Summary
在这篇文章中，高通量方法，为进一步利用针对特定抗原提呈细胞受体合成寡糖及其附件酸酐纳米粒子的表面。
Abstract
涉及的领域，如材料设计，纳米技术，化学和免疫学的跨学科的方法必须利用合理设计有效的疫苗载体。纳米粒子为基础的平台，可以延长疫苗抗原的持久性，它可以提高疫苗的免疫原性。作为疫苗运载工具1几种可生物降解的聚合物已被研究，特别酸酐颗粒表现出的能力，提供持续稳定的蛋白抗原的释放和激活抗原呈递细胞和调节免疫反应2-12。
这些疫苗载体的分子设计需要集成的聚合物性能的合理选择以及适当的靶向制剂纳入。高通量靶向配体和官能颗粒制造自动化是一个功能强大的工具，这将提高学习能力，广泛ŕ昂热物业，并会导致重现疫苗输送装置的设计。
能够被免疫细胞上的特异性受体的靶向配体除了已被证明是调节和裁缝10,11,13 C型凝集素受体 （CLRS）承认碳水化合物对目前的模式识别受体（PRRS）的免疫反应表面的病原体。刺激免疫细胞通过CLRS可以增强国际化，为进一步14,15 T细胞活化抗原和随后介绍。因此，糖类分子在免疫反应的研究中发挥重要作用，然而，使用这些生物分子经常遭受从可用性的结构定义和纯碳水化合物缺乏。基于迭代的解决方案相反应的一个自动化平台可以使快速和控制这些综合有挑战性的分子的合成，显着较低的Building比传统固相法16,17块的数量。
我们在此报告一个自动化的解决方案相如甘露糖为基础的靶向配体中间净化与氟固相提取低聚糖的合成协议。自动化的方法，使碳水化合物为主的靶向剂的发展后，我们描述酸酐纳米粒子的表面采用机器人自动化集由LabVIEW经营如前所述10附件方法。碳水化合物与表面官能针对的CLRS 10,11和增加吞吐量挖掘与多参数系统的复杂性，将具有极大的价值（ 图1a）的制造方法的疗效。
Protocol
1。高通量碳水化合物的合成
- 之前自动dimannoside合成，适当保护的糖捐助，通常三氯，受体，主要是氟烯酒精，合成在板凳上顶。
- 一个编写程序自动化合成为的dimannoside的。在图2给出一个基本的自动化程序示意图。在节目中，它是保证，前发起人此外，供体和受体的混合物搅拌至少30分钟。
- 在二氯甲烷合成捐助，承兑人trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate的的的解决方案。甲苯和二氯甲烷使用最频繁的糖基化反应。
- 此外，准备的临时保护团体在80％和100％的甲醇甲醇脱试剂的解决方案。
- 方案开始之前，确保在1.902香港专业教育学院室内的湿度是自动化室在30％或更低。高湿度是不利的糖基化反应。
- 一旦程序启动，机械臂的顺序转移到反应瓶体和受体的解决方案。然后将混合物搅拌30分钟。
- 下一步机械臂的混合物转移到0.2 0.3等值trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate，，通常在室温下虽然较低的温度，如-20°C可以达到。反应混合物中，搅拌30分钟。
- 30分钟后，反应停止并拆除一个小等分，以监测反应进程。如果不完整的，可以继续反应，并最终可以修改所需要的时间。
- 一旦反应完成后，被转移到反应混合物的氟固相萃取（FSPE）墨盒含C 8 F 17改性硅胶净化。
- 购物车脊先洗净，用80％甲醇 - 水（8毫升），以获得摆脱非氟分数。
- 然后墨盒100％的甲醇洗涤获得的氟标签所需的产品。如果需要额外的净化，可以停止机器的反应产物（S）为净化除去额外的手段。
- 净化周期结束后，机械臂分配进入反应瓶甲醇钠。搅拌反应2小时。如果反应不完全，可以再次将持续一段较长的时间，最终可以修改程序所需的时间。
- 反应完成后，该产品是由FSPE纯化，然后溶解在无水甲苯随后通过蒸发除去残留的水。
- 然后重复周期（从6至13步）所需的链长，直到获得目标分子。
- 自动化获得保护的产品是日EN进一步纯化和充分，如核磁共振（NMR）光谱技术的特点。最终的目标分子的完全脱（去除所有余下保护组），然后完成外自动化平台作为一项规则，因为它通常涉及爆炸的氢气和钯。最后脱步骤进行台式以外的自动化平台。第一步是臭氧分解氧化产生的醛到羧酸氟标记的双债券。该产品是由柱层析纯化。最后一步是由钯催化氢化脱苄醚组。该产品通过硅藻土垫摆脱钯得到纯净的最终产品。
2。高通量的纳米粒子表面官能
- 进行高通量的高分子合成和纳米制造出来后，相同PRotocol和机器人设置共聚物粒子制造系统的基础上癸二酸（SA）和1,6 -双（ 对羧基苯氧）正己烷（CPH）和1,8 -二（Petersen 等 19描述。第羧基苯氧）-3,6 dioxaoctane（CPTEG）和本院。一个机器人沉积设备使用的示意图，在图1b。
- 随着纳米制造，持有含纳米粒子库管复位的直线驱动器阶段。
- 酸酐颗粒表面附着的碳水化合物，胺羧酸偶联反应20连续两个反应组成的执行。
- 第一反应，在第一个可编程的注射泵的注射器充满10当量（公式）（颗粒表面的平均摩尔羧酸浓度等值）1 - 乙基-3 - （3 - 二甲氨基）-CArbodiimide盐酸盐（EDC）和10式。在水溶液中的乙二胺，而在第二个可编程的注射泵的注射器装12式。 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）在水溶液中。
- 使用LabVIEW程序，试剂悬浮存入纳米库*。
- 接下来，每个样品超声在40赫兹（30秒）和管人脱离机器人平台。
- 纳米悬浮液在4°C孵育为9小时**不断旋转
- 反应时间完成后，管离心（12000 XG为5分钟），返回到机器人站，执行两个步骤洗涤。
- 用于洗涤，仍然是空的，并在加载第一个可编程的注射泵注射器，而在第二次注射泵的注射器用冷水填补。在每个管上清撤回到空的注射器和第二泵存款冷水。
- 纳米的均匀化执行步骤2.6中所述的颗粒悬浮。管离心（12000 XG为5分钟）和第二次的洗涤步骤进行步骤2.9中所述。
- 对于第二个反应，两个沉积步骤。在第一沉积步骤，12式。东区区议会都装有一台泵和12式。第二泵的NHS加载。
- 第二沉积步骤，包括10式。第一和第二泵（即乳糖，半乳糖，或DI-甘露糖）***，并与10式第三泵的具体糖类。乙醇酸（作为对照****）。
- 纳米悬浮液匀浆所述步骤2.6在4°C孵育不断旋转的Ĥ9
- 反应时间完成后，一洗步骤执行步骤2.8，2.9和2.10。
- 功能化纳米粒子库，然后放置在真空室中干燥至少2小时。
- 功能化纳米粒子，然后字符通过X射线光电子能谱和高吞吐量的苯酚 - 硫酸试验，以确定表面组成和糖的浓度分别ized。利用扫描电子显微镜和动态光散射，以确定颗粒大小，粒度分布，表面电荷。
注：*沉积量每管中的纳米粒子的质量有所不同。
**第一个和第二个反应的反应时间是可以改变的调整最终糖浓度。
***每个糖类沉积取决于所需的组成测试管。
****乙醇酸对于碳水化合物的附件在本研究采用的具体反应，是作为一个连接器的控制因为地deprotected糖已经有这种分子共价连接，可以进一步附着到纳米粒子表面。
3。代表结果
在FULLY保护dimannoside 如图2所示，合成使用的自动化平台。合成的化合物进行了表征，通过1 H NMR，1 VXR 400兆赫作为溶剂使用CDCL 3谱仪。 NMR谱如图3所示。
利用高通量的纳米制造和酸酐官能纳米此处所述，附件dimannose，乳糖和半乳糖已经进行了成功的10，11。使用此设置，确定最佳反应条件（即反应温度和时间），以达到预期的纳米功能化和形态。当反应进行，在4°C间，而不是室温，减少纳米粒子聚集SEM观察（数据未显示）。表1显示了代表性成果特性官能50:50 CPTEG：要么DI-甘露糖或本院纳米乳糖，在4°C的合成数据表明，由于功能化的纳米直径平均小幅增长。虽然非功能化纳米粒子有一个约负Zeta电位。 -20 mV时，官能颗粒表现出了积极的Zeta电位值，证明成功的纳米粒子表面官能。乳糖和DI-甘露糖都是中性糖，但是，从乙烯胺组二胺利用附加糖的链接可能是积极的zeta电位。
反应时间是另一个变量，可能会影响纳米粒子的最终形态和糖取得的依恋程度。通过调整反应时间，最终连接到纳米粒子表面的糖浓度可控制在如图4A所示。正如所料，增加上50:50 CPTEG的表面浓度dimannose：本院纳米总的反应时间和18小时后达到最高。 24小时的总反应时间与功能的纳米粒子被用来评价自己的能力为目标，对小鼠骨髓衍生的树突状细胞（DCS）CLRS。流式细胞仪是用来评估两个发光受体的表达（即，中再国际（CD209，DC-SIGN的）和甘露糖受体（CD206））与非官能刺激后，乳糖和DI-甘露糖功能化纳米粒子（ 图4B）。获得较高的两种受体的表达，这是一个有效的定位指示，乳糖和DI-甘露糖功能化纳米粒子时，细胞与刺激。然而，DI-甘露糖功能化粒子表现出较高的水平，表明这种配体特异性受体研究的一种表达。
| 纳米粒子类型 | 平均粒径（nm）的 | 大道愤怒颗粒ζ电位（毫伏） |
| 非官能 | 162±43 | -20±0.6 |
| 乳糖 | 235±34 | 26±2.4 |
| DI-甘露糖 | 243±32 | 30±4.2 |
表1纳米表征。非功能化和功能化的特点是准弹性光散射和zeta电位测量。粒度数据表示平均值±标准偏差（SD）的动态光散射在三个独立的实验中收集到的数据。 Zeta电位数据代表三个独立的读数平均值±标准差。改变zeta电位的迹象表明，糖是有效结合的的50:50 CPTEG：青山医院的纳米粒子的表面。
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图1。（一）图形表示碳水化合物酸酐纳米功能化和功能化纳米粒子库，可与所描述的高通量的方法设计的一个例子与追求的方法。 （二）利用粒子的功能化，其中包括（一）三个东北1000泵（二）机器人阶段集成两个驱动器（Zaber）：在x方向的运动之一，和其他自动沉积器具的示意图表示在y方向的运动;（三）两个相邻的机架（适当的管和试管）三个驱动器，每个方向（X，Y，Z）组成的机器人第二阶段。串联泵和一共有5个驱动器。执行器和泵的操作使用LabVIEW软件的计算机。此图是不是规模。arge.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。
图2。自动图形表示迭代使用甘露糖作为一个例子的碳水化合物的合成。
图3。1 H核磁共振的保护dimannoside的。
（一） 图4。 反应时间对纳米粒子表面糖的浓度。中显示的数据，50:50 CPTEG：本院纳米功能与dimannose在不同的反应时间和反应进行了在4°C所示的两个独立的功能化实验的平均值和标准误差。 （二）乳糖和DI-甘露糖功能化纳米粒子有效目标的DC-SIGN（CIRE，CD209）和甘露糖受体（CD206）在骨髓来源的树突状细胞刺激后官能50:50 CPTEG这两个标记的表达增强表明：青山医院纳米时所获得的表达比较非官能粒子。
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Discussion
作为靶向制剂直接纳米粒子的相互作用，免疫细胞碳水化合物的疗效已证实10，11。在我们的实验室以前的研究已经表明，酸酐纳米粒子的特定糖能够针对不同的抗原提呈细胞（APC）CLRS，从而提高免疫细胞的活化，这可能是为进一步的T细胞活化10日，11日的重要。然而，针对几个参数，如酸酐化学，大小，密度糖型糖或表面需要进行优化，从而增加吞吐量挖掘这样一个多参数的系统的复杂性，制备方法，以达到最佳将有很大的价值。此外，在其他相关领域的研究，包括生物传感器，酶固定化，检测和foodb巨大的价值，如果使用的功能纳米奥恩病原体。
利用高通量合成碳水化合物的描述，重现合成糖类分子的挑战可以得到缓解。自动平行反应相同的糖，可以产生较大的材料所需要的数额。糖和糖复合物的已知角色正在迅速扩大。然而，许多进程中的碳水化合物的分子机制，如信号转导通路，或21细胞识别过程的理解，依赖于结构以及明确的糖类容易和廉价的可用性。保护/脱策略，以控制精确的产业链延伸的各种羟基反应的糖合成的首要条件，但繁琐和费时。定期和有效的寡核苷酸和肽合成通过使用自动化合成22，23。固相合成是AVA ilable的寡糖合成24，但患有一些严重的缺点：如积木，大暴行（耦合步骤5至20％等值），缺乏浅显监测反应进程，并采用固相树脂固有的变异性。然而，一个新的解决方案相自动化平台，只需要2至3等值这些珍贵的积木。多种氟标记，如烯氟组，在这个平台上，使氟固相萃取（FSPE）净化中间产品很容易从非氟化合物18，25，26。然而，如下所示，这些标签不排除解决方案相糖基化和标准的有机溶剂脱反应。此外，不同于任何固相自动化合成，这个新的平台允许标准的反应，如质谱（MS）和薄层色谱法（TLC）在任何阶段的监控策略。
内容】“>结果部分描述，之后，这里的高通量的纳米功能化，功能化后达到最佳的纳米形态的反应条件（例如，反应时间和温度）已进行了优化。优化反应温度可能需要优化用于制造纳米粒子（例如，玻璃化转变温度（T g），降解率）的聚合物性能而定。例如，当使用低T 克 （室温下）聚合物，功能化反应将需要进行气温低，这是一些在我们的研究小组利用酸酐化学的情况。粒子官能就业总反应时间的优化需要尤其是当需要将功能不同的降解率与颗粒化学反应时间短，可能是理想的功能化的大部分腐蚀材料E专门针对糖时需要连接到药物或蛋白质装颗粒。糖颗粒表面上的浓度可能是一个重要的变量，以指示这些载体的生物性能。不同糖浓度的生物成果，是在我们的实验室目前的研究领域。使用这种高通量设立编造和官能酸酐纳米允许多个变量的速度比传统的制造和功能化的方法检测。高通量技术的主要限制是最大的，因为它是由大小的容器，可以容纳在设备持有人的限制，可以得到的颗粒批次大小：然而，因为这个设置主要用途筛选大小批量较小，可以有效地使用用于这一目的。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NLBP创始人和在碳水化合物公司LuCella的生物科学公司持有权益
Acknowledgments
作者要感谢美国陆军医学研究和装备司令部（批准＃W81XWH-10-1-0806）和国立卫生研究院（批准＃U19青年AI091031-01和赠款＃1R01GM090280）的财政支持。国民承认化学与生物工程Balloun教授和NLBP的承认威尔金森教授跨学科的工程。我们感谢她协助执行的纳米官能实验朱莉娅贝拉。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| ASW 1000 | Chemspeed Technologies | ||
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| XL-2000 Sonicator | Qsonica | Q55 | |
| Mini-tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 |
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