Summary
Un metodo per la cultura un monostrato di cellule endoteliali durante l'intera superficie interna 3D di un dispositivo a microfluidi con microvascolare canali di dimensioni (<30 micron) è descritta. Questo
Abstract
I progressi nelle tecniche di microfabbricazione hanno permesso la produzione di sistemi microfluidici economici e riproducibili per lo svolgimento di esperimenti biologici e biochimici alla micro-scala nanometrica e 1,2. Inoltre, microfluidica sono stati specificamente utilizzato per analizzare quantitativamente processi ematologiche e microvascolari, a causa della loro capacità di controllare facilmente il ambiente dinamico fluidico condizioni biologiche e 3-6. Come tale, i ricercatori hanno più recentemente usati sistemi microfluidici per studiare deformabilità delle cellule del sangue, cellule aggregazione e flusso sanguigno microvascolare, e globuli-endoteliali interazioni cellulari 6-13. Tuttavia, questi sistemi microfluidici o non includere una coltura di cellule endoteliali o erano più grandi più pertinenti sizescale microvascolari di processi patologici. Una piattaforma microfluidica con colture di cellule endoteliali che riassume con precisione il cellulare, fisico e hemodynambiente Amic della microcircolazione è necessaria per migliorare la nostra comprensione della fisiopatologia sottostante biofisico di malattie ematologiche che coinvolgono il microcircolo.
Qui riportiamo un metodo per creare un "endothelialized" modello in vitro del microcircolo, con un semplice, singolo processo di microfabbricazione maschera in combinazione con tecniche di celle standard endoteliali coltura, per studiare le interazioni patologiche microvascolari biofisiche che si verificano nella malattia ematologica. Questo "microcircolo-on-a-chip" fornisce il ricercatore con un saggio robusto che controlla strettamente biologica nonché delle condizioni biofisiche e viene gestito tramite una pompa standard siringa e brightfield / microscopia a fluorescenza. Parametri quali le condizioni emodinamiche microcircolazione, il tipo di cellule endoteliali, le cellule del sangue di tipo (s) e di concentrazione (s), la droga / concentrazione inibitoria, ecc, possono essere facilmente controllati. Come tale, il microsistema fornisceun metodo per indagare quantitativamente processi patologici in cui viene compromessa flusso microvascolare causa di alterazioni nella adesione cellulare, aggregazione, e deformabilità, una capacità disponibile con saggi esistenti.
Protocol
1. Realizzazione della Microdevice Endothelial
- Creare un fotomaschera presentando un Computer Assisted Design (CAD) disegno del dispositivo a microfluidi a un fornitore esterno la maschera. La maschera utilizzato è composto da uno strato di cromo su vetro soda lime. In questo caso la larghezza del canale microfluidico era 30 pm.
- Pulire un wafer di silicio nudo con Piranha (10:1 rapporto di acido solforico e perossido di idrogeno) per 15 minuti e immerse in acido fluoridrico per 30 secondi. Risciacquare con acqua deionizzata (DI) di acqua per circa 10 secondi.
- Utilizzando un rivestitore a rotazione, rotazione MicroChem SU-8 2025 fotoresist sul wafer per una altezza di 30 pm. Per SU-8 2025, una velocità di rotazione di 3000 rpm è raccomandato. Altre viscosità di SU-8 sono disponibili che realizzerà questa altezza. Le istruzioni complete per il SU-8 l'uso sono disponibili presso www.microchem.com
- Posizionare il wafer con SU-8 su una piastra riscaldante a 95 ° C per5 minuti per eliminare l'eccesso di solvente.
Nota: Un forno si secca il wafer diverso rispetto a un piano di cottura e non è raccomandato. - Posizionare una maschera con la forma funzione desiderata sul wafer, ed esporre alla luce UV (160 mJ / cm 2 misurata a 365 nm) in un allineatore maschera (Karl Suss, MA-6). Questa croce collega il fotoresist.
- Posizionare il wafer posteriore su una piastra riscaldante a 95 ° C per altri 5 minuti per accelerare ulteriormente la polimerizzazione di SU-8.
- Immergere il wafer in SU-8 Developer, composta principalmente da PGMEA (acetato di metile glicole propilenico etere) per 4 minuti per rimuovere il non-cross-linked SU-8.
- Lavare il wafer di nuova concezione con il 100% di alcool isopropilico (IPA) per 10 s. Il wafer può essere essiccato con azoto pressurizzato o consentendo l'evaporazione del solvente dal wafer in una cappa aspirante pulito per diversi minuti.
- Nastro i bordi del wafer secco con modellato SU-8 in una capsula Petri di presfiatare movimento.
- Applicare 1 mL di Sigmacote al wafer utilizzando una pipetta, coprire con la parte superiore della capsula di Petri, wafer e agitare per assicurare rivestimento completo della fetta, rimuovere la copertura, e consentire wafer asciugare per alcuni minuti fino a quando tutto il solvente è evaporato.
2. PDMS (Polidimetilsilossano) Preparazione
- Mix PDMS polimero e l'agente di indurimento in un rapporto 10:1 (w / w) e rimuovere le bolle d'aria utilizzando un essiccatore a vuoto. La lunghezza del tempo necessario per degassare il PDMS varia sulla forza del sistema a vuoto disponibile, ma varia tipicamente da alcuni minuti a un'ora. Per un periodo di sei pollici capsula petri senza precedentemente versata PDMS, un volume totale di 60 ml di polimero è raccomandato.
- Versare il composto sul wafer, circa 5 mm di spessore. Inoltre versare su un piatto fondo piatto per creare un sottile foglio di PDMS, circa 1 mm di spessore. Polimerizzazione a 60 ° C in un forno per una notte.
- Usando un coltello o bisturi, tagliare intorno alla crato dispositivo PDMS e rimuoverlo dal wafer. Inoltre, tagliare un foglio sottile di PDMS leggermente più grande del dispositivo.
- Creare fori di ingresso e di uscita del dispositivo utilizzando un PDMS foratura 1,0 mm. Ciò può essere realizzato utilizzando un perno morsa, dispositivo Harris Uni-core, o simili.
- Pulire le superfici del dispositivo e il foglio con del nastro adesivo.
- Utilizzo di un pulitore plasma, esporre le superfici del dispositivo PDMS e foglio PDMS a plasma di ossigeno per 30 s. Il plasma di ossigeno crea specie reattive sulla superficie esposta del PDMS che legame quando entrano in contatto fisico.
- Collegare tubi di piccolo ad una piccola lunghezza (alcuni centimetri) di tubo grande, che a sua volta è collegato ad una siringa con un ago appuntito-punto, riempito con 50 pg / ml di fibronectina da plasma umano in PBS. Il tubo e l'ago sono dimensionati in modo tale che un accoppiamento ad attrito si crea tra il tubo. Inserire piccolo tubo nella insenatura di PDMS Microdevice e unione pressione alla siringa per riempire i canali completamente con la soluzione fibronectina e per creare una piccola goccia 100 pl a luce di uscita, per garantire che i canali rimanere umida. Incubare il dispositivo a 37 ° C per 40-60 minuti.
- Collegare una siringa fresca ripiena con PBS per l'ago punta smussata. Applicare una pressione alla siringa per sciacquare il dispositivo con PBS.
3. Semina il dispositivo Microfluidic con le cellule endoteliali
- Preparare 1.000.000 cellule / ml di cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) in terreni di crescita endoteliali con 8% destrano. Una gamma di 500.000 a 2.000.000 cellule / ml è stato usato con successo. L'aggiunta di destrano al mezzo cella di carico aumenta la viscosità del fluido, che diminuisce la velocità di cellule endoteliali che entrano la fibronectina rivestita sistema microfluidica. Ciò, a sua volta, aumenta la probabilità che le cellule aderiscono e cultura con successo all'interno del microdispositivo.
- Collegare la siringa nuova e il tubo come indicato al punto 2.7. ma con un tubo più lungo (circa 1 metro di lunghezza).
- Per ottimizzare le prestazioni di questo sistema, è critico a questo punto, per evitare fuoriuscite o bolle nel sistema di perfusione intero; qualsiasi fuoriuscita di soluzione o di presenza di bolle nei media cambierà il flusso e prevenire successo semina di cellule endoteliali. Pertanto, aderente del tubo è essenziale per eliminare le perdite tra i collegamenti. Bolle nella siringa e / o tubi devono essere eliminati prima cellule vengono introdotte nella microdispositivo e l'intero sistema di perfusione devono essere trattate con la soluzione cella prima di collegare il tubo per la microfluidica per evitare l'introduzione di bolle d'aria.
- Utilizzando una pompa a siringa, infonda sospensione cellulare nel dispositivo di PDMS a portata volumetrica di 1,23 microlitri / min per 2 ore a 37 ° C e 5% CO 2. Risultati ottimali sono stati ottenuti quando la pompa a siringa era al stessa altezza del dispositivo PDMS. Per l'ingresso, il tubo più lungo, che può essere avvolto entro l'incubatore, assicura che le cellule ei supporti adeguatamente riscaldata prima di venire in contatto con il dispositivo. Nel nostro sistema, la portata volumetrica di 1,23 microlitri / min approssima una velocità midstream di circa 1 mm / s nei minimi microcanali, corrispondenti ad una sforzi di taglio di circa 1 dyne / cm 2 a quei canali utilizzando sangue intero.
- Utilizzando la stessa pompa siringa e tubo lungo, profumato terreno di coltura fresco per 2-8 giorni al rapporto di 1,23 pl / min. Un dispositivo di successo avrà un monostrato di cellule endoteliali che crescono all'interno del dispositivo in 24-48 ore. Esperimenti precedenti hanno mostrato che monostrati confluenti opportunamente esprimere VE-caderina a cellula-cellula giunzioni tutto il dispositivo 14.
- Iniettare sangue o sospensione di cellule nel sistema per la sperimentazione.
4. Risultati rappresentativi
_content "> Usando questo protocollo, le normali tecniche di microfabbricazione litografica sono utilizzati per creare lo stampo necessario per produrre i canali microfluidici fisiologicamente che imitano la sizescale del microcircolo (Figura 1A). Usando una tecnica ottimizzata perfusione, cellule endoteliali e quindi sementi confluently cultura intera superficie interna del sistema microfluidico entro 24-48 ore dalla semina cellulare (figura 1B). Poiché il sistema microfluidico è trasparente, il microdispositivo intero può essere collocato su un campo chiaro / fase microscopio a fluorescenza per l'imaging e la raccolta dei dati.Il sistema può quindi essere applicato studiare le patologie che coinvolgono ematologiche alterati proprietà biofisiche, quali anemia falciforme, in cui la maggiore rigidità di eritrociti falciformi e aberrante adesione endoteliale dei leucociti e contribuiscono ad ostruzione microvascolare. Un farmaco clinicamente approvato, idrossiurea, migliora i sintomi, ma il suo direct effetto sul flusso microvascolare è sconosciuto. Il saggio prende in considerazione sia la rigidità e l'adesione delle cellule, e dimostra che idrossiurea migliora significativamente il flusso in malattia a cellule falciformi (Figura 2).
Anemia falciforme è solo un esempio di applicazione per la microvascolarizzazione-on-a-chip, in quanto questo sistema è ideale per studiare ematologica qualsiasi processo in cui i globuli interagiscono con ciascuno altre cellule endoteliali e del microcircolo. Altre applicazioni includono clinicamente rilevanti disturbi infiammatori, sepsi / polmone lesioni, microangiopatie trombotiche, la malaria e le metastasi del cancro, mentre altre applicazioni di base includono la biologia dei leucociti e la biologia delle cellule staminali ematopoietiche, tra molti altri.
Figura 1. A) iniziale PDMS dispositivo microfluidico prima endotelializzazione. Qui, il Microdevice viene iniettato with colorante alimentare per illustrare progettazione sizescale e globale del sistema. B) Microscopia a campo chiaro mostra il sistema microfluidico è completamente endothelialized entro 48 ore dalla semina cella utilizzando il protocollo descritto qui.
Figura 2. A) Il microcircolo-on-a-chip con microcanali approssima la dimensione del venule post-capillari (30 micron), il sito della maggior parte degli eventi ostruttivi delle cellule falciformi microvascolari. Sangue intero da pazienti con anemia falciforme che ricevono idrossiurea e da pazienti non trattati con idrossiurea viene fatto fluire attraverso due differenti microcircolo-on-a-chip di dispositivi. B) di sangue intero da pazienti con anemia falciforme che ricevono flussi di idrossiurea con relativa facilità all'interno dei microcanali endothelialized. C) Alle stesse condizioni emodinamiche, sangue intero da pazienti con anemia falciforme che non ricevono idrossiurea, tuttavia, mostra il flusso molto più lento con microchAnnel ostruzione. Il canale inferiore è completamente ostruita con assenza di flusso e le velocità di flusso nei microcanali altri endothelialized sono notevolmente inferiori nella condizione idrossiurea. La barra della scala in tutte e tre le immagini è di 30 micron.
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Discussion
Il nostro sistema Microdevice endothelialized è più adatto se usato in combinazione con gli esperimenti in vivo, e il suo approccio riduzionista può aiutare a chiarire i meccanismi dei processi biofisici ematologiche che si osservano negli esseri umani e modelli animali. Inoltre, il nostro sistema non è senza limiti. Per esempio, i nostri canali microfluidici sono quadrati in sezione trasversale. Anche se tecnicamente microcanali circolari possono essere fabbricate 10,11, abbiamo scelto di utilizzare una procedura di fabbricazione più semplice e standard per permettere ad altri studiosi di applicare facilmente il sistema per il proprio lavoro. Inoltre, la presenza delle cellule endoteliali coltivate naturalmente "arrotonda out" del lume efficace, consentendo al sistema di essere più fisiologico. Inoltre, la modellazione fluidodinamica rivelano che le condizioni di flusso nel nostro sistema sono paragonabili a quella del microcircolo in vivo. Infine, un recente lavoro che caratterizza il flusso di sangue in piazza unod microcanali rettangolari ha dimostrato che tali geometrie sono adatti per esperimenti reologia del sangue 15.
Infine, il test non è destinato a misurare, in isolamento, spiccate proprietà biofisiche cellulari che portano alla occlusione microvascolare. Tecniche quali la microscopia a forza atomica, aspirazione micropipetta e intrappolamento ottico sono stati ben caratterizzati per questi tipi di esperimenti. Invece, il valore del nostro microsistema è la sua capacità di ricapitolare, e simultaneamente all'interno di un unico sistema in vitro, un insieme di processi fisiologici e proprietà biofisiche, comprese l'espressione molecola di adesione, aberranti sangue cellule endoteliali-interazioni cellulari, cellule del sangue aggregazione (trombosi ), deformabilità cellula, dimensione delle celle / forma, geometria microvascolare, e l'emodinamica, il che contribuisce ad patologiche microvascolari interazioni cellulari in differenti stati di malattia.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo T. Hunt, M. Rosenbluth, e il Laboratorio Lam per i loro consigli e le discussioni utili. Noi riconosciamo il sostegno G. Spinner e l'Istituto di Elettronica e Nanotecnologia presso il Georgia Institute of Technology. Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato fornito dal NIH una sovvenzione di K08-HL093360, UCSF premio REAC, uno nanomedicina NIH Award PN2EY018244 Development Center, e il finanziamento del Centro di Biologia delle cellule endoteliali Healthcare dei bambini di Atlanta.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blunt point needle | OK International | 920050-TE | Precision TE needle 20 Gauge x 1/2", pink |
| dextran | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Hole puncher (pin vise) | Technical Innovations | ||
| Human umbilical cord endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| Plasma cleaner | Plasma | PDC-326 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| SU-8 Developer | Microchem | Y020100 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| tubing(larger) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | Tygonreg microbore tubing, 0.020" ID x 0.060" OD |
| tubing(smaller) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD |
References
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