Summary
Vi har nyligen rapporterat ett nytt sätt för att generera fluorogena DNAzyme sonder som kan användas för att fastställa en enkel, "mix-and-läsa" fluorescerande analys för bakteriell detektering. Dessa särskilda DNA-prober katalysera klyvningen av en kromofor-modifierad DNA-RNA-chimär substrat i närvaro av rå extracellulär blandning (CEM) producerad av en specifik bakterie, därigenom omvandla bakteriell detektion i fluorescenssignal generationen. I denna rapport kommer vi att beskriva de viktigaste experimentella försök där en specifik DNAzyme sond betecknas "RFD-EC1" används för detektion av modellen bakterien,
Abstract
Utbrott kopplade till livsmedelsburna och sjukhusbaserad förvärvade patogener står för miljontals dödsfall och sjukhusinläggningar samt kolossala ekonomiska förluster varje år. Förebyggande av sådana utbrott och minimering av effekterna av en pågående epidemi införa ett ständigt ökande efterfrågan på analysmetoder som exakt kan identifiera boven patogener så tidigt. Även om det finns ett stort utbud av effektiva metoder för detektion av patogener, kan ingen av dem uppfyller alla följande fem främsta krav som finns för en perfekt detektionsmetoden: hög specificitet (detektering enbart bakterien av intresse), hög känslighet (kan upptäcka så låg som en enda levande bakteriell cell), korta time-to-resultat (minuter till timmar), stor operativ enkelhet (inget behov av långa provtagning och användning av specialutrustning) och kostnadseffektivitet. Till exempel klassiska mikrobiologiska metoder är mycket specifika, men kräver en lång tid (days till veckor) för att förvärva en slutgiltig resultat. 1 PCR-och antikropp-baserade tekniker erbjuder kortare väntetid (timmar till dagar), men de kräver användningen av dyra reagens och / eller sofistikerad utrustning. 2-4 Följaktligen finns det fortfarande en stor efterfrågan för vetenskaplig forskning för att utveckla innovativa bakteriella detekteringsmetoder som erbjuder förbättrade egenskaper i ett eller flera av de ovan nämnda kraven. Vårt laboratorium är intresserad av att undersöka potentialen för DNAzymes som en ny klass av molekylära prober för biosensing applikationer inklusive bakteriell upptäckt. 5
DNAzymes (även känd som deoxiribozymer eller DNA-enzymer) är anlagda enkelsträngade DNA-molekyler med förmåga att katalysera kemiska reaktioner. 6-8 Dessa molekyler kan isoleras från en stor slumpmässig-sekvens-DNA pool (som innehåller så många som 10 16 individuella sekvenser) genom ett förfarande känt som "in vitro-selektion" or "SELEX" (systematisk utveckling av ligander genom exponentiell anrikning). 9-16 Dessa särskilda DNA-molekyler har fått stor undersökts under de senaste åren som molekylära verktyg för biosensing applikationer. 6-8
Vårt laboratorium har etablerat in vitro urvalsförfaranden för att isolera RNA-spjälka fluorescerande DNAzymes (RFDs,. Figur 1) och undersökte användningen av RFDs som analytiska verktyg 17-29 RFDs katalyserar klyvning av en DNA-RNA chimär substrat på en enda ribonukleotid. korsning (R) som är flankerad av en fluorofor (F) och en utsläckande (Q). Närheten av F och Q gör ospaltade underlaget minimal fluorescens. Emellertid leder klyvning vid till separation av F och Q, som åtföljs av en betydande ökning av fluorescensintensitet.
Mer nyligen utvecklade vi en metod för att isolera RFDs för bakteriell detektion. 5 Dessa speciella RFDs isolerades till "lysa upp "i närvaro av den råa extracellulära blandningen (CEM) lämnade efter sig en viss typ av bakterier i sin omgivning eller i media de odlas (Fig. 1). Användningen av råa blandningen kringgår den tråkiga processen med renande och att identifiera ett lämpligt mål från mikroben av intresse för biosensor utveckling (vilket kan ta månader eller år att slutföra). Användningen av extracellulära mål innebär att analysera förfarandet är enkelt eftersom det inte finns något behov av åtgärder för att få intracellulära mål.
Med hjälp av ovanstående metod, härledd vi en RFD som klyver dess substrat (FS1,. Figur 2A) endast i närvaro av CEM som produceras av E. coli (CEM-EG). 5 Denna E. coli-avkänning RFD, heter RFD-EC1 (Fig. 2A), visade sig vara strikt lyhörda för CEM-EG, men inte svarar för att CEMS från en mängd andra bakterier (Fig. 3).
Här har vi present de viktigaste experimentella förfarandena för att inrätta E. coli detektionsanalyser med RFD-EC1 och representativa resultat.
Protocol
1. Beredning av kemiska lösningar
- 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA): I en 2 liters (L) plastbägare, väger 186,1 g EDTA (EM Science) och tillsätt 800 ml (mL) av autoklaverat avjoniserat-destillerat vatten (ddHaO 2 O). Justera pH till 8,0 med användning av NaOH-pellets (EM Science). Gör den slutliga volymen till 1 L med ddHaO 2 O. Överför lösningen till glasflaskor, autoklav och lagra vid 4 ° C.
- 10 x Tris-borat-EDTA-lösning (10 x TBE, 89 mM Tris, 89 mM borsyra, 2 mM EDTA, pH 7,5): Väg 432 g Tris-bas (BioShop Kanada) och 220 g borsyra (BioShop Kanada) och lägga vardera till en 4 L plastbägare. Mät 80 ml av 0,5 M EDTA (pH 8,0) och lägga till bägaren. Tillsätt ddHaO 2 O till en slutlig volym av 4 L. Blanda lösningen med en magnetisk omrörarstav tills komponenterna är fullständigt upplöst. Överför lösningen till glasflaskor, autoklav och lagra vid 4 ° C.
- 10% denaturering polyacrylamide Gel lager: Till en 4 L plastbägare, tillsätt 1681,7 g urea (BioShop Kanada), 400 ml 10 x TBE, 1 L av 40% akrylamid / bisakrylamid (29:1)-lösning (BioShop Kanada). Justera volymen till 4 L med ddHaO 2 O. Upplösa karbamid under omröring. Överför lösningen till 1 liter bärnstensfärgade glasflaskor och lagra vid 4 ° C. (Varning! Akrylamid bör hanteras med handskar, mask, skyddsglasögon och labbrock eftersom det är ett nervgift före polymerisation).
- 2 X gelladdningsbuffert (2 x GLB): Till en 200 ml glasbägare, tillsätt 44 g urea, 8 g sackaros (BioShop Kanada), 10 mg bromfenolblått (BioShop Kanada), 10 mg xylencyanol FF (Sigma -Aldrich), 400 | il av 10% natriumdodecylsulfat (SDS; BioShop Kanada), och 4 ml 10 x TBE. Justera den slutliga volymen till 40 ml med ddHaO 2 O och upplösa de fasta ämnena med mild upphettning (50 ° C) och omrörning med en magnetomrörare. Överför 1 ml alikvot i 1,5 ml mikrocentrifugrör och lagra vid 4 ° C. Baserat på vårerfarenhet är det nödvändigt att värma 2 × GLB kort vid 90 ° C före användning eftersom 2 × GLB stelnar under lagringsförhållanden.
- 1 M Tris-HCl (pH 7,5): Väg 12,1 g tris-bas i en 200 ml glasbägare. Tillsätt 60 ml av Ddh 2 O och upplösa de fasta ämnena genom omröring med en magnetomrörare. Justera pH till 7,5 med användning av 1 M HCl (Sigma-Aldrich). Gör upp volymen till 100 ml med ddHaO 2 O och överför till en glasflaska och autoklav. Lagra vid 4 ° C.
- 5 M NaCl: I glasbägare väger 58,4 g NaCl (BioShop Kanada) och lös med 150 ml av Ddh 2 O. Justera volymen till 200 ml med ddHaO 2 O. Överför lösningen till en glasflaska, autoklav och lagra vid 4 ° C.
- DNA-elueringsbuffert: I en glasbägare, blanda 2 ml av 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8 ml av 5 M NaCl och 0,4 ml av 0,5 M EDTA (pH 8,0). Justera volymen till 200 ml med ddHaO 2 O. Autoklav och förvara vid 4 ° C.
- 2 × reaktionsbuffert (2 × RB; 100 mM HEPES, 300 mM NaCl, 30 mM MgCl2): Till en 50 ml Falcon-rör (Falcon BD), tillsätt 1,2 g HEPES (BioShop Kanada), 0,88 g NaCl och 0,30 g MgCl2 • 6 H2O (EMD Chemicals) och 30 ml av Ddh 2 O. Blanda genom att skaka lätt fram komponenter är helt upplöst. Justera pH till 7,5 genom tillsats av 10 N NaOH-lösning och justera den slutliga volymen till 50 ml med ddHaO 2 O. Rena lösningen med en spruta driven filterenhet (0,22 ^ m, Millipore) och lagra vid 4 ° C.
- Luria Bertani (LB)-buljong: I en bägare, väger 20,0 g LB-pulver (Sigma-Aldrich) följt av tillsats av 1 L av Ddh 2 O. Grundligt blanda lösningen med en magnetisk omrörarstav, överför lösningen till en konisk kolv. Autoklaveras lösningen och förvara vid rumstemperatur.
- 1,5% LB-agar: Väg 1,5 g agar (BioShop Kanada) i en 250 ml kolv och tillsätt 100 ml flytande LB. Autoklaveras blandningen och förvara vid rumstemperatur.
- Agar plätering: Melt LB-agar i en mikrovågsugn och lösningen kyldes till ~ 50 ° C. Häll ut lösningen på Petri-skålar (Fisher Scientific) under en flamma. Enligt vår erfarenhet kan 100 ml LB-agar ger 5-6 plattor.
2. Konstruktion av RFD-EC1 och RFSS1 med Mall förmedlas enzymatisk ligering
RFD-EC1 (fig. 2A) är utrustad DNAzyme. Den består av den katalytiska sekvensen EC1 och substratet sekvensen FS1 (anges med svarta och gröna linjer i fig. 2A). RFSS1 (fig. 2A) är en kodad version av RFD-EC1 där den katalytiska sekvensen EC1 delvis blandas in SS1 men FS1 delen förblir oförändrad. RFD-EC1 och RFSS1 gjordes genom mallen medieras enzymatisk ligering av oligonukleotid FS1 med oligonukleotid EC1 eller SS1 i närvaro av LT1 som ligeringstemplat (se den insatta rutan i fig. 2A). Förfarandet för genomförande av ligeringsreaktionen ges nedan.FS1 erhölls från Keck oligosyntes faciliteter vid Yale University, avskyddas och renas med gelelektrofores efter en tidigare etablerat protokoll. 17-24 EC1, SS1 och LT1 köptes från Integrated DNA Technologies och renades genom gelelektrofores.
- Bered en 100 lösning M lager av FS1, EC1, SS1 och LT1 med ddHaO 2 O. Lagra dem vid -20 ° C fram till användning.
- Överföra 5 | il av den FS1 stamlösning till två 1,5 ^ il mikrocentrifugrör märkta Rör 1 och röret 2. Till varje rör, tillsätt 38,5 | il av Ddh 2 O och därefter 5 ^ il 10 x T4-polynukleotidkinas (PNK) reaktion buffert A (MBI Fermentas), som innehåller 500 mM Tris-HCl (pH 7,6, 25 ° C), 100 mM MgCl2, 50 mM DTT, 1,0 mM spermidin. Blanda varje lösning genom att pipettera (pipett lösningen upp och ner några gånger).
- Tillsätt 1 pl av ATP (100 mM; MBI Fermentas) och blanda genom pipettering.
- Tillsätt 0,5 | il av T4-polynukleotidkinas (PNK, 10 enheter / l. MBI Fermentas) och blanda genom att pipettera. Inkubera reaktionsblandningarna vid 37 ° C under 30 minuter. Se till att täcka rören med aluminiumfolie för att minimera fotoblekning av fluoroforen.
- Avbröts reaktionen genom uppvärmning vid 90 ° C under 5 minuter. Svalna reaktionsblandningarna vid rumstemperatur under 10 min.
- Tillsätt 5 | il av EC1 och SS1 stamlösning till röret 1 och Rör 2, respektive.
- Tillsätt 5 | il av den LT1 stamlösning till varje rör, blanda genom pipettering. Värma reaktionsblandningarna vid 90 ° C under 1 min och kyl till rumstemperatur under 10 minuter.
- Tillsätt 118 pl av Ddh 2 O och därefter 20 | il av 10 x T4 DNA-ligasbuffert (MBI Fermentas), som innehåller 400 mM Tris-HCl (pH 7,8 vid 25 ° C), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT och 5 mM ATP. Blanda lösningen genom pipettering.
- Tillsätt 2 fil T4 DNA-ligas (5 enheter / | il; MBI Fermentas) och blanda genom pipettering. Inkubera reaktionsblandningarna vid rumstemperatur under 1 timme.
- Tillsätt 20 pl 3 M NaOAc (pH 7,0) till varje rör, vortexa och centrifugera ner. Tillsätt 500 pl kall 100% etanol till varje rör, blanda lösningen genom att vortexa och placera rören i -20 ° C frys under 30 min.
- Centrifugera blandningarna vid 11.000 g under 20 minuter vid 4 ° C i en kyld centrifug (Allegra X22-R, Beckman Coulter) och ta försiktigt bort supernatanten genom pipettering.
- Torka DNA-pelleten med användning av en DNA-koncentrator (Savant Speedvac DNA, Thermo Scientific) i 10 min.
- Återsuspendera DNA-pelletar i 30 | il av 1 x gelladdningsbuffert (GLB), kortfattat virvel och centrifugera ner med en bordscentrifug (Minicentrifuge, VWR Scientific). De ligerade DNA-prover är redo för lastning på en 10% dPAGE gel.
3. Framställning av 10% dPAGE gel
Följande steg beskriver kortfattat apparaten gel elektrofores och dess set-up. För större detaljer om apparater, inställningar och hantering, se to våra tidigare publicerade protokoll. 30,31
- Tvätta och torka två glasplattor, två 0,75 mm distansorgan och en 16-brunn kam. Montera glasskivor och distanser med clips och lägga horisontellt på en plan yta med tandad glasplatta uppåt.
- Överföra 40 ml 10% dPAGE blandningen till en 150 ml bägare. Tillsätt 40 pl av tetrametyletylendiamin (TEMED; Bioshop Kanada), 400 | il av 10% APS, och blanda genom virvling med en pipett.
- Häll blandningen försiktigt mellan plattorna och omedelbart sätt in kammen. Tillåta blandningen att polymerisera under 10 till 20 min. Polymerisation kan bekräftas genom att kontrollera kvarvarande gel blandningen kvar i bägaren.
- När polymeriserade bort kammen försiktigt och skölj brunnarna med ddHaO 2 O för att ta bort kvarvarande gel lösningen i brunnarna.
- Montera plattorna på gelelektrofores apparaten med oskårad rektangulära plattan utåt och placera en metallplatta bakom hack plattan. Användningen av metallen plåt hjälper till att förhindra överhettning som kan glaset gå sönder plattorna.
- Tillsätt 1 x TBE vid de övre och nedre kammare i anordningen. Kontrollera att brunnarna fylls med bufferten och den nedre kanten av gelén nedsänkes i bufferten.
- Applicera en 40 mA (eller 750 V) ström och pre-springa för 10 till 15 min.
4. Rening av Ligerat RFD-EC1 och RFSS1 med 10% dPAGE Gel
- Efter steget att 3,7, skölj brunnar med 1 x TBE användning av en spruta och en nål.
- Ladda ligeringsblandningen av RFD-EC1 och av RFSS1 (från 2,13) i 2 brunnar (en för varje) med en pipett och gel tips lastning (Diamed). Applicera en 40 mA (750 V) ström tills den nedre färgämnet (bromfenolblått) är ca 5 cm över den nedre kanten av plattorna.
- Ta bort glasskivorna ur gelén körs apparaten, ligg ner på en plan bänk och försiktigt ta bort distanserna.
- Försiktigt bort de bästa glasplattorna från gelén ochlinda gelén med plastfolie (försöker undvika rynkor och vikning av varv på gelén).
- De ligerade produkterna kan visualiseras antingen genom UV-skuggning (260 nm) eller genom-genomlysning (360 nm), som kommer att producera en synlig DNA-band några centimeter ovanför EC1 eller SS1 (100 pmol EC1 eller SS1 kan användas som en markör och laddas in i en brunn i steget för 4,2). Markera önskade DNA-banden med en markör.
- Excidera DNA-bandet med sterila rakblad, skars gelén i små bitar och överför till en färsk 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Krossa gelstycken inom mikrocentrifugrör med användning av en steril pipettspets (200 | il munstycke).
- Tillsätt 500 pl buffert DNA eluering till varje rör och täck dem med aluminiumfolie för att skydda fluoroforerna från ljus. Virvel proverna i 10 min.
- Centrifugera proverna vid 11.000 g under 4 min vid 4 ° C i en kyld centrifug (Adelaide X22-R, Beckman Coulter) och töm 350 | il av supernatant till en färsk 1,5 ml mikrocentrifugrör (om så behövs, kan en andra elueringslösning göras med 350 | il färskt elueringsbuffert under ytterligare 10 min.)
- Tillsätt 35 pl (0,1 x av prowolymen) av 3 M natriumacetat (NaOAc, pH 7,0) till varje rör, blanda genom att vortexa och centrifugera ner. Tillsätt 900 pl kall 100% etanol till varje rör. Blanda varje prov för hand-skaka röret i ett par sekunder. Placera rören vid -20 ° C under minst 1 tim.
- Centrifugera proverna vid 11.000 g under 20 min vid 4 ° C i en kyld centrifug och noggrant avlägsna supernatanten genom pipettering.
- Tillsätt 100 pl kall 70% etanol och använda den för att försiktigt skölja hela inre väggen av röret. Re-centrifug vid 11.000 g under 7 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och torka pelleten med användning av DNA-koncentrator under 10 min.
- Lös DNA pellets i 100 | il av Ddh 2 O och virvel. Bestämma DNA-koncentration baserad på UV-absorbans vid 260 nm. Förvara proverna vid -20° C fram till användning.
5. Framställning av bakterier
- Målet bakteriestam E. coli K12 (MG1655) och relevanta stammar kontroll är dels utstrykes på LB-agarplattor från glycerol lager. Under en flamma eller inom ett biologiskt säkerhetsskåp, tryck på bakteriella glycerol beståndet med en steril pipettspets och försiktigt stråk på plattan ytan för att undvika skador på LB-agar.
- Uteslut streckade plattorna och inkuberas vid 37 ° C under 14 timmar. Efter inkubering försegla hela omkretsen av plattorna med Parafilm (Pechiney plastförpackningar) och förvara vid 4 ° C. Dessa plattor kan lagras i högst 4 veckor.
6. Beredning av Råa Extracellulära blandningar (CEMS)
- Dispensera 2 ml LB till sterila 14 ml odlingsrör (BD Falcon) med en pipett pistol (Corning).
- Använd en steril pipettspets, välj en enda koloni från en agarplatta framställts i steg 5,2 och sätt in det i ACulture röret. Placera rören i en inkubator (New Brunswick Scientific) inställd på 37 ° C, och skaka vid 250 rpm under 14 timmar.
- 1% re-ympning kultur: Dispensera 2 ml färskt LB i 14 ml odlingsrör och spetsen med 20 | il av bakteriekulturer som framställts i steg 6.2. Inkubera rören vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm tills varje bakteriell lösningen når ett OD 600 (optisk densitet mätt vid 600 nm) av ca 1. Att mäta OD 600, överföra 1 ml av varje kultur till en engångskyvett och mät absorbansen vid 600 nm med en UV-spektrofotometer (UV-Genesys 10, Thermo Scientific).
- Överföra 1 ml av varje kultur till en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och Pelletera celler genom centrifugering vid 11.000 g under 5 min vid rumstemperatur.
- Överföra den klara supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör och lagra vid -20 ° C om den inte används omedelbart.
7. Detektering med användning av fluorescensspektrofotometer
- Slå på fluorescensspektrofotometer (Cary Eclipse, Varian Inc) och ställa in datainsamling parametrar med excitation vid 488 nm och emission vid 520 nm. Avläsningar kan tas varje minut under 1 timme.
- Tvätta 3 kvartskristall kyvetter (Varian Cary) med ddHaO 2 O, följt av 100% etanol. Torka kuvetterna med blinkande kvävgas. Label kyvetter C1 (kontroll 1), C2 (kontroll 2) och T (test).
- Överför 24 pl av Ddh 2 O till C1 och 24 pl CEM-EG-till C2 och T. Tillsätt 25 pl 2 × RB till varje kyvett och placera dem i fluorescensspektrofotometer. Börja samla fluorescens data för den första 5 min.
- Tillsätt 1 pl av RFSS1 (från en 5 pM stamlösning) till C2 och 1 | il av RFD-EC1 (från en 5 pM stamlösning) till T och C1. Blanda varje lösning genom att pipettera. Detta måste noggrant inledas så att fluorescensen avläsningarna inte avbryts. Låta reaktionen fortsätta under resten av den 1 timme insamlingstid.
- Sparadata i Excel-format, överföra data till en dator och bearbeta data för att skapa en grafisk bild.
8. Detektering genom gelelektroföres
Samma reaktionsblandningar som framställts i steg 7,4 kan användas för analys med gelelektrofores, alternativt nya reaktioner kan framställas på liknande sätt och inkuberades i 1,5 ml mikrocentrifugrör. I båda fallen:
- Dämpningen reaktionerna efter 1 h) genom tillsats av 5 pl av 3 M NaOAc och 125 | il 100% etanol. Blanda varje lösning genom att vortexa och placera rören i -20 ° C frys under 1 timme.
- Centrifugera reaktionsblandningarna vid 11.000 g under 20 min vid 4 ° C och försiktigt avlägsnande av supernatanten genom pipettering.
- Torka pelletama med användning av DNA-koncentrator under 10 min.
- Återsuspendera pelleten i 20 | il av 1 x GLB genom kortvarig virvling. Centrifugera ner rören mycket hastigt med en bordscentrifug (Minicentrifuge, VWR Scientific). Dessa prover läsesy för laddning i ett dPAGE gel.
- Framställ en 10% dPAGE gel såsom beskrivits i 3,1-3,7. Ladda reaktionen proven (från steg 8,4) i brunnarna med hjälp av en pipett och gel tips lastning (Diamed). Applicera en 40 mA (750 V) ström tills den nedre färgämnet (bromfenolblått) är ca 5 cm över den nedre kanten av plattorna.
- Ta bort glasskivorna och tvätta noggrant med kranvatten för att avlägsna eventuella gel bitar. Torka plattor med en Kimwipe (Kimberly-Clark Professional).
- Skanna gelplattan för fluorescens med hjälp av en Typhoon Scanner (Typhoon 9200, Variable läge, GE Healthcare). Analysera data med hjälp av ImageQuant programvara (Molecular Dynamics).
9. Detektering Specificitet
- För att testa bakteriell specificitet, beskrivs på samma sätt ovan för odling E. coli, kan framställa den CEM och utföra en analys klyvningsreaktion utföras för ett antal olika bakteriestammar såsom B. subtilis, P. Peli, Y. ruckeri, L. planturum, P. acidilactici (visad i fig 3A).
10. Single Cell Detection
Förbered en 1 ml E. coli glycerol lager av 2 CFU / ml (CFU: kolonibildande enhet) genom seriespädning och bekräfta CFU koncentration genom plätering 5 Detta lager bör innehålla 0,2 cfu/100 pl.. Lagra vid -80 ° C fram till användning.
- Framställ 10 odlingsrör innehållande 2 ml LB.
- Inokulera varje kultur med 100 | il av 2 CFU / ml glycerolförråd och inkubera vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm. Användningen av hela glycerolförråd (1 ml) bör ge 10 kulturer.
- Harvest 300 il från varje inokulerad kultur rör vid följande tidpunkter: 4, 8, 12, 16 och 24 timmar. Lämnar den återstående kulturen att växa under 24 timmar.
- Mäta OD 600 och fälla ut cellerna genom centrifugering vid 11.000 g under 5 minuter.
- Överför CEMS till nya 1,5 ml mikrocentrifugrör och lagra vid -20 & dt.ex., C fram till användning.
Notera: Eftersom det kan finnas någon detekterbar OD 600 för skördade vid tidpunkterna 4, 8 och 12, tillåter den återstående kulturen att växa under 24 h för att identifiera kulturer innehållande bakterier (bestämd med turbiditet och OD-mätning). Endast en eller två av de 10 kulturerna kan innehålla E. coli efter ympning och de återstående rören kommer inte att innehålla några celler. - Använd CEMS återvunna från positiva kulturer (förvaras vid -20 ° C) vid de utsedda tidpunkter för att förbereda klyvningsreaktioner med RFD-EC1, och sedan analysera reaktionsblandningarna med elektrofores dPAGE gel som beskrivs i avsnitt 8.
11. Koncept-och representant resultat
Konceptet att utnyttja en RNA-klyvande fluorescerande DNAzyme (RFD) för bakteriell detektion visas i fig.. 1. Den RFD klyver en chimär DNA / RNA-substrat vid en ensam RNA länksystem (blå R) flankerad av två märkta nukleotidermed en fluorofor (F) och en utsläckande (Q), respektive. Som en bakterie av intresse (såsom E. coli) växer i media, kommer det att lämna efter en rå extracellulär blandning (CEM). Detta CEM som helhet används sedan i en in vitro-selektion experiment för att erhålla en RFD som reagerar specifikt till CEM, förmodligen RFD interagerar med en specifik molekyl (lila stjärna) i CEM, som är en signatur molekyl av bakterien. När CEM sättes till reaktionslösningen innehållande RFD, startar den RNA-klyvande aktivitet av RFD. Klyvningen vid separerar F från Q, vilket resulterar i en fluorescerande signal som kan detekteras antingen med användning av en fluorimeter eller genom gel-elektrofores.
Den experimentella validering av ovanstående koncept gjordes med CEM från E. coli (CEM-EG). Vi fick 3 RFD molekyler via in vitro-selektion, och den mest effektiva en utsågs till RFD-EC1 (Fig. 2A). 5 We testade klyvningsaktivitet av RFD-EC1 (tillsammans med en mutant sekvens heter RFSS1) som svar på CEM-EC. Både RFD-EC1 och RFSS1 framställdes genom enzymatisk ligering av de DNAzyme delarna till substratet FS1 (alla sekvenser visas i fig. 2A). I fluorescensmätning experimentet (fig 2B) tillsattes CEM-EG inkuberades ensamt under 5 min, följt av tillsats av RFD-EC1 eller RFSS1, och genom ytterligare inkubation under 55 mer min. Fluorescensintensiteten hos lösningen kontinuerligt avläsa varje minut och de data som användes för att beräkna relativ fluorescens (RF, beräknat som förhållandet mellan fluorescensintensiteten vid tiden t vs fluorescensintensiteten vid tiden 0). De RF-värden vs tid för inkubation plottas såsom flg. 2B. Det visade sig att RFD-EC1 producerade en hög nivå av fluorescenssignal vid tillsättning av CEM-EG, i skarp kontrast hade RFSS1 inte ge en stark fluorescenssignal. Sålunda fluorescens-producerande function av RFD-EC1 vid kontakt med CEM-EG är sekvensspecifik.
För att kontrollera att observerade fluorescens ökar beror på klyvning av RNA kopplingen, analyserade vi reaktionsblandningar med dPAGE. Klyvning av RFD-EC1 förväntas generera två DNA-fragment, ett 5 '-fragmentet bibehåller fluoroforen och en 3'-fragmentet bibehåller släckningsenheten. Endast ospaltade RFD-EC1 (unclv) och 5 '-fragmentet (CLV) kunde detekteras genom fluorescens avbildning. Den dPAGE resultat som visas i fig.. 2C visar att reaktionsblandningen av RFD-EC1 och CEM-EG faktiskt producerade den förväntade klyvningsprodukten, medan RFSS1/CEM-EC blandningen inte.
Specificiteten hos RFD-EC1 undersöktes med användning av CEMS uppsamlade från flera andra gramnegativa och grampositiva bakterier och data visas i Fig.. 3A. Endast provet innehållande CEM-EC (blå kurva) producerade en ökning i fluorescens. Avsaknaden av korsreaktivitet med CEMSfrån de andra bakterier indikerar att RFD-EC1 är mycket selektiv för E. coli.
Vi har även granskat den tid som behövs för odling en enda E. coli-cell för att producera tillräcklig CEM, som kan inducera klyvning av RFD-EC1. För detta experiment en E. coli prov innehållande definierade CFU (kolonibildande enheter) tillfredsställande späddes för att uppnå en koncentration av 1 CFU / ml. Detta följdes av blandning av 100 | il av det utspädda bakteriella provet med tillväxtmedia och odling den för 4, 8, 12, 16 och 24 timmar. CEMS sedan in för varje tidpunkt och testas för att inducera klyvning aktiviteten av RFD-EC1. Den dPAGE resultat som visas i fig.. 3B visar att en odling tid av 12 timmar behövs.
Det är viktigt att notera att den initiala lilla signalen ökning observerades i fluorescensmätningar efter tillsats av RFSS1 sekvens (såsom en negativ kontroll) till CEM-EG (fig. 2B; röd curve) eller RFD-EC1 av andra bakteriella CEMS (fig. 3B; alla kurvor förutom blå) tillskrivs den inneboende fluorescensen från FRQ modulen (till följd av ofullständig härdning av F av Q). Sålunda förväntas det att tillsatsen av F-och F-märkta sekvenserna skulle producera en första fluorescensökning. Emellertid endast RFD-EC1/CEM-EC blandningar är kapabel att producera en hög nivå av fluorescens över tiden.
Figur 1. Schematisk illustration av det RNA-klyvande fluorescerande DNAzyme (RFD) sond som fluorescerar vid kontakt med den råa blandningen extracellulära (CEM) som produceras av specifika bakteriella cellerna av intresse. Den RFD klyver en chimär DNA / RNA-substrat vid en ensam RNA länksystem (blå R) flankerad av två nukleotider märkta med en fluorofor (F) och en utsläckande (Q), respektive. Före klyvningsreaktionen är fluorescens nivå på RFD minimal på grund av den nära närhetNärheten av F och Q. Vid klyvning, avgår Q från F, som ett resultat, är en stark fluorescenssignal som produceras.
Figur 2. Av E. coli-avkänning RFD. (A) RFD-EC1 är DNAzyme sond som kan aktiveras av CEM-EC. RFSS1 är en kodad sekvens av RFD-EC1 användes som en kontroll. RFD-EC1 och RFSS1 framställdes genom att ligera FS1 med EC1 och SS1, respektive, i närvaro av LT1 som mall. F: fluorescein-modifierad deoxitymidin. F: Dabcyl-modifierad deoxitymidin. R: adenin ribonukleotid. (B) Fluorescens signalering profiler av RFD-EC1 och RFSS1 i närvaro av CEM-EC. (C) dPAGE analys av blandningarna klyvningsreaktionen i B (reaktionstid: 60 min). Bilden är en fluorescensbild av dPAGE erhållna gelén med genom Typhoon scannern. Bana NC: RFD-EC1 eller RFSS1 i reaktionen enbart buffert, och bana CEM-EG: RFD-EC1 eller RFSS1 i reaktionsbuffert innehållande CEM-EC. Markör: RFD-CE1 behandlades med 0,25 N NaOH, en procedur som är känd för att orsaka fullständig klyvning av RNA. unclv: ospaltade RFD-EC1. CLV: klyvningen fragment som innehåller fluoroforen.
Figur 3. (A) Fluorescens signalering profilen RFD-EC1 i CEMS framställda från olika bakterieceller. EG: Escherichia coli-K12, PP: Pseudomonas PELI; BD: Brevundimonas Diminuta; HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans; MO: Moraxella osloensis; AI: Acinetobacter lwoffi; SF: Serratia fonticola, BS: Bacillus subtilis; LM: Leuconostoc mesenteroides, LP: Lactobacillus planturum, PA: Pediococcus acidilactici, AO: Actinomyces orientalis. Varje CEM provet inkuberades under 5 min följt av tillsats av RFD-EC1. (B) dPAGEanalys av RFD-EC1/CEM-EC blandningar efter en 60-minuters reaktion. Bana NC1: RFD-EC1 i reaktionen enbart buffert. Bana NC2: RFD-EC1 i reaktionsbuffert innehållande CEM-BS (CEM framställts från Bacillus subtilis). Banorna märkta med 4, 8, 12, 16 och 24: RFD-EC1 i reaktionsbuffert innehållande CEM-EG tas från bakteriekultur innehållande en enda E. coli-cell efter en tillväxtperiod av 4, 8, 12, 16 och 24 timmar respektive.
Discussion
De flesta av de vanligaste bakteriella detektionsmetoder är idag antingen långsamma (klassisk mikrobiella) eller tekniskt krävande (antikropp, PCR). Därför tror vi att nästa generation av undersökningsverktyg bör tillgodose mot snabbhet och enkelhet. För detta ändamål har vi skapat en RNA-klyvning och fluorescens-signalering DNAzyme som kan användas för att utveckla enkla analyser för att rapportera förekomsten av bakterier genom generering av en fluorescenssignal. Den presenterade DNAzyme sond, RFD-EC1, aktiveras av CEM, som framställts under tillväxten av E. coli i odlingsmedia. Eftersom vår metod använder rå extracellulära blandningar av en bakterie som mål för upptäckt och förbi det mödosamma målet utvinning och steg förstärkning, kan den användas för att ställa upp mycket enkel, "mix-och-läsa" typ av analyser för bakteriell detektion. Användningen av vår DNAzyme är inte begränsad till fluorescens-baserad detektionsmetod. Till exempel, kolorimetrisk detektering med användning av samma DNAzyme systemet analys cen utformas med hjälp av en tidigare rapporterad metod som utnyttjar rullande cirkel amplifiering i samband med ett organiskt färgämne. 32 Vi förutser att användningen av DNAzymes för bakteriell detektion som en attraktiv väg att skapa nya bakteriella biosensorer med större operativ enkelhet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Finansiering för detta arbete lämnades av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) och Sentinel Bioactive Paper Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | BioShop Canada | AGR003 | |
| Ammonium persulfate (APS) | BioShop Canada | AMP001 | |
| Acrylamide/Bis-acrylamide (40%, 29:1) | BioShop Canada | ACR004 | |
| Boric acid | BioShop Canada | BOR001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| EDTA | Electron Microscopy Sciences | EXO539-1 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 38281 | |
| HEPES | BioShop Canada | HEP001 | |
| LB broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | B10149-34 | |
| NaCl | BioShop Canada | SOD002 | |
| NaOAc | EMD Millipore | SXO255-1 | |
| NaOH | EMD Millipore | SXO590-1 | |
| SDS | BioShop Canada | SDS001 | |
| TEMED | BioShop Canada | TEM001 | |
| Tris-base | BioShop Canada | BST666 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Urea | BioShop Canada | URE001 | |
| Xylenecyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| DNA concentrator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Savant DNA SpeedVac 120 | |
| Millex filter unit | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Gel loading tips | Diamed | TEC200EX-K | |
| ImageQuant software | Molecular Dynamics | Version 5.0 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34705 | |
| Mini Vortexer | VWR international | 58816-121 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | Fisherbrand 08-757-12 | |
| Stripettor Plus (Pipette gun) | Corning | 07764714 | |
| Quartz cuvettes | Varian Inc., Agilent | 66-100216-00 | |
| Shaker/Incubator | New Brunswick Scientific | Classic Series C24 | |
| Typhoon Scanner | GE Healthcare | 9200 Variable mode | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X22-R | |
| UV Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | GenesysUV 10 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Varian Inc., Agilent | Cary Eclipse |
References
- Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. , Springer. New York. (2008).
- Call, D. R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).
- Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).
- Ali, M. M. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
- Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
- Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
- Li, Y., Lu, Y. Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. , Springer. New York. (2009).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
- Joyce, G. F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).
- Breaker, R. R., Joyce, G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).
- Cuenoud, B., Szostak, J. W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375, 611-614 (1995).
- Chinnapen, D. J., Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).
- Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
- Silverman, S. K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).
- Mei, S. H. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).
- Liu, Z. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
- Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).
- Rupcich, N. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).
- Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).
- Chiuman, W., Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).
- Chiuman, W., Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).
- Shen, Y. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).
- Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).
- Chiuman, W., Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).
- Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2, e1224 (2007).
- Shen, Y. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).
- Kandadai, S. A. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).
- Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
- Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
- Ali, M. M., Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).
