Summary
हम एक तेजी से अलग और संस्कृति कृंतक भ्रूण से hippocampal और cortical न्यूरॉन्स कार्यप्रणाली का वर्णन. इस प्रोटोकॉल हमें प्रयोगों में जो लगभग शुद्ध neuronal संस्कृतियों की आवश्यकता है प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है.
Abstract
हम अलग कर देना और संस्कृति E15-17 चूहा भ्रूण से hippocampal या cortical न्यूरॉन्स के लिए एक त्वरित विधि का वर्णन कर रहे हैं. माउस और मानव प्राथमिक न्यूरॉन्स और तंत्रिका progenitors के अलगाव की प्रक्रिया सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है. Dissociated न्यूरॉन्स सीरम मुक्त मध्यम में रखा जाता है कई हफ्तों के लिए. इन संस्कृतियों nucleofection, immunocytochemistry, nucleic एसिड तैयारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वृध्द neuronal संस्कृतियों भी से lentiviral पारगमन द्वारा एक अच्छा दक्षता दर और कम कुशलता, कैल्शियम फॉस्फेट या lipofectamine जैसे लिपिड आधारित विधियों के साथ के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है.
Protocol
1. पाली - डी - Lysine (PDL): तैयारी
- PDL के 5 मिलीग्राम 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए बाँझ DDH 2 हे 5 मिलीलीटर जोड़ें.
- कई बार pipetting द्वारा शेयर समाधान मिश्रण.
- तुरंत का उपयोग करें या 2-8 पर पाली-D-Lysine समाधान की दुकान डिग्री सेल्सियस
2. पाली - डी - Lysine (PDL): कोटिंग प्लास्टिक सेल संस्कृति व्यंजन
- PDL स्टॉक से बाँझ DDH 2 हे के साथ 10 / μg मिलीलीटर के अंतिम एकाग्रता समाधान जलमिश्रित.
- विंदुक एक 60 मिमी संस्कृति सतह क्षेत्र को कवर (एक 60 मिमी पकवान के लिए 3 मिलीग्राम) की डिश में पर्याप्त समाधान.
- धीरे रॉक संस्कृति की सतह का भी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए.
- कमरे के तापमान (आर टी) में लेपित प्लेटें रातोंरात सेते हैं.
- अगले दिन पर, आम तौर पर विच्छेदन के दिन, आकांक्षा द्वारा पाली-D-Lysine समाधान निकालने और धो संक्षिप्त बाँझ DDH 2 ओ 3 मिलीग्राम के साथ इस चरण को दोहराएँ. दूसरे धोने के बाद पानी पूरी तरह से हटाने आकांक्षा द्वारा.
- प्लेट्स तीन सप्ताह तक के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहीत किया जा सकता है.
3. पोलीफोनिक (PDL) डी Lysine और laminin: तैयारी और ग्लास कोटिंग स्लाइड दो कक्ष
- मिक्स (1 मिलीग्राम / एमएल) PDL और laminin (1 मिलीग्राम / एमएल) बाँझ DDH 2 हे में 10 और 5 / μg मिलीग्राम, क्रमशः के अंतिम एकाग्रता स्टॉक समाधान.
- विंदुक एक कांच के दो कक्ष संस्कृति सतह क्षेत्र (एक अच्छी तरह से 2 गिलास स्लाइड दो कक्ष की प्रत्येक अच्छी तरह के लिए 1 मिलीग्राम) को कवर स्लाइड कुओं में पर्याप्त समाधान.
- धीरे रॉक संस्कृति की सतह का भी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए.
- आरटी पर लेपित प्लेटें रातोंरात सेते हैं.
- अगले दिन पर आकांक्षा के माध्यम से पाली - डी - Lysine laminin कोटिंग समाधान निकालने के लिए और संक्षिप्त बाँझ DDH 2 ओ के 1 मिलीग्राम के साथ दो बार धोना दूसरे धोने के बाद पानी पूरी तरह से हटाने आकांक्षा द्वारा.
- चैंबर स्लाइड तीन सप्ताह के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहीत किया जा सकता है.
नोट: कोई कांच चैम्बर स्लाइड followin के लेपित किया जा सकता हैजी इस प्रोटोकॉल. हम अक्सर दो कक्ष स्लाइड का उपयोग करें, क्योंकि प्रत्येक स्लाइड नियंत्रण परीक्षण प्रयोगात्मक सेटिंग (जैसे अनुपचारित बनाम इलाज, untransfected, बनाम ट्रांसफ़ेक्ट) प्रदान करता है.
4. Neuronal विच्छेदन और संस्कृति
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में निम्नलिखित अभिकर्मकों गर्म:
- इसके मूल 100 मिलीलीटर की बोतल पर TrypLE एक्सप्रेस.
- Neurobasal/B27 पूरा मध्यम (मैं तालिका देखें). गरम मात्रा व्यंजन चढ़ाया हो सकता है (उदाहरण के लिए दस 60 मिमी मढ़वाया बर्तन के लिए 30 मिलीलीटर) की संख्या पर निर्भर करता है.
- चार 60 मिमी संस्कृति व्यंजन और 13 मिलीग्राम के लिए एक 15 मिलीलीटर बी.डी. फाल्कन उच्च स्पष्टता polypropylene के चोटीदार ट्यूब के लिए सर्दी सीतनिद्रा ई समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
- तीन 100 मिमी संस्कृति बर्तन में से प्रत्येक के लिए ठंड विच्छेदन मध्यम (देखें तालिका द्वितीय, डा. Olimpia Meucci, निजी संचार) की 25-30 मिलीलीटर जोड़ें. इन प्लेटों, माध्यम की एक बड़ी मात्रा युक्त, उनके के तुरंत बाद भ्रूण को धोने के लिए इस्तेमाल किया जाएगाएमनियोटिक थैलियों (4.7 कदमों और 4.8) से हटाने.
- इंसानियत और प्रयोगशाला पशु की देखभाल का प्रयोग पर सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति के अनुसार सीओ 2 में और एक संस्थागत अनुमोदित जानवरों की देखभाल के अंतर्गत एक E17 समय गर्भवती चूहा और Euthanize प्रोटोकॉल का उपयोग करें.
- स्प्रे 70% EtOH के साथ पेट के निचले हिस्से और गर्भाशय और भ्रूण को उजागर कैंची की एक जोड़ी के साथ त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से medially कटौती.
- सभी भ्रूण को निकालें और उन्हें एक बाँझ 100 मिमी ठंड विच्छेदन मध्यम (25-30 मिलीलीटर, कदम 4.3 देखें) के एक अतिरिक्त वाले पकवान में जगह है.
- भ्रूण amniotic थैली से कैंची का एक छोटा सा जोड़ी का उपयोग कर कटौती और दूसरा 100 मिमी ठंड विच्छेदन मध्यम युक्त पकवान में उन्हें जगह है.
- कमरे के तापमान पर धीरे झुकने 5-10 सेकंड के लिए 100 मिमी पकवान द्वारा भ्रूण धो लें. तो, 3 मिमी 100 विदारक मध्यम युक्त पकवान rinsed भ्रूण हस्तांतरण. अतिरिक्त मध्यम में दो washes के आमतौर पर रक्त के सभी निशान को दूर करने के लिए पर्याप्त हैं. लेकिन अगर, परिषदessary, एक से एक ताजा 100 मिमी ठंड विच्छेदन मध्यम की 25-30 मिलीलीटर वाले पकवान का उपयोग धो लो.
- Stereomicroscope और घुमावदार संदंश का प्रयोग, त्वचा और खोपड़ी खींच द्वारा प्रत्येक चूहे के भ्रूण के मस्तिष्क निकाल सकते हैं. ठंड सीतनिद्रा में होना ई. के साथ 60 मिमी (आमतौर पर, पकवान प्रति अधिक से अधिक 5 दिमाग के साथ व्यंजन) बर्फ पर इन प्लेटों रखें पूरे दिमाग में रखें.
- एक समय में एक पकवान ले लो और एक विदारक खुर्दबीन के नीचे, गोलार्द्धों और अलग अलग मस्तिष्क cortices मध्यमस्तिष्क और तानिका हटाने.
- वैकल्पिक: midline के साथ कट दिमाग, hippocampi निकालने, प्रक्रिया और hippocampal न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए नीचे का पालन करें.
- 15 मिलीलीटर स्पष्ट शंक्वाकार ठंड सीतनिद्रा में होना ई. के 13 मिलीग्राम से युक्त बर्फ पर मस्तिष्क cortices छोड़ो जब तक सभी dissections को पूरा कर रहे हैं ट्यूब में विच्छेदित cortices लीजिए. अपने छोटे आकार के कारण, विच्छेदित hippocampi 1.5 मिलीलीटर की 15 मिलीलीटर की एक ट्यूब के बजाय Eppendorf ट्यूब में एकत्र किया जा सकता है. यदि इस कदम cortices में वांछित है, याhippocampi एक cryotube 1 मिलीलीटर वाली शीशी में रखा जा सकता है सीतनिद्रा में होना ई + 2% B27-+ Gentamicin (50 μg / एमएल) + cortices 2-4 या 2-4 hippocampi प्रति शीशी के अनुपात में Fungizone (एनजी 250 मिलीग्राम /). मस्तिष्क के ऊतकों को एक सप्ताह (बाद में बार अभी तक परीक्षण नहीं किया है) के लिए 4 ° C अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है. जब जरूरत है, ठीक संदंश का उपयोग एक 15 मिलीलीटर सीतनिद्रा में होना ई युक्त ट्यूब के मस्तिष्क के ऊतकों को हस्तांतरण और फिर नीचे प्रोटोकॉल का पालन न्यूरॉन्स अलग करने के लिए.
- एक ऊतक संस्कृति हुड ट्यूब स्थानांतरण. Cortices ट्यूब के नीचे के लिए व्यवस्थित करने के लिए और फिर ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने की अनुमति दें.
- 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब के लिए ताजा सीतनिद्रा में होना ई की 13 मिलीलीटर जोड़ें, की अनुमति cortices ट्यूब के नीचे बसा है और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने के. इस चरण को दोहराएँ 2 अधिक बार और, पिछले धोने के बाद, ध्यान से सभी मीडिया को हटाएं.
- गर्म Tr enzymatically 1-2 मिलीग्राम (hippocampi अलगाव के लिए कम उपयोग cortices की संख्या पर निर्भर करता है) को जोड़कर मस्तिष्क cortices को पचानेypLE एक्सप्रेस. Parafilm साथ ट्यूब की टोपी सील और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूब नाव.
- टोपी खोलने से पहले 70% इथेनॉल के साथ ट्यूब और स्प्रे सीतनिद्रा में होना ई. के 10 मिलीलीटर जोड़ने cortices ट्यूब के नीचे बसा है और सतह पर तैरनेवाला हटा दें. इस कदम के बाहर TrypLE एक्सप्रेस धो तीन बार दोहराएँ. अंतिम चरण में, ध्यान से सभी मीडिया को हटाएं.
- धीरे (4-5 बार) की Neurobasal/B27 पूरा मध्यम 2 मिलीलीटर में cortices एक आग पॉलिश कांच पाश्चर (व्यास में लगभग 1 मिमी) का उपयोग कर महीन चुर्ण बनाना. बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें.
- बाँझ व्यास में कांच पाश्चर छोटे विंदुक (यानी व्यास में 1/2-3/4 मिमी के बारे में एक विंदुक) के साथ एक और 4-5 बार दोहराएँ. इस से छोटे उपयोग नहीं पाश्चर विंदुक या यह कोशिकाओं को नष्ट कर देगा.
- ऊतक के शेष टुकड़े (आम तौर पर बहुत कुछ है, यदि कोई हो) व्यवस्थित करने की अनुमति दें.
- एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण करने के लिए ऊपरी एकल कक्ष निलंबन, ऊतक के टुकड़े बस छोड़ने के पीछे. फरवहाँ सेल निलंबन पतला Neurobasal/B27 पूरा मध्यम के साथ 10-12 मिलीलीटर.
- मिश्रण अच्छी तरह से और एक 1.5 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूब में 50x गिनती समाधान (देखें तालिका तृतीय) 490 μl सेल निलंबन के 10 μl जोड़कर गिनती के लिए कोशिकाओं को कमजोर.
- 5.0 10 2 4 सेमी / एक्स का घनत्व पर PDL में लिपटे प्लेटों पर थाली कोशिकाओं. यदि nucleofection प्रदर्शन किया जाना है, हम एक उच्च एकाग्रता (8-10 10 x 2 4 सेमी /) में कोशिकाओं चढ़ाना सलाह देते हैं.
- आम तौर पर, हम प्रयोग प्रति 9-10 भ्रूण है काटना, के रूप में लगभग 13 x 10 6 न्यूरॉन्स प्रत्येक E17 भ्रूण से निकाली गई है. यदि अधिक भ्रूण की जरूरत है, यकीन है कि पूरी प्रक्रिया दो घंटे से अधिक पिछले नहीं करता है.
- अगर वांछित, अलगाव के बाद 24 घंटे, साइटोसिन β-डी arabinofuranoside (AraC) के 10 माइक्रोन हर डिश के लिए जोड़ा जा सकता है, क्रम में glial प्रसार को रोकने. हालांकि, इस कदम बाद से Neurobasal/B27 मध्यम glial प्रसार को रोकता है की आवश्यकता नहीं है, के रूप में निर्माता की सिफारिशों के प्रति (/ Invitrogen Gibco).
- न्यूरॉन्स इन विट्रो में 4-5 दिनों के बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि सही समय वांछित भेदभाव चरण पर निर्भर करता है. हम अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण कमी (चित्रा 1) के बिना 4 हफ्तों के लिए सभ्य न्यूरॉन्स है.
- विस्तारित संवर्धन के लिए, संवर्धन मध्यम हौसले से तैयार Neurobasal/B27 पूरा मध्यम के साथ हर हफ्ते की जगह.
5. प्रतिनिधि परिणाम
कांच कक्ष स्लाइड पर सभ्य न्यूरॉन्स immunocytochemistry चित्रा 1 के अधीन किया जा सकता है एक cortical संस्कृति में पांच दिनों के बाद तय हो गई है और न्यूरॉन विरोधी मानचित्र - 2 एंटीबॉडी के साथ immunolabeled neuronal प्रक्रियाओं को दिखाने का एक विशिष्ट छवि को दर्शाता है.
चित्रा 2 संस्कृति में 3 सप्ताह के बाद एक चूहे hippocampal न्यूरॉन के एक प्रतिनिधि छवि से पता चलता है. मैं एक पूरी तरह से विभेदित सेल की neuronal morphology एमएपी-2 से प्रकाश डाला हैmmunolabeling (एमएपी 2 neuronal मार्कर, माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी क्लोन एपी-20, जीन TeX, Irvine, CA) के एक मानक प्रक्रिया के रूप में पहले 1 में वर्णित के बाद,. छवियों Nikon है ग्रहण E400 ईमानदार प्रतिदीप्ति (QImaging) EXi एक्वा कैमरा, मोटर जेड अक्ष, और में अधिग्रहण SlideBook5 / deconvolution सॉफ्टवेयर (इंटेलिजेंट इमेजिंग नवाचार इंक, डेन्वर, CO) के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के साथ देखे थे. प्रत्येक व्यक्ति के चित्र के तीन आयामी छवियों की एक श्रृंखला के एक चित्र है दो आयामी deconvoluted गया और संकेत का समायोजन कटौती बंद के पास अधिक से अधिक तीव्रता के संकल्प को बढ़ाने के द्वारा हल है.
चित्रा 3 neuronal संस्कृतियों की पवित्रता से पता चलता है. प्रोटीन lysates DIV7 चूहा neuronal संस्कृतियों (ctx) से और मानव glioblastoma (जीबीएम) के एक मामले से प्राप्त किया गया है. जैसी कि उम्मीद थी, neuronal lysate neuronal प्रोटीन एमएपी 2 और astrocytic मार्कर GFAP के लिए नकारात्मक के लिए दृढ़ता से सकारात्मक है, जबकि जीबीएम प्रोटीन lysate नकारात्मक च हैया 2-एमएपी और GFAP के लिए सकारात्मक है.
हालांकि हमारे प्रोटोकॉल में हम विदारक और rinsing के माध्यम के रूप में कई वर्षों के लिए किया गया है सीतनिद्रा में होना ई का उपयोग कर, हम हाल ही में यह एक अतिरिक्त और बहुत व्यावहारिक उपयोग करने के लिए आगे उपयोग के लिए मस्तिष्क के ऊतकों की रक्षा का पता लगाया है चित्रा 4 5 (DIV5) इन विट्रो में एक दिन दिखाता है चूहा प्रांतस्था सीतनिद्रा में होना + ई B27 में एक सप्ताह के लिए उनके मूल विच्छेदन के बाद भ्रूण से 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा cortices से अलग न्यूरॉन्स की संस्कृति. न्यूरॉन्स एक गिलास स्लाइड दो कक्ष के रूप में पहले वर्णित PDL और laminin के साथ लेपित पर चढ़ाया गया. छवि हासिल कर ली में अधिग्रहण SlideBook5 / deconvolution सॉफ्टवेयर के रूप में ऊपर वर्णित है (चित्रा 2) का उपयोग कर deconvoluted किया गया था.
चित्रा 1 एक cortical pmaxGFP (Amaxa, LONZA, वॉकर्सविल, एमडी) के साथ nucleofected और एमएपी के साथ immunolabeled न्यूरॉन के प्रतिनिधि छवि.-2 एंटीबॉडी, लाल रंग में. मूल बढ़ाई 100x.
चित्रा 2 प्रतिनिधि नक्शा दो immunolabeling के दिखा रहा है, लाल रंग में hippocampal न्यूरॉन्स की संस्कृति में 3 सप्ताह के बाद, छवि. DAPI धुंधला, नीले रंग में, सेलुलर नाभिक से पता चलता है. मूल बढ़ाई 40x.
चित्रा 3 पश्चिमी धब्बा दिखा neuronal सेल संस्कृतियों की पवित्रता. चूहा neuronal और मानव जीबीएम प्रोटीन lysates के 30 μg वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किए गए और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए मानक 1 प्रक्रियाओं का पालन किया जाता है. विरोधी एमएपी-2 एक सेल संकेतन (Danvers, एमए) से खरगोश पॉलीक्लोनल था, विरोधी GFAP प्रतिरक्षी Chemicon से मोनोक्लोनल (Millipore, Billerica, MA) माउस और माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी GRB2 बी.डी. पारगमन प्रयोगशालाओं से था ( स्पार्क्स, एमडी). GRB2 एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. 
चित्रा 4. इन विट्रो में 5 दिनों के प्रतिनिधि चित्रों (DIV5) चूहा प्रांतस्था में छोड़ दिया cortices से प्राप्त न्यूरॉन्स सीतनिद्रा में होना + ई उनके विच्छेदन के बाद एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर B27. एक) एक गिलास स्लाइड दो कक्ष पर सभ्य न्यूरॉन्स के चरण विपरीत. इज़ाफ़ा मूल 20X. बी) immunofluorescence neuronal प्रक्रिया में एमएपी-2 की अभिव्यक्ति दिखा, हरे रंग में है, संस्कृति नकारात्मक astrocytic मार्कर GFAP के लिए था. DAPI धुंधला, नीले रंग में, सेलुलर नाभिक को इंगित करता है. मूल बढ़ाई 40x.
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Discussion
विच्छेदन और चूहे hippocampal और cortical न्यूरॉन्स की संस्कृति की विधि यहाँ वर्णित लगभग शुद्ध neuronal एक रासायनिक परिभाषित मध्यम (चित्रा 3) में हो संस्कृतियों का उपयोग कर प्रयोगों प्रदर्शन की अनुमति देता है. हालांकि सीरम मुक्त मीडिया में संवर्धन लगभग शुद्ध न्यूरॉन्स के लिए प्रोटोकॉल के पहले किया गया है 2,3,4 वर्णित है, वहाँ महत्वपूर्ण हमारे विधि में किए गए परिवर्तन कर रहे हैं. पारंपरिक प्रोटोकॉल से अलग (यानी बैंकर एट अल.) 5, हम TrypLE एक्सप्रेस, एक अधिक सौम्य हदबंदी एंजाइम के साथ trypsin जगह ले ली है. हम भी दो कदम जो संभवतः neuronal कोशिकाओं की अखंडता को प्रभावित छोड़े गए है: नख़रेबाज़ cortices या hippocampi के enzymatic पाचन से पहले और DNase का उपयोग कर. इसके अलावा, भ्रूण के सीतनिद्रा में होना ई में विच्छेदन (4.2 कदम) व्यवहार्य और स्वस्थ कोशिकाओं को संरक्षित रखने में मदद की. सीतनिद्रा में होना ई एक पोषक तत्व परिवेश कार्बन डाइऑक्साइड का स्तर में तंत्रिका ऊतकों या कोशिकाओं के रखरखाव के लिए उपयोग (Invitrogen, जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड आइएसएल मध्यमऔर, एनवाई). मूल रूप से अलग मस्तिष्क क्षेत्रों (हिप्पोकैम्पस, striatum, और प्रांतस्था) शिपिंग के लिए तैयार है, सीतनिद्रा में होना ई मध्यम तंत्रिका ऊतक के अलगाव के दौरान मस्तिष्क व्यवहार्य रखने के लिए या माइक्रोस्कोपी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, या प्रवाह cytometry दौरान न्यूरॉन्स स्वस्थ रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दरअसल, चित्रा 4 चूहा प्रांतस्था दो कक्ष स्लाइड गिलास पर 5 दिनों के लिए सभ्य न्यूरॉन्स के एक प्रतिनिधि चित्र से पता चलता है. उनके प्रसंस्करण से पहले, cortices 4 में रखा गया था ° सीतनिद्रा में होना में सी और ई + E17 भ्रूण से अपने विच्छेदन के बाद एक सप्ताह के लिए अंधेरे में B27. दिलचस्प है, कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा ऊतक से अलग न्यूरॉन्स morphologically उन कि भ्रूण विच्छेदन के रूप में एक ही दिन पर अलग थे करने के लिए तुलनीय थे. भ्रूण का विच्छेदन के बाद अलग अलग समय पर अलग न्यूरॉन्स के विकल्प होने अत्यंत उपयोगी हो सकता है जब प्रयोगों की योजना बना, इसलिए समय गर्भवती पशु का पूरा उपयोग करने में कर सकते हैं.
यह mentione किया जाना चाहिएडी कि हमारी प्रोटोकॉल E13 से E17 के लिए भ्रूण पर कुशलता से काम करता है, लेकिन यह नवजात शिशु या वयस्क कृन्तकों के लिए किया गया कभी नहीं परीक्षण किया गया है. यह भी मानव भ्रूण न्यूरॉन्स (अप्रकाशित डेटा) का अलगाव और संस्कृति के लिए बहुत अच्छी तरह से काम किया.
यहाँ वर्णित विधि के साथ अलग कक्षों प्रयोगों है कि शाही सेना डीएनए / या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए कक्षों की एक बड़ी संख्या में कटाई की आवश्यकता के लिए टिशू कल्चर बर्तन में चढ़ाया जा सकता है. उदाहरण कुछ यौगिकों या एचआईवी जैसे -1 प्रोटीन पर हमारे काम में जैसे पेप्टाइड्स के साथ न्यूरॉन्स के उपचार में शामिल हैं. वृद्धि कारक की मध्यस्थता संकेत दे रास्ते भी जांच की जा सकता है या आरएनए जीन की अभिव्यक्ति या miRNA रूपरेखा arrays 6 के लिए शुद्ध किया जा सकता है.
इसके अतिरिक्त, चढ़ाना से पहले न्यूरॉन्स की nucleofection अणुओं या विकास की स्थिति कि neuronal 1 भेदभाव को प्रभावित की जांच के लिए उपकरण प्रदान करता है. अन्य अनुप्रयोगों 2000 lipofectamine द्वारा विभेदित न्यूरॉन्स की अभिकर्मक (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1. जबकि अभिकर्मक की क्षमता nucleofection की तुलना में काफी कम है, यह luciferase संवाददाता परख या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी पढ़ाई की तरह बहुत ही संवेदनशील assays के लिए उपयुक्त है. इसके अलावा, कांच कक्ष स्लाइड पर सभ्य न्यूरॉन्स immunocytochemistry (1 आंकड़े और 4B) 1 के अधीन किया जा सकता है. अंत में, हम सफलतापूर्वक इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए माउस 7 भ्रूण से तंत्रिका progenitors अंतिम चरण में जो अलग तंत्रिका progenitors को परिभाषित मध्यम में संवर्धित कर रहे हैं के रूप में पहले 7,8 वर्णित में एक संशोधन के साथ, अलग कर देना. कुल मिलाकर, इस सरल विधि आवेदनों की एक किस्म है और आसानी से अध्ययन है कि glia नहीं neuronal संस्कृतियों समर्थन की आवश्यकता के लिए न्यूरॉन्स प्रदान करता है. हालांकि, glial सह संस्कृति या glial व्युत्पन्न वातानुकूलित मध्यम इन neuronal संस्कृतियों के लिए जोड़ा जा सकता है synapse गठन की Pfrieger और बा द्वारा वर्णित अध्ययन के रूप में glial 9 कोशिकाओं द्वारा प्रेरित तंत्र की जांच10 rres.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Jonna एलिस संपादकीय सहायता के लिए धन्यवाद. मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से: वर्णित परियोजना पुरस्कार R01MH079751 संख्या (एफ Peruzzi PI) के द्वारा समर्थित किया गया है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0.5 mM | ||
| Table I. Neurobasal/B27 complete medium. | |||
| Glucose | 16 mM | ||
| Sucrose | 22 mM | ||
| HEPES | 10 mM | ||
| NaCl | 160 mM | ||
| KCl | 5 mM | ||
| Na2HPO4 | 1 mM | ||
| KH2PO2 | 0.22 mM | ||
| Gentamicin | 50 μg/ml | ||
| Fungizone | 250 ng/ml | ||
| pH | 7.4 | ||
| Osmolarity | 320-330 mOsm | ||
| Table II. Dissection medium. | |||
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 | ||
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 | ||
| Total | 490 | ||
| Table III. 50x Counting solution. | |||
| Hibernate E | Brainbits | 767171 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Glutamax 200 mM | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| TrypLE Express w/o phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 12604 | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Laminin 1 mg/ml | EMD Millipore | CC095 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250 | |
| Table IV. Specific reagents. | |||
| Stereo Microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B | |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 | |
| Razor-sharp scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6820 | |
| Micro Dissecting scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Micro Dissecting Curved scissors | Fine Science Tools | 14067-11 | |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 | |
| 60 mm dishes | BD Biosciences | 353002 | |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nalge Nunc international | 375353 | |
| Table V. Specific equipment. | |||
References
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