Summary
Nasopharyngeal जुड़े intranasal टीके के लिए चूहों के नाक और प्रणालीगत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए lymphoreticular ऊतकों (NALT) के योगदान की जांच के तरीके का वर्णन कर रहे हैं. हम एक शल्य प्रक्रिया के लिए एक माउस NALT पर निर्भर मॉडल की स्थापना प्रदर्शन और
Protocol
1. NALT संग्रह और संवर्धन
- अनुमोदित IACUC मार्गदर्शन के प्रयोग चूहों Euthanize. से बचें inhalant anesthetics कि NALT को प्रभावित कर सकते हैं के उपयोग. एक सड़न रोकनेवाला कार्यस्थान या जैव सुरक्षा कैबिनेट चूहों स्थानांतरण. माउस के निचले जबड़े निकालें और शराब और आयोडीन पोंछे के साथ ऊपरी तालू क्षेत्र को साफ करें.
- सर्जिकल चाकू संभाल में एक नहीं, 11 सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग करने के लिए ध्यान में कटौती और माउस incisors और दाढ़ दांत के अंदर समोच्च के बाद से उत्पाद ऊपरी तालु.
- धीरे वापस छील संदंश के साथ तालु, तालू नहीं आंसू सावधान किया जा रहा है.
- यह चरण आवश्यक है संस्कृतियों के संक्रमण को कम करने और कई palates के प्रसंस्करण के लिए तैयार है. एक बाँझ 48 अच्छी तरह से थाली पूर्व पूरा संस्कृति के माध्यम के 250 μL साथ भरा के प्रथम स्तंभ में अलग - अलग कुओं में जगह palates के (37 डिग्री सेल्सियस) से मिलकर 1640 RPMI 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल μg, 100 के साथ पूरक यूआई / एमएल पेनिसिलिन, 50 μg / एमएल gentamicinऔर 1 μg / एमएल / fungizone amphotericin. मीडिया बफर अगर palates के 5% सीओ 2/95% नम हवा इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस), या वैकल्पिक रूप से 10 मिमी HEPES 7.4 गैर सीओ 2 संस्कृति के लिए पीएच, उपयोग में संवर्धित कर रहे हैं कार्बोनेट होना चाहिए.
- Palates के धोना, संदंश का उपयोग करने के लिए एक पंक्ति में एक के बाद एक अच्छी तरह से में palates के ले जाने के लिए, ध्यान से washes के बीच प्लेट दोहन, जब तक तालू कुल आठ washes के आया है.
- एक नया बाँझ 48 अच्छी तरह से ताजा, कुओं में पूरी संस्कृति मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) के 250 μL युक्त थाली में palates के हस्तांतरण.
- अध्ययन की अवधि के लिए संवर्धन के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में palates के युक्त प्लेटें प्लेस.
- Aseptically संस्कृति कुओं से Eppendorf ट्यूबों हर 24 घंटे में माध्यम की 100 μL, ताजा 37 डिग्री सेल्सियस संस्कृति के माध्यम के 100 μL के साथ स्थानांतरित जगह विश्लेषण के लिए नमूने ले लीजिए.
- 380 XG में 10 मिनट, गोली मलबे से 4 डिग्री सेल्सियस, के लिए संस्कृति मीडिया नमूने अपकेंद्रित्र.
- Centrifuged नमूना स्थानांतरण से सतह पर तैरनेवाला ताजा Eppendorf -20 डिग्री सेल्सियस पर और ट्यूबों दुकान का विश्लेषण करने के लिए तैयार है जब तक.
- प्रतिजन विशेष आईजीजी, आईजीएम, और IgA, या साइटोकिन्स स्रावित ऊतक संस्कृति supernatants में मानक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays (एलिसा) द्वारा मापा जाता है.
2. NALT की सर्जिकल पृथक
- महिला BALB / ग, चूहों की उम्र 7 से 9 सप्ताह, उपयुक्त विषय हैं, लेकिन अन्य उपभेदों भी स्वीकार्य हैं. तीन दिन की सर्जरी से पहले जेल की तरह गीला भोजन प्रदान करने के लिए भोजन और पानी विकल्प है कि आपरेशन के बाद प्रशासित किया जाएगा के लिए माउस जलवायु के अनुकूल बनाना करने के लिए.
- सर्जरी से पहले मौखिक गुहा में Metacam दर्द निवारक दवा (1.5 मिलीग्राम / एमएल या 0.05 मिलीग्राम / ड्रॉप) की एक बूंद प्रशासन.
- असंवेदनता उत्पन्न करना अनुमोदित IACUC मार्गदर्शन का उपयोग कर, उदाहरण के लिए ketamine, acepromazine, और xylazine मिश्रण (KAX) के साथ चूहों और सुखाने को रोकने के लिए आंखों पर Puralube डॉक्टर मरहम लागू होते हैं. से बचें inhalant anesthetics कि NALT को प्रभावित कर सकते हैं के उपयोग. एकnesthesia पैर की उंगलियों के कोमल बन्द रखो पलटा प्रतिक्रिया के अभाव के द्वारा पुष्टि की जा सकती है.
- कंधे के बीच एक 22-28 गेज सुई और सिरिंज का उपयोग करने के लिए सर्जरी के बाद माउस की संभावित निर्जलीकरण को रोकने के ब्लेड subcutaneously 1 एमएल खारा है (0.9% सोडियम क्लोराइड इंजेक्शन खासियत) प्रशासन. इसके अलावा Respiram की 0.1 एमएल subcutaneously प्रशासन कंधे एक 22-28 गेज सुई और सिरिंज का उपयोग करने के दौरान और सर्जरी के बाद स्वस्थ श्वसन को बढ़ावा देने के ब्लेड के बीच.
- माउस के बाद के सभी जोड़तोड़ के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करते हैं.
- एक लापरवाह स्थिति में anesthetized माउस रखें, और ऊपरी और निचले incisors के आसपास शल्य सीवन के दो अलग - अलग छोरों का उपयोग करने के लिए धीरे खुले मुंह ताक - झाँक करना, ऊपरी तालु को उजागर.
- नंबर 11 सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करने के लिए साइट में NALT के ऊपरी तालु के midline नीचे लंबाई में लगभग 3 मिमी चीरा बनाने के लिए.
- चीरा में एक 0.5 मिमी microcurette डालें और धीरे किनारों के तहत परिमार्जनNALT बाधित.
- चीरा दाग़ना एक थर्मल दाग़ना इकाई पर एक सीधे ठीक पाश के साथ रक्तस्राव को रोकने के लिए.
- थर्मल समर्थन जारी रखें जब माउस को पूर्ण चेतना और गतिविधि के लिए ठीक है.
- खारा subcutaneously तीन बार एक दिन, कंधे ब्लेड के बीच इंजेक्शन के प्रति 1 एमएल, के साथ माउस प्रदान करने के लिए आवश्यक और मौखिक दर्द दवा के रूप में निर्जलीकरण को रोकने के 3 दिन के बाद सर्जरी के लिए एक दिन में एक बार. एक त्वचा तम्बू परीक्षण के प्रदर्शन लिए त्वचा turgor की जांच करने के लिए द्वारा निर्जलीकरण का निर्धारण करते हैं. त्वचा और कंधे ब्लेड के बीच फर समझ इतनी है कि यह tented है. यदि त्वचा जल्दी से स्थिति सामान्य, पिछले करने के लिए देता है, माउस निर्जलित नहीं है. यदि त्वचा ऊंचा रहता है और धीरे धीरे चलता है, माउस निर्जलीकरण के एक राज्य में है और खारा की आवश्यकता है. सर्जरी के बाद कम से कम तीन दिनों के लिए गीला भोजन प्रदान करने के लिए वसूली के लिए पर्याप्त समय की अनुमति है.
- पहले किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए, वजन पर नज़र रखने से 8-10 दिनों के लिए चूहों का निरीक्षण. गरीब वजन वसूलीआमतौर पर अधूरा तालू भरने का संकेत है, और इन चूहों के आगे के अध्ययन से वापस लिया जाना चाहिए.
3. प्रोटोकॉल के लिए NALT तैयारी और NALT सर्जरी की सफलता का आकलन
- NALT सर्जरी की सफलता ऊतक विज्ञान द्वारा पता लगाया जा के रूप में नीचे वर्णित है. सभी प्रयोगात्मक अध्ययन पूरा करने के बाद, को कपाल संग्रह लिए अनुमोदित IACUC मार्गदर्शन का उपयोग euthanizing के द्वारा चूहों तैयार. से बचें inhalant anesthetics कि NALT को प्रभावित कर सकते हैं के उपयोग.
- Euthanized माउस की गर्दन के डब समझ. खोपड़ी के बाकी हिस्सों से दोनों पक्षों पर कैंची के साथ वाहकनलिका प्रक्रियाओं के माध्यम से कतरन से कम जबड़ा निकालें.
- गर्दन के डब में शुरू, खोपड़ी से धीरे छीलने और कपाल की उदर पक्ष की ओर काटने के द्वारा त्वचा और फर को हटा दें.
- ध्यान से नाक क्षेत्र के आसपास त्वचा को हटा दें और पूरी तरह से हटाने के लिए थूथन की टिप की त्वचा कटाव.
- कशेरुकाओं बुद्धि से खोपड़ी को अलग करेंहा कटाव की कैंची.
- रंध्र मैग्नम में कैंची डालें और कपाल नीचे आधे रास्ते midline के साथ नियतन दौरान कोमल ऊतकों में formalin के पारगमन की अनुमति कटौती.
- 10 तटस्थ% में कपाल फिक्स formalin (NBF) कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए बफर.
- को अम्लो व्दारा कैल्सियम, नमूना और अलग कैसेट जगह, हड्डी, स्पर्श चींटी एसिड मिश्रण के साथ बोतल में से Rexyn को रोकने के धुंध में लिपटे. कमरे के तापमान पर 12 घंटे के लिए सेते हैं, तो नल के पानी के नीचे लगातार लगभग 20 मिनट के लिए कुल्ला.
- और एक धार के साथ पट अतीत आंख कक्षाओं के लिए नमूना छाँटो.
- नमूना और कैसेट 10% NBF में लघु अवधि के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- रातोंरात प्रसंस्करण के लिए एक ऊतक प्रोसेसर पर नमूना रखें. यह करने के लिए नमूने से पैराफिन एम्बेडिंग के लिए तैयार करने में पानी को निकालने के लिए किया जाता है.
- संसाधित ऊतक, नीचे थूथन साथ एक तेल ब्लॉक में एम्बेड निकालें, और इसे शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
- आर छाँटोough 15 सुक्ष्ममापी एक स्वचालित सूक्ष्म तक्षणी के साथ ब्लॉक, NALT की अनुमानित स्थान के निकट के पार वर्गों, तो एक 44.3 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कांच स्लाइड पर बढ़ते के लिए 5 माइक्रोन वर्गों में काटने जारी है.
- Hematoxylin और लाल भामसान रंग (एच एंड ई) ऊतक विज्ञान धुंधला लिए NALT पृथक आकलन किया जाना चाहिए.
4. चूहे से जैविक नमूनों का संग्रह
4.1 सीरम
- ध्यान से एक गर्मी दीपक के साथ शरीर के तापमान को ऊपर उठाने के रक्त के प्रवाह में वृद्धि होगी. एक सर्जिकल ब्लेड के साथ पार्श्व पूंछ नस nicking से रक्त ले लीजिए. रक्त आज़ादी एक Microtainer सीरम विभाजक ट्यूब में ड्रिप करने के लिए अनुमति देते हैं.
- निक धुंध या तौलिया के रूप में शोषक सामग्री, के साथ सौम्य दबाव लागू करने के लिए रक्त के प्रवाह को रोकने.
- 30 मिनट के लिए Microtainers में थक्का करने के लिए रक्त की अनुमति दें, तो कम से कम 90 सेकंड के लिए 6-15 x 1000 ग्राम के बीच अपकेंद्रित्र.
- स्थानांतरण Microtainer से एक साफ Eppendorf ट्यूब में सीरम के लिए अलगभंडारण -80 डिग्री सेल्सियस
4.2 लार
- Anesthetized माउस खड़ी पकड़ो, जबकि 20-30 μL बाँझ फॉस्फेट pipetting गाल और गोंद लाइन के बीच बफर खारा (पीबीएस). गाल और गोंद लाइन के बीच विंदुक टिप निर्देशन द्वारा पतला लार लीजिए.
- एक ताजा -20 डिग्री सेल्सियस से कम 2x protease अवरोध करनेवाला और दुकान की 10 μL युक्त ट्यूब पतला लार स्थानांतरण
4.3 नाक स्रावों
- नाक स्रावों संग्रह से पहले माउस Euthanize, मंजूरी दे दी IACUC मार्गदर्शन का उपयोग. से बचें inhalant anesthetics कि NALT को प्रभावित कर सकते हैं के उपयोग.
- माउस खड़ी होल्डिंग, ध्यान से एक नथुने में बाँझ पीबीएस के 30 μL विंदुक और अन्य नथुने से कुल्ला इकट्ठा.
- एक ताजा -20 डिग्री सेल्सियस से कम 2x protease अवरोध करनेवाला और दुकान की 10 μL युक्त ट्यूब के लिए कुल्ला स्थानांतरण
4.4 योनि स्राव
- वें के उद्घाटन में micropipette की नोक डालेंeuthanized माउस ई योनी, योनि बाँझ पीबीएस के 50 μL साथ में कुल्ला और micropipette द्वारा सभी तरल पदार्थ इकट्ठा.
- एक ताजा -20 डिग्री सेल्सियस से कम 2x protease अवरोध करनेवाला और दुकान की 10 μL युक्त ट्यूब के लिए कुल्ला स्थानांतरण
5. प्रतिजन विशेष एंटीबॉडी या साइटोकिन्स एकत्र नमूनों में एलिसा या अन्य मात्रात्मक विधि द्वारा मापा जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 पूर्व vivo विश्लेषण के लिए ऊतक NALT युक्त प्रसंस्करण के साथ शामिल कदम के एक सामान्य योजनाबद्ध प्रदान करता है. चित्रा 2 (ए, बी) में, तालू के आकार दिखाया जाता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पृथक सर्जरी के दौरान चीरा के स्थान पर (ए), के रूप में बिंदीदार रेखा ने संकेत दिया है. NALT का स्थान एक चित्रा 2 में excised तालू hematoxylin दाग (सी), समानांतर ऊतकों दिखा पर खीस क्षेत्र में तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 3NALT विघटन सर्जरी के कदम प्रस्तुत करता है, ऊपरी तालु NALT के लिए उपयोग करने के लिए (ए, बी), (सी) पृथक, और चीरा (डी) के अंतिम दाग़ना का प्रदर्शन दिखा. एक ठेठ और एच ई नाक साइनस सर्जरी से पहले NALT आसपास के क्षेत्र के पार अनुभाग 3E चित्र में दिखाया गया है, जबकि सर्जरी के बाद सीधे microcurette द्वारा NALT विघटन के एक छवि चित्रा 3F में प्रकट होता है. सर्जरी से स्वस्थ हो जाना के लिए पर्याप्त समय की अनुमति, चीरों और बंद किया जाना चाहिए नाक गुहा NALT (चित्र 3 जी) से रहित है.
ठेठ प्रयोगात्मक इन तकनीकों का उपयोग करके परिणाम प्राप्त 4 चित्र में दिखाए जाते हैं, staphylococcal सबयूनिट टीका (STEBVax) के एक अध्ययन से ऊतक संस्कृति supernatants के और जैविक नमूने की तुलना. चूहे intranasal () या intraperitoneal मार्गों (आईपी) द्वारा STEBVax दिलाई गई. टीका एक सहायक है कि टोल की तरह रिसेप्टर 4 3,1 मार्ग सक्रिय के साथ तैयार किया गया था 4, और नियंत्रण खारा केवल टीका या सहायक के बिना दिया गया. सुसंस्कृत प्रयोगात्मक समूहों से प्राप्त NALT एलिसा द्वारा औसत दर्जे का था मध्यम में प्रतिजन विशिष्ट immunoglobulins secreted है. इस उदाहरण में (चित्रा -4 ए), परिणामों से संकेत मिलता है कि IgA की सबसे बड़ी मात्रा में एक सहायक के साथ संयुक्त सबयूनिट टीके के साथ टीका लगाया चूहों से प्राप्त NALT द्वारा जारी किए गए.
जैविक (जैसे सीरम, लार, नाक स्राव, योनि स्राव के रूप में) नियंत्रण या NALT मुक्त चूहों से प्राप्त नमूनों में vivo प्रतिरक्षा नाक प्रतिजनों के जवाब से टिशू कल्चर के परिणाम के साथ तुलना के लिए में प्रोफ़ाइल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 4B चित्र में, टीकाकरण में से IgA और आईजीजी प्रतिक्रियाओं काफी कार्यात्मक NALT के बिना कमी आई है. प्रतिजन विशेष आइजीए के स्तर आम तौर पर mucosal स्राव में टीका चूहों के आईजीजी (लार, नाक washes के) से अधिक थे.
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चित्रा 1 NALT संग्रह और पूर्व vivo संवर्धन के योजनाबद्ध.
चित्रा 2 माउस NALT और चीरा शल्य चिकित्सा की स्थिति का संकेत तालू की विज़ुअलाइज़ेशन. आकार और सर्जरी चीरा के साथ ऊपरी तालु बिंदीदार रेखा से चिह्नित (ए) का स्थान है, ऊपरी तालु (बी) excised या hematoxylin (सी) में दाग तालु की खीस क्षेत्र (तालु के पूर्वकाल पक्ष पर दाग गहरे बैंगनी में समानांतर NALT को देखने ). NALT तीर द्वारा संकेत दिया.
चित्रा 3 सर्जिकल NALT विघटन. NALT विघटन सर्जरी के प्रमुख चरणों: लापरवाह माउस ऊपरी तालू की सर्जरी से पहले दृश्य (ए); midline के ऊपरी तालु पर बना लिए NALT (बी) का उपयोग चीरा, microcurette midline चीरा के माध्यम से डाला में NALT संरचना को बाधित जांच(सी) tegrity, सर्जरी (डी) के समापन पर चीरा के दाग़ना. नाक cavities, सर्जरी (ई) से पहले और एच ई कलंकित के सूक्ष्म चित्र, सर्जरी (एफ) के तुरंत बाद, और सफलतापूर्वक चंगा, माउस NALT मुफ्त (G).
चित्रा 4. वैक्सीन विशेष सुसंस्कृत NALT, लार, नाक और टीका चूहों से एकत्र स्राव से एंटीबॉडी. NALT मुक्त या सामान्य नियंत्रण चूहों में या STEBVax साथ आईपी टीके लगाए गए, और जैविक नमूने एकत्र किए गए थे. तीन प्रतियों नमूनों की एंटीबॉडी स्तर एलिसा का उपयोग कर मापा गया. (ए) NALT चूहों पर नियंत्रण (चालाकी शल्य चिकित्सा नहीं है) से हटा दिया गया है और एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए सभ्य. टीके विशिष्ट संस्कृति में टीका चूहों में आइजीए प्रतिक्रिया के लिए सांख्यिकीय नियंत्रण से अलग था (टी परीक्षण छात्र, पी ≤ 0.01 कोई सहायक या कोई टीका तुलना में). (बी) NALT व्यवधान काफी कम विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओंटीकाकरण में. वहाँ के विशिष्ट एंटीबॉडी के स्तर के बीच महत्वपूर्ण मतभेद थे NALT और NALT लार आईजीजी परिणाम (टी परीक्षण छात्र, 0.05 पी ≤) को छोड़कर सभी तुलना के लिए समूहों (कोई सर्जरी या नियंत्रण सर्जरी).
Discussion
हम एक पशु मॉडल के विकास के लिए सामूहिक तरीके से प्रस्तुत किया है, जैविक नमूने, और NALT जुड़े प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-4 की जांच के लिए assays प्राप्त करने. इन तरीकों के प्रदर्शन के दौरान अतिरिक्त कारकों पर विचार कर रहे हैं. सर्जरी और ऊतक संस्कृति के लिए मानक बाँझ तकनीक का पालन किया जाना चाहिए. जीवाणुरोधी और ऐंटिफंगल एजेंटों के अलगाव और संस्कृति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बनाए रखने के निष्फल उपकरणों, कार्य क्षेत्र, और कीटाणुरहित palates के दौरान प्रयोग किया जाता एक संयोजन संदूषण का जोखिम कम हो जाएगा. लार, नाक washes और समान mucosal स्राव नमूनों रक्त के साथ संभावित संक्रमण के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए, सीरम एंटीबॉडी के रूप में आम तौर पर उच्च सांद्रता में पाया जाता है. इसके अलावा, mucosal स्राव केवल थोड़ा विश्लेषण के लिए पतला हो क्योंकि एंटीबॉडी के कम सांद्रता सीरम करने के लिए तुलना में इन नमूनों में मौजूद हैं.
चूहे सर्जरी के बाद सीधे गर्म किया जाना चाहिए पूर्व करने के लिए रखासंभावित संज्ञाहरण प्रेरित हाइपोथर्मिया वेंट. अपने पक्ष पर वैकल्पिक विश्राम चूहों के बाद सर्जरी के आरोग्यलाभ के दौरान अनियमित श्वसन कम करने के लिए. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया एक साथ काम कर रहे इन कार्यों को पूरा करने के लिए तीन व्यक्तियों के साथ और अधिक कुशल है: सर्जरी प्रदर्शन, एक मुँह खुला रखने में सहायता, और एक शल्य चिकित्सा के बाद देखभाल प्रदान करने के लिए के रूप में चूहों संज्ञाहरण से ठीक हो.
यह सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं या अध्ययन के लिए प्रत्येक माउस के लिए सर्जरी की सफलता की पुष्टि के अंत में कपाल - पार वर्गों की और एच ई धुंधला उपयोग करने के लिए आवश्यक है. पूरा और द्विपक्षीय NALT के पृथक, अपूर्ण पृथक या NALT बरकरार: संभव सर्जरी परिणाम हो सकते हैं. क्योंकि सभी सर्जरी नहीं NALT का पूर्ण हानि, अवशिष्ट या अक्षुण्ण NALT के के साथ जानवरों में परिणाम होगा आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अन्य संभावित परिणाम है कि तालू के लिए पूरी तरह से ठीक करने में विफल रहता है, एक नाक और मौखिक cavities जोड़ने खोलने जा रही है. अधूरातालु के उपचार के कम वजन के लिए और फूलने की विफलता में परिणाम है, और इन व्यक्तियों के अध्ययन से हटा दिया जाना चाहिए.
माउस मॉडल के साथ पहला टीका प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए इच्छित अध्ययन के परिणाम (एंटीबॉडी प्रतिक्रिया, अस्तित्व, आदि) में NALT के लिए एक भूमिका की स्थापना की सेवा करेंगे. शल्य चिकित्सा NALT हटाने नाक योगदान के स्थानीय और प्रणालीगत प्रतिरक्षा करने के लिए दृढ़ संकल्प की सुविधा. यहाँ वर्णित शल्य दृष्टिकोण माउस NALT की रहित मॉडल प्राप्त करने के लिए सबसे प्रत्यक्ष विधि है. माउस मॉडल दस्तक बाहर चयन कमी NALT सूचना दी, लेकिन इन पशुओं को भी साइटोकिन्स या अन्य माध्यमिक lymphoid ऊतकों के विकास के लिए आवश्यक chemokines में कमी कर रहे हैं, और अतिरिक्त दोष 12,13 बंदरगाह हो सकता है. इसके अलावा, यहां वर्णित विधियों नाक passages के भीतर होने वाले प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के कई पहलुओं की जांच करने के लिए विकसित किए गए. हमारे प्रयोगात्मक परिणाम पूरे ऊपरी पलट का उपयोग अध्ययन पर आधारित हैंटिशू कल्चर के लिए माउस से ई, हालांकि यह संभव है कि वर्गों इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, सुसंस्कृत NALT मॉडल प्रयोगों टिशू कल्चर में पूरी तरह से प्रदर्शन के लिए उपयोगी है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
समर्थन Becton डिकिंसन टेक्नोलॉजीज द्वारा प्रदान की गई थी. इस प्रस्तुत करने में व्यक्त विचार लेखकों के हैं और मुराद के लिए अमेरिकी सरकार की सरकारी नीति को प्रतिबिंबित नहीं. अनुसंधान पशु कल्याण अधिनियम और अन्य संघीय विधियों और पशुओं और जानवरों और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग करें, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, 1996 के लिए गाइड में कहा गया है सिद्धांतों का पालन करता है को शामिल प्रयोगों से संबंधित नियमों के साथ अनुपालन में आयोजित किया गया. सुविधा जहां यह अनुसंधान का आयोजन किया गया था और प्रयोगशाला पशु केयर इंटरनेशनल के आकलन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा पूरी तरह से मान्यता प्राप्त है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, No. 11 | Miltex | 4-311 | |
| Knife Handle, No. 3 | Miltex | 4-7 | |
| 48-well Cell Culture Plates | Costar | 3548 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Gibco/Invitrogen | 16000-044 | Final Conc: 10% by volume in culture media |
| Streptomycin Sulfate | Sigma | S9137 | Final Conc: 100 μg/mL |
| Penicillin | Sigma | P7794 | Final Conc: 100 UI/mL |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | Final Conc: 50 μg/mL |
| Fungizone | Gibco/Invitrogen | 15290-018 | Final Conc: 1 μg/mL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | Final Conc: 10 mM |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 022364111 | |
| Nutra-gel Cherry Flavored Mouse Wet Food | Bio-Serve | S4798-TRAY | |
| Metacam | Boehringer Ingelheim | 601531000 | One drop of 1.5 mg/mL Oral Suspension |
| Ketamine | Pfizer | 00856440301 | Final Conc: 6.06 mg/mL |
| Acepromazine | Vedco | VEDC207 | Final Conc: 0.061 mg/mL |
| Xylazine | Lloyd | 4811 | Final Conc: 0.667 mg/mL |
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | 1621 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP | Baxter | 2B1302 | |
| 0.5 mm Microcurette | Roboz | RS-6350 | |
| Thermal Cautery Unit | Geiger | 150-S/150A-S | |
| TCU Replacement Tip, Straight Fine Loop | Geiger | 214 | |
| Surgical Scissors | |||
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma | HT501128 | |
| Formic Acid | Fisher | A119P-4 | Mix 426 mL formic acid into 1047 mL tap water, then add 45 mL Rexyn 101 (H) |
| Rexyn 101 (H) | Fisher | R231-500 | |
| Tissue-Tek VIP E150/E300 | Sakura | ||
| Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Mayer's Hematoxylin | Sigma | MHS16-500ML | |
| Gill No.1 Hematoxylin | Sigma | GHS116 | |
| Eosin B | Sigma | 2853 | |
| Microtainer Serum Separator | BD Medical | 365956 | |
| Phosphate Buffered Saline | 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, pH 7.4 | ||
| Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free | Thermo Scientific | 78415 |
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