Summary
Procédé pour la culture d'une monocouche de cellules endothéliales sur toute la surface intérieure 3D d'un dispositif microfluidique avec microvasculaire taille canaux (<30 um) est décrite. Cette
Abstract
Les progrès des techniques de microfabrication ont permis la production de bon marché et reproductible des systèmes microfluidiques pour mener des expériences biologiques et biochimiques à l'1,2 micro-et nanométrique. En outre, la microfluidique ont également été spécifiquement utilisés pour l'analyse quantitative des processus hématologiques et microvasculaire, en raison de leur capacité de contrôler facilement l'environnement dynamique fluidique et des conditions biologiques 3-6. En tant que tel, les chercheurs ont plus récemment utilisé des systèmes microfluidiques pour étudier la déformabilité des globules, l'agrégation des cellules du sang, le flux sanguin microvasculaire, et le sang interactions cellulaires de cellules endothéliales-6-13. Toutefois, ces systèmes microfluidiques soit ne comprennent pas les cellules endothéliales en culture ou étaient plus que la pertinente sizescale à microvasculaires processus pathologiques. Une plate-forme microfluidique avec des cultures de cellules endothéliales qui récapitule avec précision le cellulaire, physique, et hemodynenvironnement amique de la microcirculation est nécessaire d'approfondir notre compréhension de la pathophysiologie sous-jacente biophysique des maladies hématologiques qui impliquent le système microvasculaire.
Nous rapportons ici une méthode pour créer un «endothélialisée" modèle in vitro de la microvascularisation, en utilisant un processus simple et unique masque de microfabrication en conjonction avec standards endothéliales techniques de culture cellulaire, pour étudier les interactions pathologiques microvasculaires biophysiques qui se produisent dans la maladie hématologique. Ce "système microvasculaire-sur-une-puce» fournit au chercheur un test robuste, qui contrôle étroitement biologique ainsi que les conditions biophysiques et est exploité à l'aide d'une seringue électrique standard et clair / microscopie à fluorescence. Des paramètres tels que les conditions hémodynamiques microcirculatoires, le type de cellules endothéliales, le type de cellules sanguines (s) et concentration (s), la drogue ou de concentration inhibitrice etc, tout cela peut être facilement contrôlé. En tant que tel, notre microsystème fournitune méthode pour étudier les processus quantitativement la maladie dans laquelle l'écoulement microvasculaire est altérée en raison de modifications dans l'adhésion cellulaire, l'agrégation et la déformabilité, d'une capacité disponible avec les tests actuels.
Protocol
1. Fabrication du microdispositif endothéliale
- Créer un photomasque en soumettant une conception assistée par ordinateur (CAO) dessin du dispositif microfluidique à un fournisseur masque à l'extérieur. Le masque utilisé est composé d'une couche de chrome sur verre sodocalcique. Dans ce cas, la largeur du canal microfluidique était de 30 um.
- Nettoyer une plaquette de silicium nu avec piranha (10:1 rapport de l'acide sulfurique et de peroxyde d'hydrogène) pendant 15 minutes et plonger dans l'acide fluorhydrique pendant 30 secondes. Rincer à l'eau désionisée (DI) de l'eau pendant environ 10 secondes.
- Utilisation d'un tournette, de spin Microchem SU-8 2025 photorésist sur la plaquette à une hauteur de 30 um. Pour SU-8 2025, une vitesse de rotation rpm 3000 est recommandé. Les autres viscosités de SU-8 sont disponibles qui permettront d'atteindre cette hauteur. Les instructions complètes pour SU-8 utilisation sont disponibles à www.microchem.com
- Placer la galette avec SU-8 sur une plaque chauffante à 95 ° C pour les5 minutes pour chasser l'excès de solvant.
Remarque: Un four va sécher la plaquette différente de celle d'une plaque chauffante et n'est pas recommandée. - Placer un masque à la forme caractéristique désirée sur la plaquette, et exposer à la lumière UV (160 mJ / cm 2 mesurée à 365 nm) dans un alignement de masque (Karl Suss, MA-6). Cette croix relie la résine photosensible.
- Placez la tranche de retour sur une plaque chauffante à 95 ° C pendant 5 minutes supplémentaires pour encore accélérer la polymérisation de la SU-8.
- Plonger la plaquette dans SU-8 Developer, composée principalement de PGMEA (propylène glycol acétate d'éther méthylique) pendant 4 minutes pour enlever le non-réticulé SU-8.
- Rincer la plaquette récemment mis au point avec de l'alcool isopropylique à 100% (IPA) pendant 10 s. La plaquette peut ensuite être séché à l'aide d'azote sous pression ou en permettant au solvant de s'évaporer de la tranche dans une hotte de fumée propre pendant plusieurs minutes.
- Cassette les bords de la plaquette à motifs sec avec SU-8 dans une boîte de Pétri pour préévacuer le mouvement.
- Appliquer une ml de Sigmacote à la plaquette à l'aide d'une pipette, recouvrir la partie supérieure de la boîte de Pétri, et plaquette de tourbillonnement pour assurer revêtement complet de la plaquette, enlever le couvercle, et permettre plaquette à sécher pendant plusieurs minutes jusqu'à ce que tout le solvant soit évaporé.
2. PDMS (polydiméthylsiloxane) Préparation
- Mélange polymère PDMS et agent de durcissement dans un rapport 10:01 (p / p) et éliminer les bulles d'air au moyen d'un dessiccateur à vide. La longueur du temps nécessaire pour dégazer le PDMS varie sur la force du système de vide disponible, mais est généralement comprise entre quelques minutes à une heure. Pour une durée de six pouces plat de Pétri, sans préalablement versé PDMS, un volume total de 60 ml de polymère est recommandé.
- Verser le mélange sur la tranche, d'environ 5 mm d'épaisseur. En outre verser sur un plat à fond plat pour créer une feuille mince de PDMS, environ 1 mm d'épaisseur. Durcir à 60 ° C dans un four pendant une nuit.
- Avec un couteau ou un scalpel, découpez autour de la cURED dispositif de PDMS et le retirer de la plaquette. En outre, couper une mince feuille de PDMS légèrement plus grand que l'appareil.
- Créer des trous d'entrée et de sortie dans le dispositif PDMS l'aide d'un poinçon de trou de 1,0 mm. Cela peut être accompli en utilisant soit un vice broches, dispositif de Harris Uni-Core, ou similaire.
- Nettoyer les surfaces de l'appareil et la feuille à l'aide du scotch.
- Utilisation d'un détergent à plasma, exposer les surfaces du dispositif PDMS et la feuille PDMS à plasma d'oxygène pendant 30 s. Le plasma d'oxygène crée des espèces réactives à la surface exposée de la liaison lorsque PDMS qui met en contact physique.
- Connecter plus petite tubulure à une petite longueur (quelques centimètres) de tube grande, qui à son tour est reliée à une seringue à aiguille émoussée point, rempli de 50 pg / ml de fibronectine de plasma humain dans du PBS. Le tube et une aiguille sont dimensionnés de telle sorte qu'une friction est créé entre le tube. Insérer plus petite tube dans l'entrée de PDMS et un microdispositifppliquer pression à la seringue pour remplir complètement les canaux avec une solution de la fibronectine et de créer une petite goutte 100 pi à l'orifice de sortie, afin de s'assurer que les canaux restent mouillées. Incuber le dispositif à 37 ° C pendant 40-60 min.
- Connecter une seringue remplie de PBS frais à l'aiguille pointe émoussée. Appliquer une pression à la seringue pour rincer l'appareil avec du PBS.
3. L'ensemencement du dispositif microfluidique avec les cellules endothéliales
- Préparer 1.000.000 cellules / ml de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) dans les médias de croissance endothéliale avec 8% de dextran. Une gamme de 500.000 à 2.000.000 cellules / ml a été utilisé avec succès. Addition de dextrane dans le milieu de chargement de cellules augmente la viscosité du fluide, ce qui diminue la vitesse des cellules endothéliales qui entrent le système fibronectine revêtu microfluidique. Ce, à son tour, augmente la probabilité que les cellules adhèrent et de la culture avec succès au sein de la microdispositif.
- Celiez la nouvelle seringue et le tube comme à l'étape 2.7. mais avec une plus tube (environ 1 mètre de longueur).
- Pour optimiser les performances de ce système, il est essentiel à ce stade pour éviter toute fuite ou de bulles dans le système de perfusion ensemble; toute fuite de la solution ou la présence de bulles dans les médias va changer le débit et d'empêcher l'ensemencement avec succès des cellules endothéliales. Par conséquent, adhérente de la tubulure est essentiel pour éliminer les fuites entre les connexions. Bulles dans la seringue et / ou des tubes doivent être éliminés avant que les cellules sont introduites dans le microdispositif et le système de perfusion entière doit être amorcée avec la solution de cellules avant de fixer le tuyau à la microfluidique afin d'éviter l'introduction de bulles d'air.
- En utilisant une pompe seringue, injecter la suspension de cellules dans le dispositif PDMS à un débit volumétrique de 1,23 l / min pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. Des résultats optimaux ont été obtenus lorsque la pompe à seringue était à la même hauteur que le dispositif PDMS. Pour l'entrée, le long tube, qui peut être enroulé dans l'incubateur, en sorte que les cellules et le milieu sont suffisamment chauffé avant de venir en contact avec le dispositif. Dans notre système, le débit volumétrique de 1,23 l / min se rapproche à une vitesse médiane du ~ 1 mm / s dans les plus petites microcanaux, correspondant à une contrainte de cisaillement mur de ~ 1 dyne / cm 2 à ces canaux à l'aide de sang total.
- Utilisation de la pompe même seringue et le tube long, perfuser un milieu de croissance frais pour 2-8 jours à taux de 1,23 l / min. Un dispositif de retenue doit avoir une monocouche de cellules endothéliales en croissance à l'intérieur de l'appareil dans les 24-48 heures. Des expériences antérieures ont montré que des monocouches confluentes de manière appropriée d'exprimer la VE-cadhérine à jonctions cellule-cellule dans le dispositif 14.
- Injecter du sang ou de la suspension cellulaire dans le système pour l'expérimentation.
4. Les résultats représentatifs
_content "> En utilisant ce protocole, les techniques classiques de microfabrication lithographiques sont utilisés pour créer le moule nécessaire pour produire les canaux microfluidiques que, physiologiquement, imitent l'sizescale de la microvascularisation (figure 1A). En utilisant une technique de perfusion optimisé, les cellules endothéliales alors la culture de semences et de la confluently toute la surface interne du système microfluidique dans les 24-48 heures de ensemencement des cellules (figure 1B). Comme le système microfluidique est transparent, le microdispositif entier peut être placé sur un fond clair / étape microscope à fluorescence pour l'imagerie et la collecte de données.Notre système peut alors être appliquée pour étudier les maladies hématologiques qui impliquent modifiés propriétés biophysiques, comme la drépanocytose, dans lequel la rigidité accrue de globules rouges falciformes et aberrante d'adhérence des leucocytes et des cellules endothéliales contribuent à l'obstruction microvasculaire. Un médicament approuvé cliniquement, l'hydroxyurée, améliore les symptômes, mais sa dDIRECT effet sur les flux microvasculaire est inconnue. Notre test prend en compte la rigidité cellulaire et l'adhérence, et démontre que l'hydroxyurée améliore de manière significative l'écoulement dans la drépanocytose (figure 2).
La drépanocytose est un seul exemple d'une demande de la microvascularisation-sur-une-puce, comme ce système est idéalement adapté à l'étude tout processus hématologique dans lequel les cellules sanguines interagir les uns avec les autres cellules et des cellules endothéliales dans la microcirculation. D'autres applications cliniquement pertinents comprennent les troubles inflammatoires, sepsis / poumon blessures, les microangiopathies thrombotiques, le paludisme, et les métastases du cancer tout en plus d'applications de base comprennent la biologie des leucocytes et de cellules souches hématopoïétiques biologie, parmi beaucoup d'autres.
Figure 1. A) la première PDMS microfluidique appareil avant endothélialisation. Ici, le microdispositif est injecté l'esprith colorant alimentaire pour illustrer la conception sizescale et dans l'ensemble du système. B) microscopie en fond clair montre le système microfluidique est complètement endothélialisée dans les 48 heures de l'ensemencement de cellules en utilisant le protocole décrit ici.
Figure 2. A) La microvascularisation-sur-une-puce avec microcanaux se rapproche de la taille de veinules post-capillaires (30 um), le site de la plupart des événements drépanocytaires obstructives microvasculaires. Le sang total chez les patients drépanocytaires recevant l'hydroxyurée et de patients ne recevant pas l'hydroxyurée est coulé par deux différents microvascularisation-sur-une-puce. B) Le sang total chez les patients drépanocytaires qui accueillent des flux hydroxyurée avec une relative facilité dans les microcanaux endothélialisée. C) Dans les mêmes conditions hémodynamiques, le sang total chez les patients drépanocytaires qui ne reçoivent pas l'hydroxyurée, cependant, le débit beaucoup plus lent avec microchobstruction annel. Le canal inférieur est complètement obstruée sans écoulement et les vitesses d'écoulement dans les microcanaux autres endothélialisée sont significativement plus faible que dans l'état hydroxyurée. La barre d'échelle dans les trois images est de 30 um.
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Discussion
Notre système de microdispositif endothélialisée est le mieux adapté lorsqu'il est utilisé en conjonction avec les expériences in vivo, et son approche réductionniste peut aider à élucider les mécanismes biophysiques des processus hématologiques qui sont observés chez les humains et les modèles animaux. En outre, notre système n'est pas sans limites. Par exemple, nos canaux microfluidiques sont carrées en coupe. Bien que techniquement microcanaux circulaires peuvent être fabriqués 10,11, nous avons opté d'utiliser un procédé de fabrication plus simple et standard pour permettre aux chercheurs d'autres facilement appliquer ce système à leur propre travail. En outre, la présence des cellules en culture endothéliales naturellement »tours, à« la lumière efficace, permettant au système d'être plus physiologique. En outre, notre modélisation dynamique des fluides révèlent que les conditions d'écoulement dans notre système sont comparables à celle de l'in vivo microvascularisation. Enfin, des travaux récents qui caractérise le flux sanguin dans la case d'und microcanaux rectangulaires a montré que ces géométries sont adaptés pour des expériences de rhéologie du sang 15.
Enfin, notre analyse ne vise pas à mesurer, dans l'isolement, distinctes cellulaires propriétés biophysiques qui conduisent à une occlusion microvasculaire. Des techniques telles que la microscopie à force atomique, aspiration par micropipette, et le piégeage optique ont été bien caractérisés pour ces types d'expériences. Au lieu de cela, la valeur de notre microsystème est sa capacité à résumer, simultanément et dans un seul système in vitro, un ensemble de processus physiologiques et les propriétés biophysiques, y compris l'expression des molécules d'adhérence, aberrants interactions des cellules sanguines de cellules endothéliales-, l'agrégation des cellules du sang (par exemple une thrombose ), la déformabilité cellulaire, la taille des cellules / forme, la géométrie microvasculaire, et de l'hémodynamique, qui contribuent tous à la pathologiques interactions cellulaires dans microvasculaires différents états pathologiques.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous remercions T. Hunt, M. Rosenbluth, et le Laboratoire de Lam pour leurs conseils et des discussions utiles. Nous reconnaissons l'appui de G. Spinner et l'Institut d'Electronique et de la nanotechnologie à l'Institut de Technologie de Géorgie. Le soutien financier pour ce travail a été fourni par une subvention du NIH K08-HL093360, UCSF REAC prix, une nanomédecine NIH Centre de développement des Prix PN2EY018244, et le financement du Centre pour la biologie des cellules endothéliales des soins de santé pour enfants d'Atlanta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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