Summary
Vi beskriver en rask metode for å isolere og kultur hippocampus og kortikale nevroner fra gnagere embryoer. Denne protokollen tillater oss å utføre eksperimenter der nesten rene nevrale kulturer er nødvendig.
Abstract
Vi beskriver en rask metode for å skille og kultur hippocampus eller kortikale nevroner fra E15-17 rotte embryoer. Prosedyren kan brukes med hell til isolering av mus og menneskelige primære nerveceller og nevrale stamceller. Dissosiert nevroner er opprettholdt i serum-fri medium opptil flere uker. Disse kulturene kan brukes til nucleofection, immunocytochemistry, nukleinsyrer forberedelse, samt elektrofysiologi. Eldre nevrale kulturer kan også bli tilført med en god virkningsgrad ved lentiviral transduksjon og mindre effektivt, med kalsiumfosfat eller lipid-baserte metoder som lipofectamine.
Protocol
1. Poly-D-Lysine (PDL): Forberedelse
- Tilsett 5 ml sterilt DDH 2 O til 5 mg PDL å oppnå en stamløsning av 1 mg / ml.
- Bland stamløsning av pipettere flere ganger.
- Brukes umiddelbart eller lagre Poly-D-Lysine Solution ved 2-8 ° C.
2. Poly-D-Lysine (PDL): Coating Plast Cell Culture Dishes
- Fortynn PDL stamløsning med steril DDH 2 O til endelig konsentrasjon på 10 mikrogram / ml.
- Pipetter nok løsning i et 60 mm rett til å dekke kulturen areal (3 ml for en 60 mm rett).
- Rock forsiktig for å sikre enda belegg av kulturen overflaten.
- Inkuber belagte plater ved romtemperatur (RT) over natten.
- På den neste dagen, vanligvis dagen for disseksjon, fjerne Poly-D-Lysine Solution ved aspirasjon og vask kort med 3 ml steril DDH 2 O. Gjenta dette trinnet. Etter andre vask, fjerner vann helt av aspirasjon.
- Plater kan lagres ved 4 ° C i opptil tre uker.
3. Poly-D-Lysine (PDL) og Laminin: Forberedelse og Coating of Glass To-kammer Slides
- Mix PDL (1 mg / ml) og laminin (1 mg / ml) stamløsninger i sterile DDH 2 O til endelig konsentrasjon på 10 og 5 mikrogram / ml.
- Pipetter nok løsning i brønnene til et glass to-kammer skyve for å dekke kulturen areal (1 ml for hver brønn av en to godt glass med to kammer lysbilde).
- Rock forsiktig for å sikre enda belegg av kulturen overflaten.
- Inkuber belagte plater på RT natten.
- På den neste dagen, fjerne Poly-D-Lysine-Laminin belegg løsning via aspirasjon og vask kort to ganger med 1 ml steril DDH 2 O. Etter andre vask, fjerner vann helt av aspirasjon.
- Chamber lysbilder kan lagres ved 4 ° C i opptil tre uker.
Merk: Enhver glass kammer lysbilde kan være belagt following denne protokollen. Vi bruker ofte de to-kammer lysbilder fordi hvert lysbilde gir kontroll-test eksperimentell innstilling (f.eks ubehandlet versus behandlet, untransfected versus tilført).
4. Neuronal Dissection og kultur
- Varm følgende reagenser i en 37 ° C vannbad:
- TrypLE Express på sin opprinnelige 100 ml flaske.
- Neurobasal/B27 komplett medium (se tabell I). Volumet varmet avhenger av antall retter til å være belagt (f.eks 30 ml for ti 60 mm belagt retter).
- Legg 3 ml kald Hibernate E løsning til fire 60 mm kultur retter og 13 ml til 15 ml BD Falcon høy klarhet polypropylen konisk tube.
- Legg 25-30 ml kald disseksjon medium (se tabell II, Dr. Olimpia Meucci, personlig meddelelse) til hver av de tre 100 mm kultur retter. Disse platene, som inneholder en stor mengde medium, vil bli brukt til å vaske embryoer umiddelbart etter deresfjerning fra amniotic sekker (trinn 4.7 og 4.8).
- Avlive en E17 tidsbestemt gravid rotte av CO 2 i samsvar med Public Health Services politikk på Humane Stell og bruk av forsøksdyr og under en institusjonelt godkjent dyr omsorg og bruke protokollen.
- Spray nedre del av magen med 70% EtOH og skjære medialt gjennom huden og musklene med en saks utsette livmoren og embryoer.
- Fjern alle fostre og plassere dem i en steril 100 mm fatet inneholder et overskudd av kald disseksjon medium (25-30 ml, se trinn 4.3).
- Skjær embryo ved hjelp av en liten saks fra amniotic sac og plassere dem i andre 100-mm fatet inneholder kald disseksjon medium.
- Vask embryoene ved romtemperatur ved å forsiktig vippe 100 mm rett i 5-10 sekunder. Deretter overfører skylt embryoene som den tredje 100 mm fatet inneholder dissekere medium. To vasker i overkant medium er vanligvis tilstrekkelig å fjerne alle spor av blod. Men hvis NECessary, vaske en gang til med en frisk 100-mm fatet inneholder 25-30 ml kald disseksjon medium.
- Ved hjelp av et stereomikroskop og buet tang, trekke ut hver rotte embryo hjerne ved å trekke ut huden og hodeskallen. Plasser hele hjernen i en av de 60 mm-retter (typisk, med ikke mer enn fem hjerner per fat) med kald Hibernate E. Oppbevar disse platene på is.
- Ta en tallerken om gangen, og under en dissekere mikroskop, skille de halvkulene og isolere cerebrale cortices fjerne midbrain og hjernehinnene.
- Valgfritt: snitt hjerner langs midtlinjen, trekke hippocampi, og følg fremgangsmåten nedenfor for å isolere hippocampus nevroner.
- Samle alle de dissekerte cortices i en 15-ml klar konisk rør som inneholder 13 ml kald Hibernate E. La cerebrale cortices på is inntil alle disseksjoner er fullført. På grunn av sin lille størrelse, kan dissekert hippocampi samles i en 1,5-ml Eppendorf rør i stedet for en 15-ml tube. Hvis ønskelig, på dette trinnet cortices ellerhippocampi kan plasseres i en cryotube hetteglass inneholder 1 ml av Hibernate E + 2% B27 + Gentamicin (50 mikrogram / ml) + Fungizone (250 ng / ml) i andelen 2-4 cortices eller 2-4 hippocampi per hetteglass. Hjernevev kan lagres ved 4 ° C i mørke i opptil en uke (senere tider ikke har testet ennå). Ved behov, kan du bruke fin pinsett til å overføre hjernevevet til en 15 ml tube inneholder Hibernate E og deretter følge opplegget nedenfor for å isolere nerveceller.
- Overfør røret til en vev kultur hette. La cortices å bosette til bunnen av røret, og deretter forsiktig fjerne supernatanten.
- Legg 13 ml av frisk Hibernate E til 15-ml konisk tube, la cortices slå seg ned ved bunnen av røret og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet 2 ganger, og etter siste vask, fjerner alle medier.
- Enzymatisk fordøye cerebrale cortices ved å legge 1-2 ml (avhengig av antall cortices, bruke mindre for hippocampi isolering) av varme TrypLE Express. Tett hetten av røret med Parafilm og flyte røret i en 37 ° C vannbad i 10 minutter.
- Spray røret med 70% etanol før du åpner lokket og tilsett 10 ml av Hibernate E. La cortices å bosette i bunnen av røret og fjern supernatanten. Gjenta dette trinnet tre ganger for å vaske ut TrypLE Express. I siste trinnet, fjerner alle medier.
- Forsiktig triturate (4-5 ganger) de cortices i 2 ml Neurobasal/B27 komplett medium ved hjelp av en brann-polert glass Pasteur (ca. 1 mm i diameter). Vær forsiktig for å unngå bobler.
- Gjenta ytterligere 4-5 ganger med en steril glass Pasteur pipette mindre i diameter (dvs. en pipette om 1.2 til 3.4 mm i diameter). Ikke bruk en Pasteur pipette mindre enn dette, eller det vil ødelegge cellene.
- La rester av vev (generelt svært få, om noen) å avgjøre.
- Overfør den øvre encellet suspensjon til en ny 15-ml tube, etterlot slo biter av vev. Further fortynne cellesuspensjon opp til 10-12 ml med Neurobasal/B27 komplett medium.
- Bland godt og fortynne celler for telling ved å tilsette 10 mL av cellesuspensjon til 490 mL av 50x Counting Solution (se tabell III) i et 1,5 ml Eppendorf rør.
- Plate celler på PDL-belagte plater på tettheten av 5,0 x 10 4 / cm 2. Hvis nucleofection skal utføres, anbefaler vi platekledning cellene ved høyere konsentrasjon (8-10 x 10 4 / cm 2).
- Normalt dissekere vi 9-10 fostre per eksperiment, som ca 13 x 10 6 nevroner er utledet fra hver E17 fosteret. Dersom flere embryoer er nødvendig, sørge for at hele prosedyren ikke vare mer enn to timer.
- Hvis ønskelig, 24 timer etter isolasjon, kan 10 mm av cytosin-β-D-arabinofuranoside (AraC) legges til hver rett, for å forhindre glial spredning. Imidlertid er dette trinnet ikke nødvendig siden Neurobasal/B27 medium hemmer glial spredning, Som per produsentens anbefalinger (Invitrogen / Gibco).
- Nerveceller kan brukes til forsøk etter 4-5 dager in vitro, men nøyaktig tidspunkt er avhengig av ønsket differensiering scenen. Vi har kulturperler neurons for inntil 4 uker uten en betydelig reduksjon i overlevelse (figur 1).
- For utvidet dyrking, erstatte dyrking medium hver uke med nylaget Neurobasal/B27 komplett medium.
5. Representative Resultater
Nerveceller dyrket på glass kammerkor lysbilder kan bli utsatt for immunocytochemistry. Figur 1 viser en typisk bilde av en kortikal nervecellen fikset etter fem dager i kultur og immunolabeled med anti-MAP-2 antistoff for å vise nevronale prosesser.
Figur 2 viser et representativt bilde av en rotte hippocampus nevron etter 3 uker i kulturen. Den nevronal morfologi en fullt differensiert celle er markert med MAP-2 immunolabeling (MAP-2 neuronal markør, monoklonalt antistoff klone AP-20, Gene Tex, Irvine, CA), etter en standard prosedyre som tidligere beskrevet en. Bildene var visualisert med Nikon Eclipse E400 oppreist fluorescens mikroskop utstyrt med Exi aqua kamera (Qimaging), motorisert Z-aksen, og SlideBook5 oppkjøp / deconvolution programvare (Intelligent Imaging Innovations, Inc., Denver, CO). En rekke tredimensjonale bilder av hvert enkelt bilde ble deconvoluted til en to-dimensjonalt bilde og løses ved å justere signalet cut-off til nær maksimal intensitet for å øke oppløsningen.
Figur 3 viser renhet nevrale kulturer. Protein lysates ble innhentet fra DIV7 rotte nevrale kulturer (ctx) og fra et tilfelle av menneskelig glioblastoma (GBM). Som forventet er det nevronale lysate sterkt positivt for nevronale protein MAP-2 og negativt for astrocytic markør GFAP, mens GBM protein lysate er negativ feller MAP-2 og positiv for GFAP.
Selv i protokollen vår har vi brukt Hibernate E for flere år som dissekere og skylling medium, nylig har vi utforsket en ekstra og svært praktisk bruk av det å bevare hjernen vev for videre bruk. Figur 4 viser noen dager in vitro 5 (DIV5) kultur av rotte kortikale nevroner isolert fra cortices holdt ved 4 ° C i en uke i Hibernate E + B27, etter deres opprinnelige disseksjon fra embryoer. Nevronene ble belagt på et glass to-kammer lysbilde belagt med PDL og laminin som tidligere beskrevet. Den overtatte Bildet ble deconvoluted hjelp SlideBook5 kjøp / deconvolution programvare som beskrevet ovenfor (figur 2).
Figur 1. Representant bilde av en kortikal nervecellen nucleofected med pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) og immunolabeled med MAP-2 Antistoff, i rødt. Opprinnelig forstørrelse 100x.
Figur 2. Representant bilde som viser MAP-2 immunolabeling, i rødt, av hippocampus nevroner etter 3 uker i kulturen. DAPI farging, i blått, viser mobilnettet kjerner. Opprinnelig forstørrelse 40x.
Figur 3. Western blot viser renhet nevronale cellekulturer. 30 mikrogram av rotter nevrale og menneskelig GBM protein lysates ble separert av elektroforese og utsatt for Western blot analyse etter standard prosedyrer 1. Anti-MAP-2 var en kanin polyklonale fra cellesignalisering (Danvers, MA), var anti-GFAP antistoff monoklonalt fra Chemicon (Millipore, Boston, MA), og den monoklonalt anti-GRB2 antistoff var fra BD transduksjon Laboratories ( Sparks, MD). GRB2 ble brukt som en lasting kontroll. 
Figur 4. Representative bilder av dager in vitro 5 (DIV5) rotte kortikale nevroner hentet fra cortices igjen i Hibernate E + B27 ved 4 ° C i en uke etter disseksjon deres. A) fasekontrast av nerveceller dyrket på et glass to-kammer lysbilde. Opprinnelig forstørrelse 20X. B) Immunfluorescens viser uttrykk for MAP-2 i nevrale prosesser, i grønt, kulturen var negativ for astrocytic markør GFAP. DAPI farging, i blått, indikerer mobilnettet kjerner. Opprinnelig forstørrelse 40x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden for disseksjon og kultur av rotter hippocampus og kortikale nevroner beskrevet her kan utføre eksperimenter med nesten rene nevrale kulturer dyrket i en kjemisk definert medium (figur 3). Selv protokoller for dyrking nesten rene nevroner i serum-frie medier har tidligere blitt beskrevet 2,3,4, det er viktige endringer i vår metode. Forskjellig fra tradisjonelle protokoller (dvs. Banker et al.) 5, vi har erstattet trypsin med TrypLE Express, en mer skånsom dissosiasjon enzym. Vi har også utelatt to trinn som potensielt påvirker integriteten nevrale celler: trippende av cortices eller hippocampi før enzymatisk fordøyelse og bruke DNase. Også hjalp disseksjon av embryoer i Hibernate E (trinn 4,2) for å bevare levedyktige og sunne celler. Hibernate E er et næringsstoff medium utnyttes til vedlikehold av nervevev eller celler i omgivelsene karbondioksid (Invitrogen, Life Technologies, Grand Islog, NY). Opprinnelig utviklet for frakt av isolerte områder av hjernen (hippocampus, striatum, og cortex), kan Hibernate E medium brukes til å holde hjernen levedyktig under isolering av nevrale vev eller å holde nevroner frisk under mikroskopi, elektrofysiologi eller flowcytometri. Faktisk viser figur 4 et representativt bilde av rotte kortikale nevroner dyrket i 5 dager på glass to-kammer lysbilder. Før behandling deres ble cortices holdt ved 4 ° C i Hibernate E + B27 i mørket for en uke, etter deres disseksjon fra E17 embryoer. Interessant var nevroner isolert fra vev holdt ved 4 ° C i noen dager morfologisk sammenlignbare med de som ble isolert på de samme dagene som embryo disseksjon. Å ha muligheten til å isolere nevroner på forskjellige tidspunkter etter disseksjon av embryoene kan være svært nyttig ved planlegging eksperimenter, og derfor i å gjøre en full bruk av time-gravide dyr.
Det bør mentioned at vår protokollen virker effektivt på befruktede egg fra E13 til E17, men det har aldri blitt testet for nyfødte eller voksen gnagere. Det har også fungert veldig bra for isolering og kultur av humane føtale nerveceller (upubliserte data).
Celler isolert med metoden som er beskrevet her kan belagt i vevskulturstudier retter for eksperimenter som krever høsting et stort antall celler for RNA / DNA eller protein ekstraksjon. Eksempler inkluderer behandling av nevroner med noen forbindelser eller peptider, som for eksempel i arbeidet med HIV-Tat protein 1. Vekstfaktor-mediert signalveier kan også bli etterforsket eller RNA kan bli renset for genekspresjon eller miRNA profilering arrays 6.
I tillegg gir nucleofection av nervecellene før plating et verktøy for å undersøke molekyler eller vekstvilkår som påvirker nevronal differensiering en. Andre bruksområder er transfeksjon av differensierte nevroner ved lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, California) 1. Mens effektiviteten av transfeksjon er ganske lav i forhold til nucleofection, er det egnet for svært sensitive analyser som luciferase reporter analysen eller elektrofysiologiske studier. I tillegg kan nerveceller dyrket på glasset kammeret slides bli utsatt for immunocytochemistry (figur 1 og 4b) 1. Til slutt, vi lykkes fulgt denne protokollen å distansere nevrale stamceller fra mus embryoer 7, med en endring i siste trinn der isolerte nevrale stamceller dyrkes i et definert medium som tidligere beskrevet 7,8. Samlet har dette enkle metoden en rekke applikasjoner og enkelt gir nevroner for studier som ikke krever gliaceller å støtte nevrale kulturer. Imidlertid kan glial co-kultur eller glial-derived conditioned medium legges til disse nevrale kulturene å undersøke mekanismer for synapse dannelse indusert av gliacellene 9, for eksempel studier beskrevet av Pfrieger og Barres 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Jonna Ellis for redaksjonell hjelp. Prosjektet beskrives ble støttet av Award Antall R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) fra National Institute of Mental Health. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn av National Institute of Mental Health eller National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal | 98% | ||
| B27 | 2% | ||
| Glutamax | 0.5 mM | ||
| Table I. Neurobasal/B27 complete medium. | |||
| Glucose | 16 mM | ||
| Sucrose | 22 mM | ||
| HEPES | 10 mM | ||
| NaCl | 160 mM | ||
| KCl | 5 mM | ||
| Na2HPO4 | 1 mM | ||
| KH2PO2 | 0.22 mM | ||
| Gentamicin | 50 μg/ml | ||
| Fungizone | 250 ng/ml | ||
| pH | 7.4 | ||
| Osmolarity | 320-330 mOsm | ||
| Table II. Dissection medium. | |||
| Neurobasal/B27 complete medium | 240 | ||
| Trypan Blue Stain 0.4% | 250 | ||
| Total | 490 | ||
| Table III. 50x Counting solution. | |||
| Hibernate E | Brainbits | 767171 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Fungizone | GIBCO, by Life Technologies | 15290-018 | |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G1264 | |
| Glutamax 200 mM | GIBCO, by Life Technologies | 35050 | |
| TrypLE Express w/o phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 12604 | |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma Aldrich | C6645 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Laminin 1 mg/ml | EMD Millipore | CC095 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250 | |
| Table IV. Specific reagents. | |||
| Stereo Microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| Large Forceps | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Fine-tipped forceps | Moria | MC40B | |
| Micro fine-tipped forceps | Moria | MC31 | |
| Razor-sharp scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6820 | |
| Micro Dissecting scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Micro Dissecting Curved scissors | Fine Science Tools | 14067-11 | |
| Glass 2-chamber slides | Lab-Tek | 154461 | |
| 60 mm dishes | BD Biosciences | 353002 | |
| 100 mm dishes | Corning | 430167 | |
| 15 ml tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| 1.5 ml cryo-tube vial | Nalge Nunc international | 375353 | |
| Table V. Specific equipment. | |||
References
- Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
- Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , The MIT Press. Cambridge. (1998).
- Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
- Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
- Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
- Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).
