Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол

Published: May 24, 2012 doi: 10.3791/3965

Summary

Мы описываем методологию быстрой, чтобы изолировать и культуры гиппокампе и коре нейроны от грызунов эмбрионов. Этот протокол позволяет проводить эксперименты, в которых почти чистой культуры нейронов не требуется.

Abstract

Мы описываем быстрый способ отделить и культуры гиппокампа и коры нейроны от E15-17 крысиных эмбрионов. Эта процедура может быть успешно применен для выделения мышиных и человеческих первичных нейронов и нейронных предшественников. Диссоциированных нейронов поддерживается в бессывороточной среде до нескольких недель. Эти культуры могут быть использованы для nucleofection, иммуноцитохимия, нуклеиновых кислот подготовки, а также электрофизиологии. Пожилые нейронов культуры можно трансфекции с хорошей скоростью эффективность лентивирусов трансдукции и менее эффективно, с фосфатом кальция или на основе липидов такие методы, как липофектамина.

Protocol

1. Поли-D-лизин (PDL): Подготовка

  1. Добавьте 5 мл стерильной DDH 2 O 5 мг PDL для получения маточного раствора 1 мг / мл.
  2. Смешайте маточного раствора с помощью пипетки несколько раз.
  3. Используйте сразу или хранить поли-D-лизин решения при температуре 2-8 ° C.

2. Поли-D-лизин (PDL): Покрытие пластиковой посуды культуре клеток

  1. Развести PDL маточного раствора стерильной DDH 2 O в конечной концентрации 10 мкг / мл.
  2. Внесите достаточно раствора в 60 мм блюдо для покрытия культуры поверхности (3 мл на 60 мм блюдо).
  3. Рок осторожно, чтобы обеспечить ровное покрытие культуры поверхности.
  4. Выдержите покрытие пластин при комнатной температуре (RT) в течение ночи.
  5. На следующий день, как правило, в день вскрытия, удаления поли-D-лизин Решение стремление и промойте кратко с 3 мл стерильной DDH 2 O. Повторите этот шаг. После второго мытья, удаления воды полностью аспирации.
  6. Плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение трех недель.

3. Поли-D-лизин (PDL) и Ламинин: подготовка и покрытие стекла двухпалатный Слайды

  1. Mix PDL (1 мг / мл) и ламинин (1 мг / мл) растворы в стерильных DDH 2 O до конечной концентрации 10 и 5 мкг / мл, соответственно.
  2. Внесите достаточно раствора в лунки стекло двухкамерного слайд, чтобы покрыть площадь поверхности культуры (1 мл на каждую лунку 2 и стекло двухкамерного слайд).
  3. Рок осторожно, чтобы обеспечить ровное покрытие культуры поверхности.
  4. Выдержите покрытие пластин при комнатной температуре на ночь.
  5. На следующий день, удалить поли-D-лизин-Ламинин раствор для покрытия через стремление и промойте кратко в два раза с 1 мл стерильной DDH 2 O. После второго мытья, удаления воды полностью аспирации.
  6. Палата слайды могут храниться при температуре 4 ° С до трех недель.

Примечание: Любое предметное стекло камеры могут быть покрыты followinг этого протокола. Мы часто используем двухкамерный слайды, потому что каждый слайд обеспечивает контроль испытания экспериментальной установки (например, по сравнению с необработанной лечение, по сравнению с нетрансфицированных трансфекции).

4. Вскрытие нейронов и культуры

  1. Теплый следующие реагенты при 37 ° С на водяной бане:
    • TrypLE Экспресс на первоначальных 100 мл флакон.
    • Neurobasal/B27 полной среде (см. таблицу I). Объем подогревается в зависимости от количества блюд, что покрытие (например, 30 мл в течение десяти 60 мм покрытие посуда).
  2. Добавьте 3 мл холодной решение Hibernate E-четыре 60 мм культуры блюд и 13 мл до 15 мл BD Сокол высокой четкости полипропилена конической трубе.
  3. Добавить 25-30 мл холодной среды вскрытия (см. таблицу II, д-р Олимпия Meucci, личное сообщение) в каждой из трех блюд 100 мм культуры. Эти пластины, содержащей большой объем среды, будут использованы для мытья эмбрионы сразу после ихУдаление из амниотической мешка (шаги 4.7 и 4.8).
  4. Эвтаназии E17 своевременной беременных крыс по CO 2 в соответствии с здравоохранении политики на гуманное лечение и использования лабораторных животных и в институциональном утвержденного ухода за животными и использовать протокол.
  5. Спрей нижней части живота с 70% этанола и сократить медиально через кожу и мышцы с ножницами подвергая матки и эмбрионов.
  6. Удалите все плоды и поместить их в стерильную 100-мм блюдо с более холодной среды рассечение (25-30 мл, см. п. 4.3).
  7. Вырезать эмбрионов с помощью небольшого ножницы из амниотической полости и разместить их во второй 100-мм блюдо с холодной среды рассечение.
  8. Промойте эмбрионы при комнатной температуре, слегка наклоняя 100-мм блюдо в течение 5-10 секунд. Затем перенесите промытый эмбрионов третий 100 мм блюдо с рассечения среды. Два моет более среднего, как правило, достаточно, чтобы удалить все следы крови. Однако, если NECessary, мыть одно время с помощью новой 100-мм блюдо с 25-30 мл холодной среды рассечение.
  9. Использование стереомикроскоп и изогнутых щипцов, извлечение мозга каждой крысы эмбриона, потянув за кожей и черепом. Положите весь мозг в одном из 60-мм блюда (как правило, не более чем на 5 мозги на блюдо) с холодным Hibernate Е. Храните эти пластины на льду.
  10. Возьмите одно блюдо в то время, и при вскрытии микроскоп, разделить и изолировать полушарий головного коры удаления мозга и мозговых оболочек.
  11. Дополнительно: разрез по средней линии мозга, гиппокампе извлечь, и следуйте приведенным ниже инструкциям, чтобы изолировать нейронов гиппокампа.
  12. Соберите все расчлененный коры в 15 мл коническую ясно пробирку, содержащую 13 мл холодной Hibernate Е. Оставьте кору головного мозга на льду, пока все вскрытия будут завершены. Из-за своих небольших размеров, расчлененный гиппокампе может быть собрана в 1,5 мл Eppendorf трубки вместо 15 мл трубку. При необходимости на этом этапе коры илигиппокампе может быть помещен в криоскопической пробирки флакон, содержащий 1 мл Hibernate E + 2% B27 + гентамицин (50 мкг / мл) + Fungizone (250 нг / мл) в соотношении 2-4 или 2-4 коре гиппокампа в одном флаконе. Мозговая ткань может храниться при температуре 4 ° С в темное время суток на срок до одной недели (более поздние времена не тестируется пока). При необходимости использовать тонкий пинцет для передачи ткани головного мозга в 15 мл пробирку с Hibernate E, а затем следовать протоколу ниже, чтобы изолировать нейронов.
  13. Передайте трубку капот культуре ткани. Позвольте коры осели на дне пробирки, а затем осторожно удалить супернатант.
  14. Добавить 13 мл свежего E Hibernate в 15 мл коническую трубку, позволяющие коры оседают на дне пробирки и тщательно удалите супернатант. Повторите этот шаг еще 2 раза, а после последнего мытья, аккуратно удалите все средства массовой информации.
  15. Ферментативно переварить кору головного мозга, добавив 1-2 мл (в зависимости от количества коры, использовать меньше изоляции гиппокампе) теплой ТрypLE Express. Закройте крышку трубки с парафильмом и плавать трубки в 37 ° С на водяной бане 10 минут.
  16. Спрей трубка с 70% этанола, прежде чем открывать крышку и добавить 10 мл Hibernate Е. Позвольте коры, чтобы поселиться в нижней части трубы и удалите супернатант. Повторите этот шаг в три раза промыть TrypLE Express. В последний шаг, тщательно удалить все средства массовой информации.
  17. Осторожно растереть (4-5 раз) коры в 2 мл Neurobasal/B27 полной среде с использованием пожарной полированного стекла Пастера (примерно 1 мм в диаметре). Будьте осторожны, чтобы избежать пузырей.
  18. Повторить 4-5 раз другой стерильной стеклянной пипетки Пастера меньше в диаметре (т.е. пипетка о 1/2-3/4 мм в диаметре). Не используйте пипетку Пастера меньше этого или он будет разрушать клетки.
  19. Позвольте оставшихся кусочков ткани (как правило, очень немногие, если таковые имеются), чтобы обосноваться.
  20. Передача верхней одной клеточной суспензии в новый 15-мл трубку, оставив поселились кусочки ткани. Мехше, разбавленные суспензии клеток до 10-12 мл Neurobasal/B27 полной среде.
  21. Хорошо перемешайте и разбавьте для подсчета клеток путем добавления 10 мкл клеточной суспензии до 490 мкл 50x Решение подсчет (см. таблицу III) в 1,5 мл Eppendorf трубку.
  22. Пластина клеток на PDL-покрытие пластин при плотности 5,0 х 10 4 / см 2. Если nucleofection должны быть выполнены, мы рекомендуем нанесение клеток при более высокой концентрации (8-10 х 10 4 / см 2).
  23. Как правило, мы проанализируем 9-10 плодов в эксперименте, так как примерно 13 х 10 6 нейронов, полученных от каждого E17 плода. Если больше эмбрионов необходимы, чтобы убедиться, что вся процедура длится не более двух часов.
  24. При желании, через 24 часа после изоляции, 10 мкМ цитозин-β-D-арабинофуранозида (AraC) могут быть добавлены к каждому блюду, в целях предотвращения распространения глии. Тем не менее, этот шаг не требуется, поскольку Neurobasal/B27 среднего подавляет пролиферацию глиальных, В соответствии с рекомендациями производителя (Invitrogen / Gibco).
  25. Нейроны могут быть использованы для экспериментов, через 4-5 дней в лабораторных условиях, хотя точное время зависит от желаемой стадии дифференцировки. У нас есть культивируемых нейронов на срок до 4 недель без существенного снижения выживаемости (рис. 1).
  26. Для длительного культивирования, замене культивирования средних каждую неделю с свежеприготовленный Neurobasal/B27 полной среде.

5. Представитель Результаты

Нейроны культивировали на предметные стекла камеры могут быть подвергнуты иммуноцитохимия. На рисунке 1 показан типичный образ корковых нейронов установлен после пяти дней в культуре и immunolabeled с анти-MAP-2 антител, чтобы показать нейронных процессов.

На рисунке 2 показан представитель образ нейронов гиппокампа крыс через 3 недели в культуре. Морфологии нейронов полностью дифференцированных клеток выделяется МАП-2 яmmunolabeling (MAP-2 нейронов маркер мышиных моноклональных антител клона AP-20, Джин Tex, Irvine, CA), следуя стандартной процедуре, как описано выше 1. Изображения были визуализированы с Nikon Eclipse E400 вертикально флуоресцентный микроскоп оснащен EXI аква камеры (Qimaging), моторизованный Z-оси, а SlideBook5 приобретение / деконволюции программного обеспечения (Intelligent изображений Innovations, Inc, Денвер, Колорадо). Серии трехмерных изображений каждого картины были deconvoluted одного двумерного изображения и решены путем изменения сигнала отключение почти до максимальной интенсивности увеличить разрешение.

На рисунке 3 показана чистота нейронных культур. Белки лизатов были получены из нейронов крысы DIV7 культур (CTX), а также случай человеческой глиобластомы (GBM). Как и ожидалось, нейронные лизат сильно положительным для нейронов белки MAP-2 и отрицательной астроцитов GFAP маркером, тогда как GBM лизат белков отрицательный еили MAP-2 и положительный для GFAP.

Хотя в нашей протокола мы используем Hibernate E в течение нескольких лет, рассечения и промывки среды, недавно мы рассмотрели дополнительные и очень практично использовать его для сохранения тканей мозга для дальнейшего использования. На рисунке 4 показана дней в пробирке 5 (DIV5) Культура крысы корковых нейронов изолированной от коры хранить при температуре 4 ° C в течение одной недели в Hibernate E + B27 после их первоначального вскрытия из эмбрионов. Нейроны высевали на стекло двухкамерного слайд покрыты PDL и ламинин, как описано выше. Полученные изображения были deconvoluted использованием SlideBook5 приобретение / деконволюции программное обеспечение, как описано выше (рис. 2).

Рисунок 1
Рисунок 1. Представитель образ корковых нейронов nucleofected с pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) и immunolabeled с ПДЧ-2 Антител, в красный цвет. Оригинальный увеличение 100x.

Рисунок 2
Рисунок 2. Представителю изображение, показывающее MAP-2 immunolabeling, красный, нейронов гиппокампа через 3 недели в культуре. DAPI окрашивания, в синем, показывает, клеточных ядер. Оригинальный увеличение 40x.

Рисунок 3
Рисунок 3. Вестерн-блот показывает чистоту нейронов клеточных культурах. 30 мкг крыс и человеческих нейронов лизатов GBM белки были разделены с помощью электрофореза и подвергается Вестерн-блот анализе в соответствии со стандартными процедурами 1. Anti-MAP-2 кролика поликлональных из клеточной сигнализации (Денвер, штат Массачусетс), анти-GFAP антителами было мышиных моноклональных от Chemicon (Millipore, Billerica, MA), и мышиных моноклональных анти-Grb2 антител был из лаборатории BD трансдукция ( Sparks, MD). Grb2 был использован в качестве управления загрузкой. Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель фотографии дней в пробирке 5 (DIV5) корковых нейронов крысы получена из коры остается в Hibernate E + B27 при 4 ° С в течение одной недели после их вскрытия. А) фазового контраста нейроны культивировали на стекло двухкамерного слайдов. Оригинальный увеличение 20X. B) иммунофлуоресценции показывает выражение MAP-2 в нейронных процессах, в зеленом, культура была отрицательной для астроцитов GFAP маркером. DAPI окрашивания, в синем, указывает клеточных ядер. Оригинальный увеличение 40x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод вскрытия и культуры гиппокампа крыс и корковых нейронов описаны здесь позволяет проводить эксперименты с использованием почти чистый нейронных культур, выращенных в химически определенной среде (рис. 3). Хотя протоколы для культивирования почти чистый нейронов в сыворотке крови, свободные средства массовой информации были ранее описаны 2,3,4, есть важные изменения, внесенные в наш метод. В отличие от традиционных протоколов (например, банкир и др.). 5, мы заменили трипсина с TrypLE Express, более мягкий диссоциации фермента. Мы также опущены шаги, которые потенциально повлиять на целостность нервных клеток: мясорубки из коры или гиппокампа до ферментативного пищеварения и использование ДНКазы. Кроме того, вскрытие эмбрионов в спящий режим E (шаг 4.2) помогли сохранить жизнеспособные и здоровые клетки. Hibernate Е является питательной среды использовались для поддержания нервной ткани и клеток в окружающей уровня диоксида углерода (Invitrogen, Life Technologies, Grand Islи Нью-Йорк). Первоначально разработана для доставки изолированных областях мозга (гиппокамп, полосатое тело и коры), Hibernate E среду можно использовать для поддержания жизнеспособного мозга в изоляции нервных тканей или сохранить здоровые нейроны в цитометрии микроскопии, электрофизиологии или потока. Действительно, на рисунке 4 показана репрезентативную картину корковых нейронов крыс культивировали в течение 5 дней на стекло двухкамерного слайдов. До их обработки, коры хранились при температуре 4 ° С в Hibernate E + B27 в темное время суток в течение одной недели после их вскрытия от E17 эмбрионов. Интересно, что нейроны, выделенные из тканей хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких дней были морфологически сопоставимыми с теми, которые были выделены на эти же дни, как эмбрион вскрытие. Имея возможность изоляции нейронов в разное время после вскрытия эмбрионы могут быть чрезвычайно полезными при планировании экспериментов и, следовательно, в обеспечении полного использования времени беременных животных.

Следует mentioneг, что наш протокол работает эффективно на эмбрионах с E13 по E17, но она никогда не была испытана для новорожденных и взрослых грызунов. Он также работал очень хорошо для изоляции и культуру человеческого плода нейронов (неопубликованные данные).

Клетки, выделенные с методом, описанным здесь, могут быть покрыты в блюдах культуры тканей для экспериментов, которые требуют сбора большого количества клеток на РНК / ДНК или белка добычи. Примеры включают в себя лечение с нейронами некоторых соединений или пептиды, например, в нашей работе по борьбе с ВИЧ-Tat белок 1. Фактор роста-опосредованной сигнальных путей может быть следствием или РНК могут быть очищены на экспрессию гена или массивы микроРНК профилирования 6.

Кроме того, nucleofection нейронов до покрытие представляет собой инструмент для исследования молекул или условий роста, которые влияют на дифференциацию нейронов 1. Другие области применения включают трансфекцию дифференцированных нейронов липофектамина 2000 (InvitrOgen, Карлсбад, Калифорния) 1. В то время как эффективность трансфекции является довольно низким по сравнению с nucleofection, он подходит для очень чувствительной анализов, как люциферазы анализа репортера или электрофизиологии исследований. Кроме того, нейроны культивировали на слайдах стеклянной камере может быть подвергнут иммуноцитохимии (рис. 1 и 4, б) 1. Наконец, мы успешно следуют этому протоколу отделить нейронных предшественников из мышиных эмбрионов 7, с изменением в последнем шаге, в которых изолированная нейронных предшественники культивировали в определенной среде, как описано выше 7,8. В целом, этот простой метод имеет целый ряд приложений и легко обеспечивает нейронов для исследований, которые не требуют глии для поддержки нейронных культур. Тем не менее, глиальные совместной культуры и глиальных производных кондиционированной среды могут быть добавлены в этих нейронных культур для изучения механизмов формирования синапсов индуцированных клеток глии 9, такие как исследования описывается Pfrieger и BaRres 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Jonna Ellis за помощь в редактировании. Проект описан была поддержана премии Количество R01MH079751 (PI: Ф. Перуцци) из Национального института психического здоровья. Содержания несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института психического здоровья и Национального института здоровья.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal 98%
B27 2%
Glutamax 0.5 mM
Table I. Neurobasal/B27 complete medium.
Glucose 16 mM
Sucrose 22 mM
HEPES 10 mM
NaCl 160 mM
KCl 5 mM
Na2HPO4 1 mM
KH2PO2 0.22 mM
Gentamicin 50 μg/ml
Fungizone 250 ng/ml
pH 7.4
Osmolarity 320-330 mOsm
Table II. Dissection medium.
Neurobasal/B27 complete medium 240
Trypan Blue Stain 0.4% 250
Total 490
Table III. 50x Counting solution.
Hibernate E Brainbits 767171
Neurobasal GIBCO, by Life Technologies 21103-049
B27 GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Fungizone GIBCO, by Life Technologies 15290-018
Gentamicin sulfate Sigma-Aldrich G1264
Glutamax 200 mM GIBCO, by Life Technologies 35050
TrypLE Express w/o phenol red GIBCO, by Life Technologies 12604
Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride Sigma Aldrich C6645
Poly-D-Lysine Sigma Aldrich P6407
Laminin 1 mg/ml EMD Millipore CC095
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Trypan Blue Stain 0.4% GIBCO, by Life Technologies 15250
Table IV. Specific reagents.
Stereo Microscope Olympus Corporation SZ61
Large Forceps Fine Science Tools 11022-14
Fine-tipped forceps Moria MC40B
Micro fine-tipped forceps Moria MC31
Razor-sharp scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6820
Micro Dissecting scissors Fine Science Tools 91460-11
Micro Dissecting Curved scissors Fine Science Tools 14067-11
Glass 2-chamber slides Lab-Tek 154461
60 mm dishes BD Biosciences 353002
100 mm dishes Corning 430167
15 ml tubes BD Biosciences 352099
1.5 ml cryo-tube vial Nalge Nunc international 375353
Table V. Specific equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aprea, S. Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage. J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).
  2. Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons. Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).
  3. Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. Method for serum-free culture of late fetal and early postnatal rat brainstem neurons. Brain Res. Brain Res. Protoc. 6, 91-99 (2001).
  4. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
  5. Banker, G., Goslin, K. Culturing nerve cells. , The MIT Press. Cambridge. (1998).
  6. Eletto, D. Inhibition of SNAP25 expression by HIV-1 Tat involves the activity of mir-128a. J. Cell Physiol. 216, 764-770 (2008).
  7. Gualco, E. IGF-IR-dependent expression of Survivin is required for T-antigen-mediated protection from apoptosis and proliferation of neural progenitors. Cell Death Differ. 17, 439-451 (2010).
  8. Gage, F. H. Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11879-11883 (1995).
  9. Keyser, D. O., Pellmar, T. C. Synaptic transmission in the hippocampus: critical role for glial cells. Glia. 10, 237-243 (1994).
  10. Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 (1997).

Tags

Neuroscience выпуск 63 культура клеток нейронов кора крысы мозг изоляция
Выделение и культуры крысы эмбриональных нервных клеток: Быстрый протокол
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pacifici, M., Peruzzi, F. IsolationMore

Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol. J. Vis. Exp. (63), e3965, doi:10.3791/3965 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter