva av PDMS är något större än anordningen.
- Skapa in-och utlopp hål i PDMS enheten med en 1,0 mm hål. Detta kan åstadkommas med användning av antingen en tapp last, Uni-Core Harris, eller liknande anordning.
- Rengör ytorna i pumpen och arket med tejp.
- Användning av en plasma renare, exponera ytor PDMS anordningen och PDMS arket till syrgasplasma under 30 s. Syreplasma skapar reaktiva species på den exponerade ytan av PDMS som bindning när de bringas i fysisk kontakt.
- Ansluta mindre slang till en liten längd (flera centimeter) av stor slang, vilken i sin tur är ansluten till en spruta med en trubbig nål punkt, fylld med 50 ^ g / ml fibronektin från human plasma i PBS. Slangen och nålen är dimensionerade så att en friktionspassning skapas mellan slangen. Sätt mindre rör i inlopp PDMS mikroanordning och enpply tryck på sprutan för att fylla kanalerna fullständigt med fibronektinlösningen och för att skapa en liten 100 | il droppe vid utloppsporten, för att säkerställa att kanalerna stanna blöt. Inkubera anordningen vid 37 ° C under 40-60 min.
- Ansluta en ny spruta fylld med PBS för att den trubbiga kanylen punkten. Applicera tryck på sprutan för att skölja anordningen med PBS.
3. Ympning av mikrofluidanordningen med endotelceller
- Framställ 1.000.000 celler / ml i humana navelvenendotelceller (HUVEC) i endotelceller tillväxtmedium med 8% dextran. Ett område av 500.000 till 2.000.000 celler / ml har använts med framgång. Tillsats av dextran till cellbelastning mediet ökar viskositeten hos vätskan, vilket minskar hastigheten för endotelceller som de kommer in i fibronektin-belagda mikroflödessystem. Detta i sin tur ökar sannolikheten för att cellerna kommer att fästa och kultur framgång inom mikroanordning.
- CNSLUT den nya injektionssprutan och slang som i Steg 2.7. men med en längre slang (ungefär 1 meter i längd).
- För att optimera prestanda hos detta system är det kritiskt vid denna punkt för att förhindra läckor eller bubblor i hela perfusionssystemet, läckor av lösningen eller i närvaro av bubblor i mediet kommer att förändra flödet och förhindra framgångsrik ympning av endotelceller. Därför är åtsittande på slangen viktigt att undanröja läckage mellan några anslutningar. Bubblor i sprutan och / eller slang måste elimineras innan cellerna införs i mikroanordning och hela perfusionen bör fyllas med cellösningen innan du ansluter slangen till mikroflödessystem att undvika att luftbubblor.
- Användning av en sprutpump, infusera cellsuspension in PDMS anordningen vid volumetrisk flödeshastighet av 1,23 | il / min under 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO2. Optimala resultat uppnåddes när sprutan pumpen var i samma höjd som PDMS anordningen. För inloppet, säkerställer den längre slang, vilken kan lindas inuti inkubator, att cellerna och media tillräckligt uppvärmd innan den kommer i kontakt med anordningen. I vårt system, approximerar den volumetriska flödeshastigheten av 1,23 | il / min en mittstråleurin hastighet av ~ 1 mm / s i de minsta mikrokanaler, motsvarande en vägg skjuvspänning av ~ 1 dyn / cm 2 vid dessa kanaler med hjälp av helblod.
- Med användning av samma sprutpumpen och lång slang, perfundera färska odlingsmediet under 2-8 dagar vid mellan 1,23 pl / min. En framgångsrik anordning har ett monoskikt av endotelceller växer på insidan av anordningen inom 24-48 timmar. Tidigare experiment har visat att sammanflytande monoskikt lämpligt uttrycka VE-cadherin i cell-cell-föreningspunkter genom hela anordningen 14.
- Injicera blod eller cellsuspension in i systemet för experiment.
4. Representativa resultat
_content "> Med detta protokoll är standard litografiska mikrotillverkningstekniker används för att skapa formen som behövs för att producera de mikroflödessystem kanaler som fysiologiskt efterliknar sizescale av mikrovaskulaturen (Figur 1A). Med en optimerad perfusion teknik, endotelceller så frön och sammanflytande kultur i Hela insidan av mikroflödessystem inom 24-48 timmar cellympning (Figur 1B). Eftersom mikroflödessystem är transparent, kan hela mikroanordning placeras på en brightfield / fluorescensmikroskop scen för avbildning och datainsamling.Vårt system kan sedan användas för att studera hematologiska sjukdomar som innebär förändrade biofysiska egenskaper, såsom sicklecellanemi, där den ökade styvheten sickled röda celler och avvikande leukocyt-och endotel vidhäftning bidrar till mikrovaskulär hinder. En kliniskt godkända läkemedel, hydroxiurea, förbättrar symtom men dess direct effekt på mikrovaskulär flöde är okänd. Vår analys tar hänsyn till både cell-styvhet och vidhäftning, och visar att hydroxiurea kraftigt förbättrar flödet i sicklecellanemi (figur 2).
Sicklecellanemi är bara ett exempel på en ansökan om mikrovaskulaturen-on-a-chip, eftersom detta system är idealisk att studera eventuella hematologiska process där blodkroppar interagerar med varandra och endotelceller i mikrovaskulaturen. Andra kliniskt relevanta applikationer inkluderar inflammatoriska sjukdomar, sepsis / lungskada, trombotiska mikroangiopatier, malaria och cancer metastaser medan mer grundläggande tillämpningar är leukocyt biologi och hematopoetisk stamcellsbiologi, bland många andra.
Figur 1. A) Den inledande PDMS mikroflödessystem enheten innan endotelialisering. Här är den mikroanordning injiceras with karamellfärg för att illustrera sizescale och övergripande design av systemet. B) Brightfield mikroskopi visar mikroflödessystem helt endotelialiserade inom 48 timmar efter cellympning användning av det protokoll som beskrivs här.
Figur 2. A) mikrovaskulaturen-on-a-chip med mikrokanaler ungefär storleken av post-kapillära venoler (30 m), platsen för de flesta sickle cell mikrovaskulära obstruktiva händelser. Helblod från sickle cell patienter hydroxiurea och från patienter som inte fick hydroxiurea strömmar genom två olika mikrocirkulation-on-a-chip enheter. B) Helblod från sickle cell patienter hydroxiurea flöden med relativ lätthet inom endotelialiserade mikrokanaler. C) Under samma hemodynamiska förhållanden, helblod från sickle cell patienter som inte fick hydroxiurea dock uppvisar betydligt trögare flöde med microchannel hinder. Den nedre kanalen är helt blockerad utan flöde och flödeshastigheter i de andra endotelialiserade mikrokanaler är betydligt lägre än i hydroxiurea skick. Skalan baren i alla tre bilder är 30 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt endotelialiserade mikroanordning system lämpar sig bäst när den används tillsammans med in vivo experiment och dess reduktionistiskt synsätt kan hjälpa belysa biofysiska mekanismer hematologiska processer som observerats hos människa och djurmodeller. Dessutom är vårt system inte utan begränsningar. Exempelvis våra mikrofluidiska kanaler är kvadratiskt i tvärsnitt. Även tekniskt cirkulära mikrokanaler kan tillverkas 10,11, valde vi att använda ett enklare och standard tillverkning förfarande, så att andra forskare lätt kan tillämpa detta system till sitt eget arbete. Dessutom, närvaron av de odlade endotelceller naturligt "v ut" den effektiva lumen, vilket möjliggör för systemet att vara mer fysiologisk. Dessutom vår vätska dynamisk modellering visar att flödesförhållandena i vårt system är jämförbar med den i in vivo mikrovaskulaturen. Slutligen senaste arbete som kännetecknar blodflödet i kvadrat ettd rektangulära mikrokanaler har visat att dessa geometrier är lämpliga för experiment blod reologi 15.
Slutligen är vår analys inte är avsett att mäta, i isolering, distinkta cellulära biofysiska egenskaper som leder till mikrovaskulär ocklusion. Tekniker såsom atomkraftmikroskopi, mikropipett aspiration, och optiska infångning har karakteriserats väl för dessa typer av experiment. Istället är värdet av vår mikrosystemet sin förmåga att sammanfatta, samtidigt och inom ett enda in vitro-system, en ensemble av fysiologiska processer och biofysiska egenskaper, inklusive adhesionsmolekyl uttryck, avvikande blod cell-endotelceller interaktioner cell, blodkroppar aggregering (t.ex. trombos ), cell deformerbarhet, cell storlek / form, mikrovaskulära geometri och hemodynamik, som alla bidrar till patologiska mikrovaskulära cellulära interaktioner i olika sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar T. Hunt, M. Rosenbluth och Lam Lab för deras råd och nyttiga diskussioner. Vi erkänner stöd från G. Spinner och Institutet för elektronik och nanoteknologi vid Georgia Institute of Technology. Ekonomiskt stöd till detta arbete gavs av en NIH bidrag K08-HL093360, UCSF REAC utmärkelse, en NIH nanomedicin Development Center Award PN2EY018244 och finansiering från Centrum för Endothelial Cell Biology av barns Healthcare of Atlanta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
