Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Påvisning av bakterier Bruke Fluorogenic DNAzymes

doi: 10.3791/3961 Published: May 28, 2012

Summary

Vi har nylig rapportert om en ny tilnærming for å generere fluorogenic DNAzyme sonder som kan brukes for å sette opp en enkel, "mix-og-lese" fluoriserende analysen for bakteriell gjenkjenning. Disse spesielle DNA prober katalysere spalting av en chromophore-modifisert DNA-RNA chimeric substrat i nærvær av råolje ekstracellulært blanding (CEM) produsert av en bestemt bakterie, og dermed oversette bakteriell gjenkjenning inn fluorescens signal generasjon. I denne rapporten vil vi beskrive sentrale eksperimentelle prosedyrer der en bestemt DNAzyme probe merket "RFD-EC1" er ansatt for påvisning av modellen bakterien,

Abstract

Utbrudd knyttet til mat-borne og sykehus-ervervet patogener konto for millioner av dødsfall og sykehusinnleggelser, samt kolossale økonomiske tap hvert eneste år. Forebygging av slike utbrudd og minimering av virkningen av en pågående epidemi sted en stadig økende etterspørsel etter analytiske metoder som nøyaktig kan identifisere gjerningsmann patogener at den tidligste fasen. Selv om det er et stort utvalg av effektive metoder for deteksjon av patogen, kan ingen av dem tilfredsstiller alle de følgende fem fremste krav nedfelt for en ideell påvisningsmetoden: høy spesifisitet (oppdage bare bakterien av interesse), høy følsomhet (stand til å oppdage så lavt som én levende bakteriell celle), kort tid-til-resultater (minutter til timer), stor operasjonell enkelhet (ikke behov for langvarige prøvetaking prosedyrer og bruk av spesialisert utstyr), og kostnadseffektivitet. For eksempel, klassiske mikrobiologiske metoder er svært spesifikk, men krever en lang tid (days til uker) for å få en endelig resultat. 1 PCR-og antistoff-baserte teknikker tilby kortere ventetid (timer til dager), men de krever bruk av kostbare reagenser og / eller avansert utstyr. 2-4 Dermed er det fortsatt en stor etterspørsel etter vitenskapelig forskning til å utvikle innovative bakterielle deteksjonsmetoder som tilbyr forbedrede egenskaper i en eller flere av de nevnte kravene. Vårt laboratorium er interessert i å undersøke potensialet for DNAzymes som en roman klasse av molekylære prober for biosensing applikasjoner, inkludert bakteriell gjenkjenning. 5

DNAzymes (også kjent som deoxyribozymes eller DNA enzymer) er menneskeskapte enkelt-strandet DNA-molekyler med evnen til katalyserende kjemiske reaksjoner. 6-8 Disse molekylene kan isoleres fra et stort tilfeldig sekvens DNA basseng (som inneholder så mange som 10 16 individuelle sekvenser) ved en prosess som kalles "in vitro utvalg" or "SELEX" (systematisk utvikling av ligander ved eksponentiell berikelse). 9-16 Disse spesielle DNA-molekyler har vært mye undersøkt de siste årene som molekylære verktøy for biosensing applikasjoner. 6-8

Vårt laboratorium har etablert in vitro utvelgelsesprosedyrer for å isolere RNA-spalte fluorescerende DNAzymes (RFDs;. Fig. 1) og undersøkt bruken av RFDs som analyseverktøy 17-29 RFDs katalysere spalting av en DNA-RNA chimeric substrat på et enkelt ribonukleotid. motorvei (R) som er flankert av en fluoroforen (F) og en slukkeren (Q). Nærheten F og Q gjengir uncleaved underlaget minimal fluorescens. Imidlertid fører spalting hendelsen til separasjon av F og Q, som er ledsaget av betydelig økning av fluorescens intensitet.

Mer nylig har vi utviklet en metode for å isolere RFDs for bakteriell gjenkjenning. 5 Disse spesielle RFDs ble isolert til "lyser opp "i nærvær av råolje ekstracellulære blanding (CEM) etterlatt av en bestemt type bakterier i deres miljø eller i media de dyrkes (Fig. 1). Bruken av råolje blanding omgår den kjedelige prosessen med rensende og identifisere en passende mål fra mikroben av interesse for biosensor utvikling (som kan ta måneder eller år å fullføre). Bruken av ekstracellulære mål betyr analysere prosedyren er enkel, fordi det ikke er behov for tiltak for å få intracellulære mål.

Bruke ovenfor tilnærming, utledet vi en RFD som kløyver sin substrat (FS1;. Fig. 2A) bare i nærvær av CEM produsert av E. coli (CEM-EC). 5 Denne E. coli-sensing RFD, oppkalt RFD-EC1 (Fig. 2A), ble funnet å være strengt lydhøre for CEM-EC men nonresponsive til CEMS fra en rekke andre bakterier (Fig. 3).

Her har vi Present de sentrale eksperimentelle prosedyrer for å sette opp E. coli-påvisning analyser ved hjelp av RFD-EC1 og representative resultater.

Protocol

1. Utarbeidelse av Chemical Solutions

  1. 0,5 M etylen diaminetetraacetic syre (EDTA): I en to liter (L) plast beger, veier 186,1 g EDTA (EM Science) og tilsett 800 milliliter (ml) autoklaveres avionisert-destillert vann (DDH 2 O). Juster pH til 8,0 med NaOH pellets (EM Science). Gjør det endelige volumet til en L hjelp DDH 2 O. Overfør løsningen på glassflasker, autoklavering og oppbevares ved 4 ° C.
  2. 10 × Tris-borat EDTA-løsning (10 × TBE, 89 mM Tris, 89 mm borsyre, 2 mM EDTA, 7,5 pH): Vei 432 g av Tris-base (BioShop Canada) og 220 g borsyre (BioShop Canada) , og legg hver til en 4 L plast beger. Mål 80 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0) og legge til begerglasset. Legg DDH 2 O til en endelig volum på 4 L. Bland løsningen med en magnetisk oppsikt bar før komponentene er helt oppløst. Overfør løsningen på glassflasker, autoklavering og oppbevares ved 4 ° C.
  3. 10% denaturering polyacrylamide gel lager: Til en 4 L plast beger, legge 1681,7 g urea (BioShop Canada), 400 ml 10 × TBE, en L på 40% akrylamid / bisacrylamide (29:1) løsning (BioShop Canada). Juster volumet til 4 L med DDH 2 O. Oppløs urea med omrøring. Overfør løsningen på 1 L rav glassflasker og oppbevares ved 4 ° C. (OBS! Akrylamid skal håndteres med hansker, maske, briller og frakk fordi det er en nervegift før polymerisasjon).
  4. 2 × gel loading buffer (2 × GLB): Til en 200 ml glass begerglass, tilsett 44 g urea, 8 g sukrose (BioShop Canada), 10 mg Bromophenol blå (BioShop Canada), 10 mg xylenecyanol FF (Sigma -Aldrich), 400 mL av 10% natrium dodecyl sulfat (SDS; BioShop Canada), og 4 ml 10 × TBE. Juster endelige volumet til 40 ml med DDH 2 O og oppløse faste stoffer med mild oppvarming (50 ° C) og omrøring med en magnetisk bar. Overfør 1 ml delmengde inn 1,5 ml Mikrosentrifugerør og oppbevares ved 4 ° C. Basert på vårerfaring, er det nødvendig å varme 2 × GLB kort ved 90 ° C før bruk fordi 2 × GLB stivner under lagring tilstand.
  5. 1 M Tris-HCl (pH 7,5): Vei 12,1 g av Tris-base i en 200 ml glass beger. Legg 60 mL DDH 2 O og oppløse faste stoffer ved å røre med en magnetrører. Juster pH til 7,5 med 1 M HCl (Sigma-Aldrich). Fyll opp volumet til 100 ml med DDH 2 O og overføre til en glassflaske og autoklav. Oppbevares ved 4 ° C.
  6. 5 M NaCl: I glass begerglasset veier 58,4 g NaCl (BioShop Canada) og oppløse med 150 ml DDH 2 O. Juster volumet til 200 ml med DDH 2 O. Overfør løsningen til en glassflaske, autoklav og oppbevares ved 4 ° C.
  7. DNA eluering buffer: I et glass begerglass, blande 2 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 ml av 5 M NaCl og 0,4 mL 0,5 M EDTA (pH 8,0). Juster volumet til 200 ml med DDH 2 O. Autoklaven og oppbevar ved 4 ° C.
  8. 2 × reaksjon buffer (2 × RB; 100 mm HEPES, 300 mm NaCl, 30 mM MgCl 2): en 50 ml Falcon rør (BD Falcon), tilsett 1,2 g HEPES (BioShop Canada), 0,88 g NaCl og 0,30 g MgCl 2 • 6H 2 O (EMD Kjemikalier) og 30 ml av DDH 2 O. Bland ved å riste lett til komponentene er helt oppløst. Juster pH til 7,5 ved å legge 10 N NaOH løsning og justere den endelige volumet til 50 ml med DDH 2 O. Rense løsningen ved hjelp av en sprøyte-drevet filter enhet (0,22 mikrometer, Millipore) og oppbevar ved 4 ° C.
  9. Luria Bertani (LB) Buljong: I et begerglass, veier 20,0 g LB pulver (Sigma-Aldrich) etterfulgt av tillegg av en L av DDH 2 O. Bland løsningen med en magnetisk oppsikt bar, overføre løsningen til en erlenmeyerkolbe. Autoklaver løsningen og butikken ved romtemperatur.
  10. 1,5% LB agar: Vei 1,5 g agar (BioShop Canada) i en 250 mL kolbe og tilsett 100 ml væske LB. Autoklaver blandingen og butikken ved romtemperatur.
  11. Agar plating: Melt LB agar i en mikrobølgeovn og kjølig løsningen på ~ 50 ° C. Hell blandingen i petriskåler (Fisher Scientific) under en flamme. I vår erfaring, kan 100 ml LB agar gi 5-6 plater.

2. Bygging av RFD-EC1 og RFSS1 av Mal mediert Enzymatisk hemorroider

RFD-EC1 (Fig. 2A) er kjennetegnet DNAzyme. Det består av katalytiske sekvensen EC1 og underlaget sekvens FS1 (angitt med svarte og grønne linjer i fig. 2A). RFSS1 (Fig. 2A) er en kryptert versjon av RFD-EC1 der katalytiske sekvensen EC1 er delvis stokket inn SS1 men FS1 delen forblir uendret. RFD-EC1 og RFSS1 ble laget av malen mediert enzymatisk ligation av oligonukleotid FS1 med oligonukleotid EC1 eller SS1 i nærvær av LT1 som ligation mal (se inn boksen i fig. 2A). Prosedyren for gjennomføring av ligation reaksjonen er gitt nedenfor.FS1 er innhentet fra Keck oligo Synthesis fasiliteter ved Yale University, deprotected og renset ved gelelektroforese følge en tidligere etablert protokoll. 17-24 EC1, SS1 og LT1 ble kjøpt fra Integrerte DNA Technologies og renset ved gel elektroforese.

  1. Forbered en 100 mM stamløsning av FS1, EC1, SS1 og LT1 hjelp DDH 2 O. Oppbevar dem ved -20 ° C inntil bruk.
  2. Overføring 5 mL av FS1 stamoppløsning til to 1,5 mL Mikrosentrifugerør merket som Rør 1 og Tube to. Til hver tube, legger 38,5 mL av DDH 2 O og deretter 5 mL av 10 × T4 polynucleotide kinase (PNK) reaksjon buffer A (MBI Fermentas), som inneholder 500 mM Tris-HCl (7,6 pH, 25 ° C), 100 mm 2 MgCl, 50 mM DTT, 1,0 mm spermidine. Bland hver løsning ved å pipettere (pipetter løsningen opp og ned noen ganger).
  3. Tilsett 1 mL av ATP (100 mm; MBI Fermentas) og bland med pipettering.
  4. Tilsett 0,5 mL av T4 polynucleotide kinase (PNK; 10 enheter / mL; MBI Fermentas) og bland med pipettering. Inkuber reaksjonsblandingene ved 37 ° C i 30 min. Sørg for å dekke rørene med aluminiumsfolie for å minimere photobleaching av fluoroforen.
  5. Slukk reaksjonen ved oppvarming til 90 ° C i 5 min. Kjøl reaksjonsblandingene ved romtemperatur i 10 min.
  6. Tilsett 5 mL av EC1 og SS1 stamoppløsning til Tube 1 og Tube 2, henholdsvis.
  7. Tilsett 5 mL av LT1 stamløsning i hvert rør, bland ved pipettering. Varm reaksjonsblandingene ved 90 ° C i 1 min og avkjøles til romtemperatur i 10 min.
  8. Legg 118 mL av DDH 2 O og deretter 20 mL av 10 × T4 DNA ligase buffer (MBI Fermentas), som inneholder 400 mM Tris-HCl (pH 7,8 ved 25 ° C), 100 mm MgCl 2, 100 mM DTT, og 5 mM ATP. Bland løsningen ved pipettering.
  9. Tilsett 2 mL av T4 DNA ligase (5 enheter / mL; MBI Fermentas) og bland med pipettering. Inkuber reaksjonsblandingene ved romtemperatur i 1 time.
  10. Tilsett 20 mL av 3 M NaOAc (pH 7,0) til hvert rør, vortex og spinner ned. Legg til 500 mL av kulde 100% etanol i hvert rør, blande løsningen ved virvling og plassere rørene i -20 ° C fryseboks i 30 min.
  11. Sentrifuger blandinger ved 11 000 g for 20 min ved 4 ° C i en nedkjølt sentrifuge (Allegra X22-R, Beckman Coulter), og fjern forsiktig supernatanten ved pipettering.
  12. Tørk DNA pellet ved hjelp av en DNA konsentrator (Savant DNA Speedvac, Thermo Scientific) i 10 min.
  13. Resuspender DNA pellets i 30 mL av en × gel loading buffer (GLB), kort Vortex og spinne ned med en Borstemmaskin sentrifuge (Minicentrifuge, VWR Scientific). De ligated DNA-prøver er klare for lasting på en 10% dPAGE gel.

3. Utarbeidelse av 10% dPAGE Gel

Følgende trinn beskriver kort apparater som gel elektroforese og set-up. For større detaljer om apparater, innstillinger og håndtering, se to våre tidligere publiserte protokoller. 30,31

  1. Vask og tørk to glassplater, to 0,75 mm spacers og en 16-brønnen kam. Monter glassplater og avstandsstykker med klipp og lå horisontalt på et flatt underlag med tannet glassplate vendt opp.
  2. Overføring 40 ml 10% dPAGE bland inn en 150 ml begerglass. Legg 40 mL av tetramethylethylenediamine (TEMED; Bioshop Canada), 400 mL av 10% APS, og bland ved å svinge med en pipettor.
  3. Hell blandingen forsiktig mellom platene og umiddelbart setter kammen. La blandingen til polymerisere i 10 til 20 min. Polymerisasjon kan bekreftes ved å sjekke gjenværende gel blanding igjen i begerglasset.
  4. Når polymerisert, fjern kammen forsiktig og skyll brønnene med DDH 2 O for å fjerne rester gel løsning i brønnene.
  5. Monter platene på gelelektroforese apparat med unnotched rektangulær plate som vender ut og plassere en metallplate bak hakk plate. Bruken av metall plspiste bidrar til å hindre overoppheting som kan knekke glassplater.
  6. Tilsett 1 × TBE til øvre og nedre kammer av apparatet. Kontroller at brønnene er fylt med buffer og den nedre kant av gel er nedsenket i bufferen.
  7. Påfør en 40 mA (eller 750 V) strøm og pre-løpe i 10 til 15 min.

4. Rensing av Ligated RFD-EC1 og RFSS1 med 10% dPAGE Gel

  1. Etter trinn på 3,7, skyll brønner med en × TBE hjelp av en sprøyte og en nål.
  2. Legg ligation blanding av RFD-EC1 og at av RFSS1 (fra 2,13) ​​i 2 brønner (ett for hver) ved hjelp av en pipettor og gel lasting tips (Diamed). Påfør en 40 mA (750 V) strøm til bunnen fargestoff (Bromophenol blå) er ca 5 cm over underkanten av platene.
  3. Fjern glassplater fra gelen kjører apparat, legge seg ned på en flat benk toppen og forsiktig fjerne avstandsstykkene.
  4. Fjern forsiktig de beste glassplater fra gel ogvikle gel med plastfolie (prøv å unngå rynker og folding av wraps på gel).
  5. De ligated produktene kan visualiseres enten ved UV skygge (260 nm) eller ved transillumination (360 nm), som skal produsere en synlig DNA bandet noen få centimeter over EC1 eller SS1 (100 pmol av EC1 eller SS1 kan brukes som en markør og lastet inn i en brønn i trinn på 4,2). Merk ønskede DNA band med en markør.
  6. Avgiftsdirektoratet DNA bandet med sterile barberblader, kutt gel i små biter og overfør til en frisk 1,5 mL mikrosentrifuge tube.
  7. Knus gel stykker innenfor mikrosentrifuge røret ved hjelp av en steril pipette tips (200 mL tips størrelse).
  8. Legg til 500 mL DNA eluering buffer i hvert rør og dekk dem med aluminiumsfolie for å beskytte fluorophores mot lys. Vortex prøvene for 10 min.
  9. Sentrifuger prøver ved 11 000 g for 4 min ved 4 ° C i en nedkjølt sentrifuge (Allegra X22-R, Beckman Coulter) og nøye overføre 350 mL av supernatant til en frisk 1,5 mL mikrosentrifuge tube (om nødvendig, kan en andre eluering gjøres med 350 mL av fersk eluering buffer for en annen 10 min).
  10. Legg 35 mL (0,1 × av prøvevolum) av 3 M natriumacetat (NaOAc, 7,0 pH) til hvert rør, bland ved virvling og spinne ned. Legg 900 ul av kulde 100% etanol i hvert rør. Bland hver prøve hånd-riste røret noen sekunder. Plasser rørene ved -20 ° C i minst 1 time.
  11. Sentrifuger prøver ved 11 000 g for 20 min ved 4 ° C i en nedkjølt sentrifuge og fjern forsiktig supernatanten ved pipettering.
  12. Tilsett 100 mL med kaldt 70% etanol og bruke den til forsiktig skylle hele indre veggen av røret. Re-sentrifuger ved 11 000 g for 7 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tørk pellet bruke DNA konsentratoren for 10 min.
  13. Løs opp DNA pellets i 100 mL av DDH 2 O og virvle. Bestem DNA konsentrasjon basert på UV absorbans ved 260 nm. Oppbevar prøver ved -20° C inntil bruk.

5. Utarbeidelse av bakterier

  1. Målet bakteriestammen E. coli K12 (MG1655) og relevante kontrollstammer er først belagt på LB agar plater fra glyserol aksjer. Under en flamme eller innenfor en biologisk sikkerhet skap, berør bakteriell glyserol aksje med en steril pipette tips og forsiktig strek på tallerkenen overflaten for å unngå skade på LB agar.
  2. Inverter stripete plater og Inkuber ved 37 ° C for 14 timer. Etter inkubasjon forsegle hele omkretsen av platene med Parafilm (Pechiney plast emballasje) og oppbevar ved 4 ° C. Disse platene kan lagres i maksimalt 4 uker.

6. Utarbeidelse av Crude ekstracellulære blandinger (CEMS)

  1. Tilsett 2 ml LB inn i sterile 14 ml kultur rør (BD Falcon) ved hjelp av en pipette pistol (Corning).
  2. Ved hjelp av en steril pipette tips, plukke en enkelt koloni fra en agarskål utarbeidet i trinn på 5,2 og sette det inn i aculture tube. Plasser rørene i en inkubator (New Brunswick Scientific) satt til 37 ° C, og rist ved 250 rpm for 14 timer.
  3. 1% re-inokulasjon kultur: Tilsett 2 mL frisk LB til 14 ml kultur rør og Spike med 20 mL av bakteriekulturer utarbeidet i trinn 6.2. Inkuber rørene ved 37 ° C med rist ved 250 rpm til hver bakteriell løsning når en OD 600 (optisk tetthet målt til 600 nm) på ca 1. For å måle OD 600, overføre 1 mL av hver kultur til en disponibel kyvette og måle absorbansen ved 600 nm med en UV spektrofotometer (Genesys 10 UV, Thermo Scientific).
  4. Overføring 1 mL av hver kultur til en ny 1,5 mL mikrosentrifuge tube og pelletskaminer celler ved sentrifugering på 11 000 g for 5 min ved romtemperatur.
  5. Overfør den klare supernatanten til en frisk 1,5 mL mikrosentrifuge rør og oppbevares ved -20 ° C hvis den ikke brukes umiddelbart.

7. Deteksjon ved hjelp Fluorescens spektrofotometer

  1. Slå på fluorescens spektrofotometer (Cary Eclipse, Varian Inc) og sette opp datainnsamling parametere med eksitasjon ved 488 nm og utslipp på 520 nm. Readings kan tas hvert minutt i 1 time.
  2. Vask 3 kvartskrystall kyvetter (Varian Cary) med DDH 2 O, etterfulgt av 100% etanol. Tørk kyvettene ved å blinke nitrogen gass. Etikett kyvetter C1 (kontroll 1), C2 (kontroll 2) og T (test).
  3. Overføring 24 mL av DDH 2 O til C1 og 24 mL av CEM-EC til C2 og T. Tilsett 25 mL av 2 × RB til hver kyvette og plassere dem i fluorescens spektrofotometer. Begynn å samle fluorescens data for første 5 min.
  4. Tilsett 1 mL av RFSS1 (fra en 5 mM stamløsning) til K2 og 1 mL av RFD-EC1 (fra en 5 mM stamløsning) til T og C1. Bland hver løsning ved pipettering. Dette må nøye igangsatt slik at fluorescens målingene ikke blir avbrutt. La reaksjonen til å fortsette for resten av en time oppkjøpet tid.
  5. Lagredataene i Excel-filformat, overføre dataene til en personlig datamaskin og behandle data for å lage et grafisk bilde.

8. Påvisning av gelelektroforese

De samme reaksjonsblandingene utarbeidet i trinn 7.4 kan brukes til analyse av gel elektroforese, alternativt nye reaksjoner kan være forberedt tilsvarende og inkubert i 1,5 ml Mikrosentrifugerør. I begge tilfeller:

  1. Slukk reaksjoner (etter 1 h) ved å tilsette 5 mL av 3 M NaOAc og 125 mL av 100% etanol. Bland hver løsning ved virvling og plassere rørene i -20 ° C fryseboks i 1 time.
  2. Sentrifuger reaksjonsblandingene ved 11 000 g for 20 min ved 4 ° C, og fjern forsiktig supernatanten ved pipettering.
  3. Tørke pellets ved hjelp av DNA konsentratoren for 10 min.
  4. Resuspender pellets i 20 mL av en × GLB etter kort virvling. Spinn ned rør veldig kort med en Borstemmaskin sentrifuge (Minicentrifuge, VWR Scientific). Disse prøvene blir lesty for lasting inn i en dPAGE gel.
  5. Forbered en 10% dPAGE gel som beskrevet i 3.1 til 3.7. Legg i reaksjonen prøver (fra trinn 8,4) inn i brønner ved hjelp av en pipettor og gel lasting tips (Diamed). Påfør en 40 mA (750 V) strøm til bunnen fargestoff (Bromophenol blå) er ca 5 cm over underkanten av platene.
  6. Fjern glassplater og vask grundig med vann fra springen for å fjerne eventuelle gel stykker. Tørk plater med en kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
  7. Skann gel plate for fluorescens med en Typhoon Scanner (9200 Typhoon, Variable modus, GE Healthcare). Analysere dataene ved hjelp ImageQuant programvare (Molecular Dynamics).

9. Detection Spesifisitet

  1. For å teste bakteriell spesifisitet, beskrev de samme prosedyrene ovenfor for dyrking E. coli, kan forberede sin CEM og gjennomføre en cleavage reaksjon analyse utføres for en rekke ulike bakteriestammer som B. subtilis, P. Peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (vist i fig. 3A).

10. Enkel Cell Detection

Forbered en 1 ml E. coli glyserol lager av 2 CFU / ml (CFU: koloni-forming unit) ved seriell fortynning og bekreft CFU konsentrasjon av platekledning 5 Denne lager skal inneholde 0,2 CFU/100 mL.. Oppbevares ved -80 ° C inntil bruk.

  1. Forbered 10 kultur-rør med 2 ml LB.
  2. Inokuler hver kultur med 100 mL av 2 CFU / ml glyserol lager og Inkuber ved 37 ° C med rist ved 250 rpm. Bruken av hele glyserol lager (1 ml) bør gi 10 kulturer.
  3. Høste 300 mL fra hver inokulert kultur rør på følgende tidspunkter: 4, 8, 12, 16 og 24 timer. La gjenværende kulturen å vokse i 24 timer.
  4. Mål OD 600 og fremskynde cellene ved sentrifugering på 11 000 g for 5 min.
  5. Overfør CEMS til friske 1,5 ml Mikrosentrifugerør og oppbevares ved -20 & df.eks; C inntil bruk.
    Merk: Siden det kan være noen påviselig OD 600 for prøvene høstet på tidspunktet punkt 4, 8 og 12, la de resterende kultur å vokse i 24 timer for å identifisere kulturer som inneholder bakterier (bestemmes av turbiditet og OD måling). Bare én eller to av de 10 kulturene kan inneholde E. coli etter inokulasjon og de ​​resterende rør vil ikke inneholde noen celler.
  6. Bruk CEMS utvinnes fra positive kulturer (lagret ved -20 ° C) ved de utpekte tidspunkter for å forberede cleavage reaksjoner med RFD-EC1, og deretter analysere reaksjonsblandingene hjelp dPAGE gel elektroforese som beskrevet i punkt 8.

11. Concept og representant Resultater

Konseptet med å utnytte en RNA-spalte fluorescerende DNAzyme (RFD) for bakteriell deteksjon er illustrert i fig. 1. Den RFD kløyver en chimeric DNA / RNA underlaget med en enslig RNA kopling (blå R) flankert av to nukleotider merketmed en fluoroforen (F) og en slukkeren (Q), henholdsvis. Som en bakterie av interesse (for eksempel E. coli) vokser i media, vil det etterlate en grov ekstracellulære blanding (CEM). Dette CEM som helhet blir så brukt i en in vitro utvalg eksperiment for å få en RFD som er lydhør spesifikt til CEM, antagelig den RFD samhandler med en bestemt molekyl (lilla stjerne) i CEM som er en signatur molekyl av bakterien. Når CEM legges til reaksjonen løsningen inneholder RFD, utløser det RNA-spalte aktiviteten til RFD. Den cleavage arrangementet skiller F fra Q, noe som resulterer i en fluorescerende signal som kan oppdages enten ved hjelp av en fluorimeter eller gel elektroforese.

Den eksperimentelle validering av ovennevnte konseptet ble gjort med CEM fra E. coli (CEM-EC). Vi fikk 3 RFD molekyler via in vitro seleksjon, og det mest effektive en ble utpekt som RFD-EC1 (Fig. 2A). 5 We testet spalting aktiviteten RFD-EC1 (sammen med en mutant sekvens kalt RFSS1) som svar på CEM-EC. Både RFD-EC1 og RFSS1 ble utarbeidet av enzymatisk ligation av DNAzyme deler til underlaget FS1 (alle sekvenser er vist i fig. 2A). I fluorescens målingen forsøket (Fig. 2B), ble CEM-EC ruges alene for 5 min, etterfulgt av tilsetning av RFD-EC1 eller RFSS1, og ved ytterligere inkubering for 55 min. Den fluorescensintensiteten av løsningen ble kontinuerlig lese hvert minutt, og dataene ble brukt til å beregne relativ fluorescens (RF, beregnet som forholdet mellom fluorescensintensiteten ved tid t vs fluorescensintensiteten ved tid 0). RF verdier vs tid inkubasjonstiden plottes som fig. 2B. Det ble funnet at RFD-EC1 produsert et høyt nivå av fluorescens signal ved tillegg av CEM-EC, i sterk kontrast, gjorde RFSS1 ikke produsere en sterk fluorescens signal. Dermed blir fluorescens-produserende function av RFD-EC1 upon kontakter CEM-EC er sekvens-spesifikk.

For å verifisere at observerte fluorescens øker skyldes spalting av RNA sammenhengen, analyserte vi reaksjonsblandingene av dPAGE. Kløyving av RFD-EC1 forventes å generere to DNA fragmenter, en 5 'fragment beholde fluoroforen og en 3 "fragment beholde slukkeren. Bare uncleaved RFD-EC1 (unclv) og 5 'fragment (CLV) kunne oppdages av fluorescens bildebehandling. Den dPAGE Resultatet er vist i fig. 2C avslører at reaksjonen blanding av RFD-EC1 og CEM-EC faktisk produsert forventet cleavage produktet, mens RFSS1/CEM-EC blandingen ikke.

Spesifisiteten til RFD-EC1 ble undersøkt ved hjelp av CEMS samlet inn fra flere andre gram negative og gram positive bakterier og dataene er vist i fig. 3A. Bare prøven inneholder CEM-EC (blå kurve) produsert en økning i fluorescens. Mangelen på kryssreaktivitet med CEMSfra de andre bakterier indikerer at RFD-EC1 er svært selektiv for E. coli.

Vi undersøkte også den tiden som trengs for dyrking et enkelt E. coli celle for å produsere nok CEM som kan indusere spalting av RFD-EC1. For dette eksperimentet, en E. coli prøven inneholder definert CFU (colony-forming units) ble tilstrekkelig fortynnet å oppnå konsentrasjon på 1 CFU / ml. Dette ble fulgt ved å blande 100 mL av den fortynnede bakteriell prøven med vekstmedier og dyrking den for 4, 8, 12, 16 og 24 timer. CEMS ble deretter samlet for hver endepunktet og testet for å indusere spalting aktiviteten RFD-EC1. Den dPAGE Resultatet er vist i fig. 3B indikerer at en dyrkning tid på 12 timer er nødvendig.

Det er viktig å merke seg at den første lille signalet økning observert i fluorescens målinger etter tilsetning av RFSS1 sekvens (som en negativ kontroll) til CEM-EC (Fig. 2B; rød curve) eller RFD-EC1 til andre bakterielle CEMS (Fig. 3B, alle kurver unntatt blå) er knyttet til den iboende fluorescens av FRQ modulen (pga ufullstendig dempe F av Q). Dermed forventes det at tillegg av F-og Q-merkede sekvensene vil produsere en innledende fluorescens økning. Men bare RFD-EC1/CEM-EC blandinger er i stand til å produsere et høyt nivå av fluorescens over tid.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av RNA-spalte fluorescerende DNAzyme (RFD) sonde som fluoresces ved kontakt med råolje ekstracellulære blanding (CEM) produsert av spesifikke bakterieceller av interesse. Den RFD kløyver en chimeric DNA / RNA underlaget med en enslig RNA kopling (blå R) flankert av to nukleotider merket med en fluoroforen (F) og en slukkeren (Q), henholdsvis. Før cleavage reaksjon, er det fluorescens nivået av RFD minimal grunn av den tette PROXimity av F og Q. Ved spalting, avviker Q fra F, som et resultat, er en sterk fluorescens signal produsert.

Figur 2
Figur 2. E. coli-sensing RFD. (A) RFD-EC1 er DNAzyme sonde som kan aktiveres ved CEM-EC. RFSS1 er en kodet sekvens av RFD-EC1 brukt som en kontroll. RFD-EC1 og RFSS1 ble produsert av ligating FS1 med EC1 og SS1, henholdsvis, i nærvær av LT1 som mal. F: fluorescein-modifisert deoxythymidine. Q: Dabcyl-modifisert deoxythymidine. R: adenin ribonukleotid. (B) Fluorescens signaliserte profiler av RFD-EC1 og RFSS1 i nærvær av CEM-EC. (C) dPAGE analyse av spalting reaksjonsblandingene i B (reaksjonstid: 60 min). Bildet er et fluorescens bilde av dPAGE gel oppnådd med ved Typhoon skanner. Lane NC: RFD-EC1 eller RFSS1 i reaksjonen buffer alene; Lane CEM-EC: RFD-EC1 eller RFSS1 i reaksjonen buffer som inneholder CEM-EC. Marker: RFD-CE1 behandlet med 0,25 N NaOH, en prosedyre kjent for å forårsake fulle spalting av RNA. unclv: uncleaved RFD-EC1. CLV: spalting fragment inneholder fluoroforen.

Figur 3
Figur 3. (A) Fluorescens signaliserte profilen RFD-EC1 i CEMS forberedt fra ulike bakterielle celler. EC: Escherichia coli-K12; PP: Pseudomonas Peli; BD: Brevundimonas diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri, OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella osloensis; AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola, BS: Bacillus subtilis; LM: Leuconostoc mesenteroides; LP: Lactobacillus planturum; PA: Pediococcus acidilactici; m.fl.: Actinomyces orientalis. Hver CEM prøven ble inkubert i 5 min etterfulgt av tilsetning av RFD-EC1. (B) dPAGEanalyse av RFD-EC1/CEM-EC blandinger etter en 60-min reaksjon. Lane NC1: RFD-EC1 i reaksjonen buffer alene. Lane NC2: RFD-EC1 i reaksjonen buffer som inneholder CEM-BS (CEM forberedt fra Bacillus subtilis). Banene merket med 4, 8, 12, 16 og 24: RFD-EC1 i reaksjonen buffer som inneholder CEM-EC tatt fra bakteriekultur som inneholder en enkelt E. coli celle etter en voksende periode på 4, 8, 12, 16 og 24 h, henholdsvis.

Discussion

De fleste av de vanligste bakterielle deteksjonsmetoder i dag er enten trege (klassisk mikrobiell) eller teknisk krevende (antistoff, PCR). Derfor tror vi at neste generasjon av gjenkjenningsverktøy bør imøtekomme mot hastighet og enkelhet. Til dette formålet har vi laget en RNA-spalte og fluorescens-signalering DNAzyme som kan brukes til å utvikle enkle metoder for å rapportere tilstedeværelse av bakterier gjennom produksjon av en fluorescens signal. Kjennetegnet DNAzyme probe, RFD-EC1, blir aktivert av CEM produsert under veksten av E. coli i kultur media. Siden vår metode bruker råolje ekstracellulære blandinger av en bakterie som målet for deteksjon og omgår den møysommelige målet utvinning og forsterkningsbehov trinn, kan den brukes til å sette opp veldig enkel, "mix-og-lese" type analyser for bakteriell gjenkjenning. Bruken av DNAzyme vår er ikke begrenset til fluorescens deteksjon metode. For eksempel, kolorimetrisk deteksjon bruker samme DNAzyme system analysen cen være utformet ved hjelp av en tidligere rapportert metode som utnytter rullende sirkel forsterkning i forbindelse med en organisk fargestoff. 32 Vi ser bruken av DNAzymes for bakteriell gjenkjenning som en attraktiv vei å generere nye bakterielle biosensorer med større operativ enkelhet.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Midler til dette arbeidet ble gitt av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) og Sentinel Bioaktive Paper Network.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar BioShop Canada AGR003
Ammonium persulfate (APS) BioShop Canada AMP001
Acrylamide/Bis-acrylamide (40%, 29:1) BioShop Canada ACR004
Boric acid BioShop Canada BOR001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA Electron Microscopy Sciences EXO539-1
HCl Sigma-Aldrich 38281
HEPES BioShop Canada HEP001
LB broth Sigma-Aldrich L3022
MgCl2 EMD Millipore B10149-34
NaCl BioShop Canada SOD002
NaOAc EMD Millipore SXO255-1
NaOH EMD Millipore SXO590-1
SDS BioShop Canada SDS001
TEMED BioShop Canada TEM001
Tris-base BioShop Canada BST666
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Urea BioShop Canada URE001
Xylenecyanol FF Sigma-Aldrich X4126
DNA concentrator Thermo Fisher Scientific, Inc. Savant DNA SpeedVac 120
Millex filter unit EMD Millipore SLGP033RS
Gel loading tips Diamed TEC200EX-K
ImageQuant software Molecular Dynamics Version 5.0
Kimwipes Kimberly-Clark Corporation 34705
Mini Vortexer VWR international 58816-121
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM996
Petri dishes Fisher Scientific Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Pipette gun) Corning 07764714
Quartz cuvettes Varian Inc., Agilent 66-100216-00
Shaker/Incubator New Brunswick Scientific Classic Series C24
Typhoon Scanner GE Healthcare 9200 Variable mode
Centrifuge Beckman Coulter Inc. Allegra X22-R
UV Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc. GenesysUV 10
Fluorescence Spectrophotometer Varian Inc., Agilent Cary Eclipse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. Springer. New York. (2008).
  2. Call, D. R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).
  3. Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).
  4. Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).
  5. Ali, M. M. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  7. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  8. Li, Y., Lu, Y. Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. Springer. New York. (2009).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  11. Joyce, G. F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).
  12. Breaker, R. R., Joyce, G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).
  13. Cuenoud, B., Szostak, J. W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375, 611-614 (1995).
  14. Chinnapen, D. J., Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).
  15. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  16. Silverman, S. K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).
  17. Mei, S. H. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).
  18. Liu, Z. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  19. Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).
  20. Rupcich, N. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).
  21. Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).
  22. Chiuman, W., Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).
  23. Chiuman, W., Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).
  24. Shen, Y. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).
  25. Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).
  26. Chiuman, W., Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).
  27. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2, e1224 (2007).
  28. Shen, Y. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).
  29. Kandadai, S. A. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).
  30. Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
  31. Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
  32. Ali, M. M., Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).
Påvisning av bakterier Bruke Fluorogenic DNAzymes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).More

Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter