Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic

doi: 10.3791/3961 Published: May 28, 2012

Summary

وذكرت ونحن في الآونة الأخيرة نهجا جديدا لتوليد تحقيقات DNAzyme fluorogenic التي يمكن تطبيقها لاقامة بسيطة، "مزيج والقراءة" فلوري فحص للكشف عن البكتيريا. هذه التحقيقات DNA خاص تحفيز الانقسام من الحمض النووي الريبي الركيزة حامل اللون معدلة وخيالية في وجود مزيج النفط الخام خارج الخلية (CEM) التي تنتجها بكتيريا معينة، وترجمة وبالتالي اكتشاف بكتيريا في توليد إشارة مضان. في هذا التقرير سنقوم بشرح الإجراءات التجريبية الرئيسية التي يعمل تحقيقا DNAzyme محددة تدل على "تكتل القوى الديمقراطية، EC1" للكشف عن نموذج للبكتيريا،

Protocol

1. إعداد المحاليل الكيميائية

  1. 0.5 متر الاثيلين diaminetetraacetic حامض (EDTA): في 2 لتر (L) كوب من البلاستيك، وتزن 186.1 غرام EDTA (EM العلوم) وإضافة 800 ملليلتر (مل) من الماء المقطر منزوع الأيونات، مشبع (DDH 2 O). ضبط درجة الحموضة إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الكريات (EM العلوم). جعل الحجم النهائي ل1 لتر باستخدام DDH 2 O. نقل حل لقوارير الزجاج، الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
  2. 10 × تريس بورات-EDTA حل (10 × TBE؛ تريس 89 ملم و 89 ملم حمض البوريك، 2 مم EDTA، ودرجة الحموضة 7.5): زن 432 غرام من تريس قاعدة (BioShop كندا) و 220 غرام من حمض البوريك (BioShop كندا) وإضافة إلى كل كوب من البلاستيك 4 لتر. قياس 80 مل من EDTA M 0.5 (درجة الحموضة 8.0)، ويضاف إلى الدورق. إضافة DDH 2 O إلى وحدة تخزين النهائي من 4 ل. مزيج دقيق الحل مع شريط مغناطيسي حتى تذوب تماما المكونات. نقل حل لقوارير الزجاج، الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
  3. 10٪ تبديل طبيعة polyacrylamiدي هلام الأوراق المالية: لكوب من البلاستيك 4 لتر، إضافة 1681.7 غرام من اليوريا (BioShop كندا)، 400 مل من 10 × TBE، 1 لتر من 40٪ حل (29:1) الأكريلاميد / bisacrylamide (BioShop كندا). ضبط مستوى الصوت إلى 4 لتر ​​مع DDH 2 O. حل اليوريا مع التحريك. نقل الحل إلى 1 لتر الزجاجات الزجاج العنبر وتخزين عند 4 درجات مئوية (وينبغي التعامل مع Caution! الأكريلاميد مع وقفازات نظارات واقية وقناع ومعطف المختبر لأنه عصبي قبل البلمرة).
  4. 2 تحميل الجل × العازلة (2 × GLB): لكوب زجاج مل 200، إضافة 44 غرام من اليوريا و 8 غرام من السكروز (BioShop كندا)، و 10 ملغ من اللون الأزرق برموفينول (BioShop كندا)، و 10 ملغ من FF xylenecyanol (سيجما الدريخ)، و 400 ميكرولتر من 10٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS؛ BioShop كندا)، و 4 مل من TBE × 10. ضبط مستوى الصوت النهائي الى 40 مل مع DDH 2 O وحل المواد الصلبة مع التدفئة معتدل (50 درجة مئوية) واثارة مع شريط مغناطيسي. نقل قسامة 1 ملم في 1.5 مل من أنابيب microcentrifuge ومخزن في 4 درجات مئوية. استنادا لديناالخبرة، فمن الضروري أن حرارة 2 × GLB لفترة وجيزة في 90 درجة مئوية قبل استخدامها لأن 2 × GLB يتصلب تحت ظروف التخزين.
  5. 1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة): زن 12.1 غرام من تريس القاعدة في كوب زجاج مل 200. إضافة 60 مل من DDH 2 O وتذوب المواد الصلبة عن طريق اثارة مع محرك مغناطيسي. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك (سيغما الدريخ). وتشكل وحدة التخزين إلى 100 ​​مل مع DDH 2 O، ونقل إلى زجاجة والتعقيم. تخزن في درجة مئوية 4
  6. 5 M كلوريد الصوديوم: في كوب زجاج تزن 58.4 غرام من كلوريد الصوديوم (BioShop كندا)، وتذوب مع 150 مل من DDH 2 O. ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DDH 2 O. نقل حل لتعقيم الزجاج، وزجاجة، ومخزن في درجة مئوية 4
  7. الحمض النووي العازلة شطف: في كوب من الزجاج، خلط 2 مل من 1 M-تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، و 8 مل من كلوريد الصوديوم M 5 و 0.4 مل من EDTA M 0.5 (درجة الحموضة 8.0). ضبط مستوى الصوت إلى 200 مل مع DDH 2 O. الأوتوكلاف ومخزن في درجة مئوية 4
  8. 2 × رد فعل العازلة (2 × RB؛ HEPES 100 ملم، 300 ملم كلوريد الصوديوم، 30 ملم MgCl 2): لأنبوب 50 مل الصقر دينار بحريني (فالكون)، إضافة 1.2 غرام من HEPES (BioShop كندا)، 0،88 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.30 غرام من MgCl 2 • 6H 2 O (المواد الكيميائية EMD) و 30 مل من DDH 2 O. مزيج من اهتزاز أقل ما يقال حتى تذوب تماما المكونات. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5 باضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم 10 N وتعديل حجم النهائي الى 50 مل مع DDH 2 O. تنقية حل باستخدام وحدة حقنة يحركها فلتر (0.22 ميكرون، ميليبور) ومخزن في C. رقم 4
  9. لوريا Bertani (LB) حساء: في كوب، وتزن 20.0 غرام من مسحوق LB (سيغما الدريخ)، يليه إضافة 1 لتر من DDH 2 O. تماما خلط الحل مع شريط مغناطيسي، ونقل إلى حل دورق مخروطي. الأوتوكلاف الحل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  10. 1.5٪ أجار LB: زن 1.5 غرام من أجار (BioShop كندا) في قارورة سعة 250 مل و 100 مل إضافة LB السائل. الأوتوكلاف الخليط ومخزن في درجة حرارة الغرفة.
  11. تصفيح أجار: ميلر أجار LB في الميكروويف وبارد الحل لجيم ~ ° 50 صب الحل في أطباق بتري (فيشر العلمية) تحت لهب. في تجربتنا، ويمكن 100 مل من آجار LB تسفر 5-6 لوحات.

2. وساطة بناء تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة قالب ربط الأنزيمية

تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (الشكل 2A) هو DNAzyme مميزة. وهي تتألف من EC1 تسلسل الحافز والركيزة FS1 تسلسل (المشار إليها بواسطة خطوط سوداء وخضراء في الشكل 2A). RFSS1 (الشكل 2A) هو نسخة تدافعت من تكتل القوى الديمقراطية، حيث يتم EC1 جزئيا EC1 تسلسل الحفاز تعديلا في SS1 لكن الجزء FS1 لم يتغير. وأدلى تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة قالب بوساطة ربط الأنزيمية للFS1 قليل النوكليوتيد مع EC1 قليل النوكليوتيد أو SS1 في حضور LT1 كقالب ربط (أنظر المربع إدراجها في الشكل 2A). يتم توفير هذا الإجراء لإجراء عملية ربط رد فعل أدناه.تم الحصول على FS1 من المرافق كيك التجميعي أليغو في جامعة ييل، وتنقيته بواسطة deprotected الكهربائي للهلام بعد بروتوكول المحددة سابقا. تم شراؤها 17-24 EC1، SS1 وLT1 من تقنيات الحمض النووي المتكاملة وتنقيته بواسطة الكهربائي للهلام.

  1. تعد الأوراق المالية 100 ميكرومتر حل FS1، SS1، EC1 وLT1 باستخدام DDH 2 O. تخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها.
  2. نقل 5 ميكرولتر من محلول المخزون FS1 لاثنين من 1،5 أنابيب microcentrifuge ميكرولتر وضعت الأنبوبة (1) وأنبوب 2. إلى كل أنبوب، إضافة 38.5 ميكرولتر من DDH 2 O ثم 5 ميكرولتر من 10 × T4 كيناز عديد النوكليوتيد (PNK) العازلة رد فعل (MBI Fermentas)، والذي يحتوي على 500 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.6 أس هيدروجيني و 25 درجة مئوية)، 100 مم MgCl 50 ملي DTT، 1.0 ملم سبيرمدين. خلط كل حل من قبل pipetting (ماصة الحل صعودا وهبوطا عدة مرات).
  3. إضافة 1 ميكرولتر من بطولة (100 مم؛ Fermentas MBI)، ومزيج من قبل pipetting.
  4. إضافة 0،5 ميكرولتر من كيناز عديد النوكليوتيد T4 (Pناغورني كاراباخ، و 10 وحدة / ميكرولتر؛ Fermentas MBI)، ومزيج من قبل pipetting. احتضان ومخاليط رد فعل على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تأكد لتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لتقليل photobleaching من fluorophore.
  5. إخماد رد فعل عن طريق التسخين في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبريد مخاليط رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من EC1 وSS1 حل الأوراق المالية إلى أنبوب (1) والأنبوبة 2 على التوالي.
  7. إضافة 5 ميكرولتر من محلول المخزون LT1 إلى كل المزيج، بواسطة أنبوب pipetting. تسخين خليط التفاعل في 90 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وتبرد لدرجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  8. إضافة 118 ميكرولتر من DDH 2 O ثم 20 ميكرولتر من 10 × T4 العازلة يغاز الحمض النووي (MBI Fermentas)، الذي يحتوي على 400 ملم تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.8 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية)، 100 مم MgCl 100 DTT ملم، و 5 ملي للاعبي التنس المحترفين. خلط الحل بواسطة pipetting.
  9. إضافة 2 ميكرولتر من الحمض النووي يغاز T4 (5 وحدات / ميكرولتر؛ Fermentas MBI)، ومزيج من قبل pipetting. احتضان ومخاليط رد فعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  10. إضافة 20 ميكرولتر من NaOAc م 3 (درجة الحموضة 7.0) إلى كل دوامة، وتدور أنبوب أسفل. إضافة 500 ميكرولتر من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ لكل أنبوب، خلط الحل بواسطة vortexing ووضع أنابيب في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. أجهزة الطرد المركزي في مخاليط في 11000 جم لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة (أليجرا X22-R، بيكمان كولتر) وإزالة بعناية وطاف بواسطة pipetting.
  12. تجفيف بيليه الحمض النووي باستخدام مكثف الحمض النووي (DNA سافانت Speedvac، الحرارية العلمية) لمدة 10 دقيقة.
  13. الكريات Resuspend الحمض النووي في 30 ميكرولتر من 1 × هلام العازلة تحميل (GLB)، لفترة وجيزة دوامة وتدور باستمرار مع جهاز للطرد المركزي الفوق (Minicentrifuge، VWR العلمي). على عينات من الحمض النووي ligated على استعداد لتحميلها على مادة هلامية dPAGE 10٪.

3. إعداد جيل dPAGE 10٪

تصف الخطوات التالية لفترة وجيزة من الجهاز الكهربائي للهلام ولها مجموعة من القاعدة. لمزيد من التفاصيل حول هذا الضبط، والتعامل مع الجهاز، يرجى الرجوع رس بروتوكولات لدينا المنشورة سابقا. 30،31

  1. غسل وتجفيف ألواح الزجاج اثنين، واثنين من الفواصل 0،75 ملم ومشط 16-جيدا. جمع لوحات الزجاج والفواصل مع لقطات ووضع أفقي على سطح مستو مع لوحة زجاج حقق مواجهة.
  2. نقل 40 مل من مزيج dPAGE 10٪ إلى كأس ML 150. اضافة 40 ميكرولتر من tetramethylethylenediamine (TEMED؛ Bioshop كندا)، و 400 ميكرولتر من APS 10٪، ومزيج من دوامات مع pipettor.
  3. صب الخليط بعناية بين لوحات وتضاف فورا المشط. يسمح هذا المزيج على تتبلمر لمدة 10 إلى 20 دقيقة. ويمكن التأكد من البلمرة عن طريق التحقق من مزيج هلام المتبقية في الكأس.
  4. بلمرة مرة واحدة، وإزالة المشط بلطف وشطف الآبار مع DDH 2 O لإزالة المتبقي حل هلام في الآبار.
  5. تركيب لوحات على الجل جهاز الكهربائي مع لوحة مستطيلة unnotched التي تواجه بها ووضع لوحة معدنية وراء لوحة حقق. استخدام PL المعدنأكل يساعد على منع ارتفاع درجة الحرارة التي يمكن أن كسر ألواح الزجاج.
  6. إضافة 1 TBE × إلى غرف العلوي والسفلي من الجهاز. تحقق للتأكد من أن يتم ملء الآبار مع العازلة ومغمورة الحافة السفلى من هلام في المنطقة العازلة.
  7. تنطبق على درجة الماجستير 40 (أو 750 فولت) الحالية والسابقة للتشغيل لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

4. تنقية Ligated EC1-RFD و RFSS1 بواسطة هلام dPAGE 10٪

  1. بعد خطوة من 3.7، شطف الآبار مع 1 TBE × باستخدام محقنة وإبرة.
  2. تحميل خليط من ربط تكتل القوى الديمقراطية، وذلك من EC1 RFSS1 (من 2.13) إلى 2 الآبار (واحد لكل) باستخدام pipettor ونصائح التحميل هلام (Diamed). تنطبق على درجة الماجستير 40 (750 فولت) الحالي حتى صبغ أسفل (برموفينول الأزرق) ما يقرب من 5 سم فوق الحافة السفلى من لوحات.
  3. إزالة ألواح الزجاج من الجل جهاز تشغيل، الاستلقاء على مقعد رأس مسطح وإزالة بعناية الفواصل.
  4. إزالة بعناية لوحات من الزجاج أعلى من الجل والتفاف جل مع اللفائف البلاستيكية (في محاولة لتجنب التجاعيد وقابلة للطي ليلتف على الجل).
  5. لا يمكن للمنتجات ligated تصور إما عن طريق تلقي بظلالها على الأشعة فوق البنفسجية (260 نانومتر) أو عن طريق تضوء (360 نانومتر)، والتي سوف تنتج فرقة الحمض النووي مرئية بضعة سنتيمترات فوق EC1 أو SS1 (100 بمول من EC1 أو SS1 يمكن استخدامه كعلامة و تحميلها في بئر في خطوة من 4.2). بمناسبة عصابات الحمض النووي المطلوب مع علامة.
  6. المكوس الفرقة الحمض النووي مع شفرات الحلاقة معقمة، وقطع هلام الى قطع صغيرة ونقل الى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
  7. سحق القطع هلام داخل أنبوب microcentrifuge باستخدام طرف ماصة معقمة (200 حجم رأس ميكرولتر).
  8. إضافة 500 شطف الحمض النووي ميكرولتر العازلة إلى كل أنبوب وغطاء لهم مع رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من ضوء. دوامة العينات لمدة 10 دقيقة.
  9. منبذة العينات في 11000 ز لمدة 4 دقائق في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة (أليجرا X22-R، بيكمان كولتر) ونقل بدقة 350 ميكرولتر من لياليupernatant لالطازجة 1.5 أنبوب microcentrifuge مل (إذا لزم الأمر، يمكن ان يتم شطف المركز الثاني برصيد 350 ميكرولتر من العازلة شطف جديد للحصول على آخر 10 دقيقة).
  10. إضافة 35 ميكرولتر (0.1 × من حجم العينة) من 3 خلات الصوديوم M (NaOAc، ودرجة الحموضة 7.0) إلى كل أنبوب، مزيج من قبل vortexing، وتدور باستمرار. إضافة 900 UL من البرد الإيثانول بنسبة 100٪ على كل أنبوب. خلط كل عينة بواسطة المصافحة الأنبوب لبضع ثوان. وضع الأنابيب عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 س.
  11. منبذة العينات في 11000 جم لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة وإزالة بعناية وطاف بواسطة pipetting.
  12. أضف 100 ميكروليتر من البرد الايثانول 70٪ واستخدامه لشطف بلطف الجدار كله الداخلي للأنبوب. إعادة الطرد المركزي في 11000 ز لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف وتجفيف بيليه باستخدام الحمض النووي المكثف لمدة 10 دقيقة.
  13. حل الكريات الحمض النووي في 100 ميليلتر من DDH 2 O ودوامة. تحديد تركيز الحمض النووي بناء على امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 260 نانومتر. عينات من متجر في -20درجة مئوية حتى استخدامها.

5. إعداد البكتيريا

  1. الهدف السلالة البكتيرية E. ومطلي أولا القولونية K12 (ال MG1655) والسلالات ذات الصلة سيطرة على لوحات أجار LB من أسهم الجلسرين. تحت لهب أو داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، وتلمس الأوراق المالية الجلسرين البكتيرية مع طرف ماصة معقمة وخط بلطف على سطح لوحة لتجنب إتلاف أجار LB.
  2. عكس لوحات يشوبه واحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة. بعد الحضانة، وختم محيط كامل من لوحات مع Parafilm (بيشيني بلاستيك التغليف) ومخزن في درجة مئوية 4 ويمكن تخزين هذه اللوحات لمدة أقصاها 4 أسابيع.

6. إعداد خلطات الخام خارج الخلية (CEMS)

  1. الاستغناء 2 مل من LB إلى 14 أنابيب معقمة ثقافة مل دينار بحريني (فالكون) باستخدام بندقية ماصة (كورنينج).
  2. باستخدام طرف ماصة معقمة، واختيار مستعمرة واحدة من لوحة أجار أعد في خطوة من 5.2 وأدخله في ميلانulture أنبوب. أنابيب مكان في حاضنة (نيو برونزويك العلمي) وضعت في 37 درجة مئوية، ويهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة.
  3. 1٪ إعادة تلقيح ثقافة: الاستغناء عن 2 مل من LB الطازجة إلى 14 مل من أنابيب ثقافة ومسمار مع 20 ميكرولتر من الثقافات البكتيرية أعدت في الخطوة 6.2. احتضان هذه الأنابيب في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة حتى حل كل البكتيرية يصل إلى OD 600 (قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر) من حوالي 1. لقياس OD 600، نقل 1 مل من كل ثقافة إلى كوفيت القابل للتصرف وتدبير الامتصاصية في 600 نانومتر مع الطيف للأشعة فوق البنفسجية (UV جينيسيس 10، الحرارية العلمية).
  4. نقل 1 مل من كل ثقافة إلى جديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 11000 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل وطاف واضحة الى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية إذا لم يتم استخدامها على الفور.

7. الكشف عن استخدام الطيف الإسفار

  1. تشغيل معمل مضان (كاري الكسوف، فاريان المؤتمر الوطني العراقي)، وإعداد المعلمات للحصول على البيانات مع الإثارة في 488 نانومتر، والانبعاثات عند 520 نانومتر. يمكن أن تؤخذ القراءات كل دقيقة لمدة 1 ساعة.
  2. غسل 3 cuvettes الكريستال الكوارتز (فاريان كاري) مع DDH 2 O، تليها الإيثانول بنسبة 100٪. تجفيف cuvettes التي تومض غاز النيتروجين. التسمية cuvettes C1 (مراقبة 1)، C2 (مراقبة 2) و T (اختبار).
  3. نقل 24 ميكرولتر من DDH 2 O إلى C1 و 24 ميكرولتر من CEM-EC إلى C2 و T. إضافة 25 ميكرولتر من 2 × RB إلى كل كفيت ووضعها في الطيف مضان. البدء في جمع البيانات مضان ل5 دقائق الأولى.
  4. إضافة 1 ميكرولتر من RFSS1 (من التوصل إلى حل ميكرومتر الأسهم 5) إلى C2 و 1 ميكرولتر من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (من التوصل إلى حل ميكرومتر الأسهم 5) إلى T و C1. خلط كل حل من قبل pipetting. يجب أن يكون هذا شرع بعناية بحيث لا تنقطع القراءات مضان. السماح للتفاعل أن تستمر لبقية الوقت 1 اكتساب ح.
  5. حفظالبيانات في شكل ملف إكسل، ونقل البيانات إلى جهاز كمبيوتر شخصي وبيانات عملية لخلق صورة بيانية.

8. الكشف عن طريق الكهربائي للهلام

يمكن استخدام خليط رد الفعل نفسه على استعداد في الخطوة 7.4 لتحليلها من قبل الكهربائي للهلام، ويمكن أن تكون مستعدة ردود الفعل بدلا من جديد على نحو مماثل، وحضنت في 1.5 مل من أنابيب microcentrifuge. في كلتا الحالتين:

  1. إخماد ردود فعل (بعد 1 ح) من خلال إضافة 5 ميكرولتر من NaOAc م 3 و 125 ميليلتر من الإيثانول بنسبة 100٪. خلط كل حل من قبل vortexing ووضع أنابيب في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  2. منبذة الخلطات رد فعل على 11000 جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وإزالة بعناية طاف بواسطة pipetting.
  3. تجفيف حبيبات باستخدام الحمض النووي المكثف لمدة 10 دقيقة.
  4. Resuspend الكريات في 20 ميكرولتر من 1 × GLB بواسطة vortexing لفترة وجيزة. تدور أسفل أنابيب لفترة وجيزة جدا مع جهاز للطرد المركزي الفوق (Minicentrifuge، VWR العلمي). تتم قراءة هذه العيناتذ لتحميل إلى هلام dPAGE.
  5. إعداد هلام dPAGE 10٪ كما هو موضح في 3،1-3،7. تحميل عينات من رد فعل (من الخطوة 8.4) في الآبار باستخدام pipettor ونصائح التحميل هلام (Diamed). تنطبق على درجة الماجستير 40 (750 فولت) الحالي حتى صبغ أسفل (برموفينول الأزرق) ما يقرب من 5 سم فوق الحافة السفلى من لوحات.
  6. إزالة ألواح الزجاج، ويغسل جيدا مع ماء الصنبور لإزالة أي قطع هلام. مسح لوحات مع kimwipe (كيمبرلي كلارك الفنية).
  7. تفحص لوحة هلام لمضان باستخدام ماسح ضوئي اعصار (تايفون 9200، وضع المتغير، وجنرال الكتريك للرعاية الصحية). تحليل البيانات باستخدام برنامج ImageQuant (حيوية الجزيئية).

9. الكشف عن خصوصية

  1. لاختبار نوعية البكتيرية، وصفت نفس الإجراءات المذكورة أعلاه لزراعة E. كولاي، ويمكن أن يؤديها CEM إعداد وإجراء فحص رد فعل الانقسام لعدد من سلالات بكتيرية مختلفة مثل ب. الرقيقة، P. بيلي، Y. ruckeri، L. Planturum، P. acidilactici (كما هو موضح في الشكل 3A).

10. وحيد الخلية كشفها

إعداد 1 مل E. كولاي الأسهم الجلسرين من 2 كفو / مل (CFU: مستعمرة لتشكيل وحدة) من خلال تخفيف مسلسل وتأكيد CFU تركيز من قبل طلي 5 هذا المخزون يجب أن يحتوي على 0،2 CFU/100 ميكرولتر. متجر في -80 درجة مئوية حتى استخدامها.

  1. تحضير أنابيب ثقافة 10 التي تحتوي على 2 مل من LB.
  2. تطعيم كل ثقافة مع 100 ميكرولتر من 2 الأسهم الجلسرين كفو / مل واحتضانها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة. يجب استخدام الأوراق المالية الجلسرين كامل (1 مل) 10 تسفر الثقافات.
  3. حصاد 300 ميكرولتر من كل أنبوب ثقافة تلقيح عند نقاط الزمني التالي: 4 و 8 و 12 و 16 و 24 ساعة. مغادرة ثقافة المتبقية لتنمو لمدة 24 ساعة.
  4. قياس التطوير التنظيمي 600 و يعجل الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 11000 ز لمدة 5 دقائق.
  5. نقل إلى CEMS الطازجة 1.5 أنابيب microcentrifuge مل ومخزن في -20 و دعلى سبيل المثال، C حتى الاستخدام.
    ملاحظة: بما أنه قد لا يكون التطوير التنظيمي للكشف عن 600 عينات تحصد في الوقت 4 نقاط و 8 و 12، والسماح للثقافة المتبقية لتنمو لمدة 24 ساعة من أجل تحديد الثقافات التي تحتوي على البكتيريا (التي يحددها قياس العكارة والتطوير التنظيمي). ربما واحد فقط أو اثنين من الثقافات تحتوي على 10 E. وسوف القولونية بعد التلقيح وأنابيب المتبقية لا يحتوي على أية خلايا.
  6. استخدام CEMS تعافى من الثقافات الايجابية (المخزنة في درجة مئوية -20) في timepoints المعينة إلى إعداد ردود الفعل انقسام مع EC1-RFD، ومن ثم تحليل مخاليط رد فعل باستخدام dPAGE هلام إستشراد على النحو المبين في المادة 8.

11. مفهوم والممثل النتائج

ويتضح مفهوم استغلال 1 DNAzyme فلوري الرنا الشق (تكتل القوى الديمقراطية) للكشف عن البكتيريا في الشكل. 1. وتكتل القوى الديمقراطية يشق الحمض النووي خيالية / ركيزة الحمض النووي الريبي في وجود صلة RNA وحيد (الأزرق R) يحيط بها اثنان النيوكليوتيدات المسمىمع fluorophore (F) وفاكهه تقضي على (س) على التوالي. كما بكتيريا من الفائدة (مثل كولاي) ينمو في وسائل الاعلام، وسوف تترك وراءها خليط الخام خارج الخلية (CEM). ثم يتم استخدام هذا CEM ككل في في تجربة اختيار المختبر للحصول على تكتل القوى الديمقراطية وقادرة على الاستجابة على وجه التحديد إلى CEM، يفترض أن تكتل القوى الديمقراطية يتفاعل مع جزيء معين (النجم الأرجواني) في CEM الذي هو جزيء التوقيع على البكتيريا. عندما يتم إضافة CEM إلى محلول التفاعل التي تحتوي على تكتل القوى الديمقراطية، فإنه سوف يثير النشاط الرنا الشق من تكتل القوى الديمقراطية. حالة الانقسام يفصل F من س، مما أدى إلى إشارة فلوري الذي يمكن اكتشافه إما باستخدام مقياس التألق أو هلام إستشراد.

وقد تم التحقق من صحة التجريبية للمفهوم أعلاه مع CEM من E. كولاي (CEM-EC). حصلنا على 3 جزيئات تكتل القوى الديمقراطية عن طريق اختيار في المختبر، وعين واحدة أكثر كفاءة وتكتل القوى الديمقراطية، EC1 (الشكل 2A). 5 واطه اختبار النشاط انشقاق من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (جنبا إلى جنب مع سلسلة المسخ المسمى RFSS1) استجابة لCEM-EC. وأعدت كل من تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة ربط الأنزيمية للأجزاء DNAzyme إلى الركيزة FS1 (ترد جميع متواليات في الشكل 2A). في التجربة قياس مضان (الشكل 2B)، وقد حضنت CEM-EC حده لمدة 5 دقائق، تليها إضافة تكتل القوى الديمقراطية، أو EC1 RFSS1، وكذلك حضانة لمدة 55 دقيقة أكثر. وكثافة مضان من الحل قراءة بشكل مستمر في كل دقيقة، وكان يستخدم البيانات لحساب مضان النسبية (RF، محسوبة على أساس نسبة من كثافة مضان في الزمن t مقابل كثافة مضان في وقت 0). يتم رسم القيم مقابل RF وقت حضانة كما الشكل. 2B. وحيث تبين ان تكتل القوى الديمقراطية، EC1 المنتجة على مستوى عال من إشارة مضان على إضافة CEM-EC، في تناقض صارخ، RFSS1 لم تنتج إشارة قوية مضان. وهكذا، فإن فو مضان المنتجة للnction من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 على الاتصال CEM-EC هو تسلسل محدد.

قمنا بتحليل من أجل التحقق من أن الزيادات الملحوظة مضان هي نتيجة لانشقاق الربط الجيش الملكي النيبالي، والخلائط رد فعل من قبل dPAGE. ومن المتوقع أن الانقسام من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 لتوليد شظايا من الحمض النووي اثنين، "الإبقاء على جزء fluorophore و 3" على بعد 5 قطعة فاكهه تقضي على الاحتفاظ. uncleaved فقط تكتل القوى الديمقراطية، EC1 (unclv)، ويمكن أن يتم الكشف عن جزء من 5 '(CLV) عن طريق التصوير مضان. نتيجة dPAGE هو مبين في الشكل. 2C يكشف عن أن خليط التفاعل من تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 CEM EC-تنتج في الواقع نتاج الانقسام المتوقعة، في حين أن مزيج RFSS1/CEM-EC لم يفعل ذلك.

تم فحص خصوصية تكتل القوى الديمقراطية، EC1 باستخدام CEMS التي تم جمعها من عدد آخر من الجراثيم سلبية وإيجابية غرام وتظهر البيانات في الشكل. 3A. تنتج سوى عينة تحتوي على CEM-EC (الأزرق منحنى) زيادة في مضان. عدم وجود التفاعل المتبادل مع CEMSمن بكتيريا أخرى تشير إلى أن تكتل القوى الديمقراطية، EC1 هو انتقائي للغاية لE. القولونية.

فحصنا أيضا الوقت اللازم للزراعة 1 هاء واحدة خلية بكتيريا من أجل إنتاج ما يكفي من CEM التي يمكن أن تحفز انقسام من تكتل القوى الديمقراطية، EC1. لهذه التجربة، وهاء عينة تحتوي على بكتيريا تعرف CFU (مستعمرة لتشكيل وحدة) ويخفف على نحو كاف لتحقيق تركيز من 1 كفو / مل. وأعقب هذا عن طريق خلط 100 ميكروليتر من عينة جرثومية المخفف مع وسائل الاعلام النمو وزراعة لمدة 4، 8، 16، 12 و 24 ساعة. ثم جمعت CEMS لكل timepoint واختبارها لحفز النشاط انشقاق من تكتل القوى الديمقراطية، EC1. نتيجة dPAGE هو مبين في الشكل. 3B يشير إلى أن هناك حاجة إلى وقت زراعة من 12 ساعة.

من المهم أن نلاحظ أن الزيادة الأولي إشارة صغيرة لوحظ في قياسات مضان بعد إضافة RFSS1 تسلسل (كعنصر تحكم سلبي) لCEM-EC (الشكل 2B، أحمر المنحنياتويعزى كل منحنيات باستثناء الأزرق) إلى مضان لا يتجزأ من وحدة FRQ (نظرا لعدم اكتمال التبريد بواسطة F س)، ه) أو تكتل القوى الديمقراطية، EC1 إلى CEMS البكتيرية الأخرى (الشكل 3B. وبالتالي، فإنه من المتوقع أن إضافة F-وتسلسل Q-المسمى ستنتج زيادة أولية مضان. ومع ذلك، والخلائط فقط RFD-EC1/CEM-EC هي قادرة على انتاج على مستوى عال من التألق مع مرور الوقت.

الشكل 1
الشكل 1. توضيح تخطيطي لالرنا الشق فلوري مسبار (تكتل القوى الديمقراطية) DNAzyme أن fluoresces على اتصال مع خليط من النفط الخام خارج الخلية (CEM) التي تنتجها الخلايا البكتيرية محددة من الفائدة. وتكتل القوى الديمقراطية يشق الحمض النووي خيالية / ركيزة الحمض النووي الريبي في وجود صلة RNA وحيد (الأزرق R) يحيط بها اثنان وصفت النيوكليوتيدات مع fluorophore (F) وفاكهه تقضي على (س) على التوالي. قبل رد فعل الانقسام، ومستوى مضان من تكتل القوى الديمقراطية هو الحد الأدنى الواجب لبالوكاله وثيقimity من واو وفاء وبعد انشقاق، س ينحرف عن F، ونتيجة، ويتم إنتاج إشارة قوية مضان.

الشكل 2
الشكل 2، وهاء كولاي الاستشعار تكتل القوى الديمقراطية. (A)-RFD EC1 هو تحقيق DNAzyme التي يمكن تفعيلها من خلال CEM-EC. RFSS1 هو تسلسل تدافعت من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 يستخدم كعنصر تحكم. وأنتجت تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 بواسطة ligating FS1 مع EC1 وSS1، على التوالي، في ظل وجود LT1 كقالب. F: فلوريسئين المعدلة ديوكسي تيميدين. س: Dabcyl المعدلة ديوكسي تيميدين. R: ريبونوكليوتيد الأدنين. (ب) الإسفار يشير لمحات من تكتل القوى الديمقراطية، وEC1 RFSS1 في وجود CEM الجماعة الأوروبية. (ج) تحليل dPAGE من خلائط رد فعل انشقاق في B (وقت رد فعل: 60 دقيقة). في الصورة هي صورة مضان من هلام dPAGE التي تم الحصول عليها بواسطة الماسح الضوئي مع الاعصار. حارة NC: تكتل القوى الديمقراطية، أو EC1 RFSS1 في المخزن المؤقت رد فعل وحدها؛ لين CEM-EC: تكتل القوى الديمقراطية، أو EC1 RFSS1 في المنطقة العازلة التي تحتوي على رد فعل CEM-EC. علامة: تكتل القوى الديمقراطية، CE1 تعامل مع هيدروكسيد الصوديوم N 0،25، وهو إجراء يعرف عنها التسبب في انقسام كامل من الحمض النووي الريبي. unclv: uncleaved تكتل القوى الديمقراطية، EC1. CLV: جزء الانقسام الذي يحتوي على fluorophore.

الشكل (3)
الشكل 3: (أ) الإسفار يشير الملف من تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في CEMS أعدت من الخلايا البكتيرية المختلفة. المفوضية الأوروبية: coli ل-K12، PP: بيلي الزائفة؛ دينار بحريني: Brevundimonas الضئيلة؛ HA: الهافنية النخروبية؛ ريال: يرسينيا ruckeri، خطأ في مرماه: Ochrobactrum grignonese؛ AX: المنتصلة xylosoxidans، MO: الموراكسيلة osloensis؛ منظمة العفو الدولية: الراكدة اللفوفية؛ SF: السراتية fonticola؛ BS: العصوية الرقيقة، LM: النستقة المساريقية؛ ليرة لبنانية: planturum الملبنة: مجلس الشعب: المملسة acidilactici؛ AO: الشعية الفلوبتوماس. وقد حضنت كل عينة CEM لمدة 5 دقائق يليه إضافة تكتل القوى الديمقراطية، EC1. (ب) dPAGEتحليل مخاليط RFD-EC1/CEM-EC بعد رد فعل 60 دقيقة. حارة NC1: تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في المخزن المؤقت رد الفعل وحده. حارة NC2: تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في المنطقة العازلة التي تحتوي على رد فعل CEM-BS (CEM وأعدت من العصوية الرقيقة). الممرات المسمى مع 4، 8، 16، 12 و 24: تكتل القوى الديمقراطية، EC1 في المنطقة العازلة التي تحتوي على رد فعل CEM الجماعة الأوروبية مأخوذة من ثقافة البكتيرية التي تحتوي على واحد E. خلية كولاي بعد فترة متزايد من 4 و 8 و 12 و 16 و 24 ساعة، على التوالي.

Discussion

معظم طرق الكشف البكتيرية شيوعا اليوم اما ان تكون بطيئة (الجراثيم الكلاسيكية) أو مطالبة من الناحية الفنية (الضد، PCR). وبالتالي، فإننا نعتقد أن الجيل القادم من أدوات الكشف وينبغي أن تلبي نحو السرعة والبساطة. تحقيقا لهذه الغاية، لقد أنشأنا الرنا الانفطار ومضان، مما يشير DNAzyme التي يمكن استخدامها لتطوير فحوصات بسيطة للإبلاغ عن وجود البكتيريا من خلال توليد إشارة مضان. يتم تنشيط الميزات DNAzyme التحقيق، تكتل القوى الديمقراطية، EC1، التي أنتجت خلال CEM نمو E. القولونية في وسائل الإعلام ثقافة. منذ أسلوبنا يستخدم خليط من النفط الخام خارج الخلية جرثومة كهدف الكشف واستخراج يتجاوز الهدف شاقة والخطوات التضخيم، أنها يمكن أن تستخدم لإعداد بسيط جدا "، ومزيج، وقراءة" نوع من فحوصات للكشف عن البكتيريا. ولا يقتصر استخدام DNAzyme جهدنا لمضان طريقة كشف القائم. على سبيل المثال، كشف اللونية باستخدام نظام DNAzyme نفسه فحص جتصميم لاستخدام أسلوب ذكرت في وقت سابق ان يستغل المتداول التضخيم دائرة بالتعاون مع لصبغ العضوية (32). ونحن نتوقع استخدام DNAzymes للكشف عن البكتريا كوسيلة جذابة لتوليد أجهزة الاستشعار بكتيرية جديدة مع بساطة تشغيلية أكبر.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقدم التمويل لهذا العمل من جانب العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) وشبكة الحارس ورقة النشطة بيولوجيا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada AGR003
Ammonium persulfate (APS) BioShop Canada AMP001
Acrylamide/Bis-acrylamide (40%, 29:1) BioShop Canada ACR004
Boric acid BioShop Canada BOR001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Electron Microscopy Sciences EXO539-1
HCl Sigma-Aldrich 38281
HEPES BioShop Canada HEP001
LB broth Sigma-Aldrich L3022
MgCl2 EMD Millipore B10149-34
NaCl BioShop Canada SOD002
NaOAc EMD Millipore SXO255-1
NaOH EMD Millipore SXO590-1
SDS BioShop Canada SDS001
TEMED BioShop Canada TEM001
Tris-base BioShop Canada BST666
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Urea BioShop Canada URE001
Xylenecyanol FF Sigma-Aldrich X4126
DNA concentrator Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant DNA SpeedVac 120
Millex filter unit EMD Millipore SLGP033RS
Gel loading tips Diamed TEC200EX-K
ImageQuant software Molecular Dynamics Version 5.0
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 34705
Mini Vortexer VWR international 58816-121
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM996
Petri dishes Fisher Scientific Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Pipette gun) Corning 07764714
Quartz cuvettes Varian Inc., Agilent 66-100216-00
Shaker/Incubator New Brunswick Scientific Classic Series C24
Typhoon Scanner GE Healthcare 9200 Variable mode
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X22-R
UV Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc. GenesysUV 10
Fluorescence Spectrophotometer Varian Inc., Agilent Cary Eclipse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. Springer. New York. (2008).
  2. Call, D. R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).
  3. Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).
  4. Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).
  5. Ali, M. M. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  7. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  8. Li, Y., Lu, Y. Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. Springer. New York. (2009).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  11. Joyce, G. F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).
  12. Breaker, R. R., Joyce, G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).
  13. Cuenoud, B., Szostak, J. W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375, 611-614 (1995).
  14. Chinnapen, D. J., Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).
  15. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  16. Silverman, S. K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).
  17. Mei, S. H. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).
  18. Liu, Z. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  19. Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).
  20. Rupcich, N. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).
  21. Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).
  22. Chiuman, W., Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).
  23. Chiuman, W., Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).
  24. Shen, Y. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).
  25. Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).
  26. Chiuman, W., Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).
  27. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2, e1224 (2007).
  28. Shen, Y. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).
  29. Kandadai, S. A. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).
  30. Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
  31. Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
  32. Ali, M. M., Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).
الكشف عن البكتيريا عن طريق DNAzymes Fluorogenic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).More

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter