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Bioengineering

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Published: July 6, 2012 doi: 10.3791/3967
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1, 1,2
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Chemistry, Iowa State University
* These authors contributed equally

Summary

Neste artigo, um método de produção elevada é apresentada para a síntese de oligossacáridos e à sua fixação à superfície de nanopartículas de polianidrido para utilização posterior em alvejar receptores específicos em células apresentadoras de antigénio.

Abstract

Abordagens transdisciplinares envolvendo áreas como design de materiais, nanotecnologia, química e imunologia tem que ser utilizado para projetar racionalmente portadores eficazes vacinas. Nanopartículas baseadas em plataformas pode prolongar a persistência de antígenos vacinais, que poderia melhorar a imunogenicidade da vacina 1. Vários polímeros biodegradáveis ​​têm sido estudados como veículos de entrega de vacinas 1, em particular, as partículas de polianidrido demonstraram a capacidade para proporcionar uma libertação sustentada de antigénios de proteínas estáveis ​​e para activar as células apresentadoras de antigénio e modulam as respostas imunes 2-12.

A concepção molecular destes transportadores de vacina necessita de integrar a selecção racional de propriedades do polímero, bem como a incorporação de agentes adequados de segmentação. Fabricação de alta taxa de transferência automatizado de segmentação ligantes e partículas funcionalizados é uma poderosa ferramenta que irá melhorar a capacidade de estudar uma variedade rAnge de propriedades e irá conduzir à concepção de dispositivos de entrega de vacinas reprodutíveis.

A adição de segmentação ligandos capazes de serem reconhecidos por receptores específicos em células imunes tem sido demonstrado que modulam e adaptar as respostas imunes 10,11,13 receptores de tipo C-lectina (CLRs) são receptores de reconhecimento de padrões (PRRS) que reconhecem hidratos de carbono presentes no superfície de agentes patogénicos. A estimulação de células do sistema imunológico através de CLRs permite para a internalização melhorada do antigénio ea apresentação subsequente para a activação das células T adicional 14,15. Portanto, as moléculas de hidratos de carbono têm um papel importante no estudo das respostas imunitárias, no entanto, a utilização destas biomoléculas frequentemente sofre da falta de disponibilidade de estruturalmente bem definida e hidratos de carbono puros. Uma plataforma de automação com base na solução iterativa de fase-reacções podem permitir a síntese rápida e controlada destas moléculas sinteticamente desafiantes utilizando b significativamente menoruilding quantidades de blocos do que as tradicionais métodos de fase sólida 16,17.

Descrevemos aqui um protocolo para a síntese de solução de fase-automatizado de oligossacáridos, tais como manose baseados ligandos de segmentação com extracção de fase sólida para a purificação fluorosa intermédia. Após o desenvolvimento de métodos automatizados para tornar o agente de hidrato de carbono com base de segmentação, que descrevem métodos para a sua fixação sobre a superfície do polianidrido nanopartículas empregando um conjunto automatizado robótico até operado por LabVIEW como descrito anteriormente 10. Funcionalização da superfície com hidratos de carbono tem demonstrado eficácia na segmentação CLRs 10,11 e aumentando o rendimento do método de fabricação para descobrir as complexidades associadas com um sistema de multi-paramétricos será de grande valor (Figura 1a).

Protocol

1. Alta capacidade de síntese de carboidratos

  1. Antes da síntese automatizada de dimannoside, um dador de açúcar adequadamente protegido, tipicamente tricloroacetimidato, e aceitador, principalmente álcool uma alcenilo fluorosa, são sintetizados no banco-top.
  2. Um programa é escrito para a síntese automatizada de dimannoside. Uma representação esquemática do procedimento básico automatizado é apresentada na Figura 2. No programa, é assegurado que, antes da adição do promotor, a mistura de dador e aceitador é agitada durante pelo menos 30 min.
  3. As soluções do sintética doador aceitador, e trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate são feitas em diclorometano. Tolueno e diclorometano, são usados ​​mais freqüentemente para as reações de glicosilação.
  4. Além disso, preparar soluções de reagentes para a desprotecção de grupos protectores temporários em metanol a 80% e metanol a 100%.
  5. Antes do início do programa, assegurar que o Relative humidade da sala é de 30% ou inferior na câmara de automação. A alta umidade é prejudicial para as reações de glicosilação.
  6. Uma vez que o programa é iniciado, o braço robótico transfere as soluções de dador e aceitador para dentro do frasco de reacção sequencialmente. Em seguida a mistura é agitada durante 30 min.
  7. Em seguida, o braço robótico transfere 0,2 a 0,3 equivalentes de trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate na mistura, tipicamente à temperatura ambiente, embora temperaturas mais baixas como -20 ° C pode ser alcançada. A mistura de reacção é agitada durante 30 min.
  8. Após 30 min, a reacção é parada e uma pequena alíquota removido para monitorizar o progresso da reacção. Se não está completa, a reacção pode ser continuada e, finalmente, o tempo necessário pode ser modificado.
  9. Uma vez que a reacção está completa, a mistura de reacção é transferida para os fluorosas extracção de fase sólida (FSPE) cartuchos contendo C 8 F 17-modificado de gel de sílica para a purificação.
  10. O carrinhocristas são primeiro lavado com uma mistura de 80% de metanol-água (8 mL) para se livrar da fracção não-fluorosa.
  11. Em seguida, os cartuchos são lavados com metanol a 100% para se obter o produto desejado fluorosa-etiquetado. Se purificação adicional for desejado, a máquina pode ser interrompido eo produto da reacção (s) removido para purificação por meios adicionais.
  12. Após o ciclo de purificação, o braço robótico dispensa metóxido de sódio para dentro do frasco de reacção. A reacção é agitada durante 2 hr. Se não está completa, a reacção pode novamente ser continuado durante um período mais longo e, finalmente, o tempo programado necessário pode ser modificado.
  13. Após a conclusão da reacção, o produto é purificado por FSPE e, em seguida, submetido a dissolução em tolueno anidro seguido de evaporação para remover a água residual.
  14. Em seguida, o ciclo (do passo 6 a 13) é repetido até que o comprimento da cadeia desejada é obtida para a molécula alvo.
  15. O produto protegido obtido a partir de automação é then ainda purificado e caracterizados por técnicas tais como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Desprotecção completa (remoção de todos os grupos protectores restantes) da molécula alvo final é então completado fora da plataforma de automação como uma regra, pois que normalmente envolve o gás de hidrogénio explosivo e paládio. O passo de desprotecção final foi realizada no banco de cima para fora da plataforma de automação. O primeiro passo foi ozonólise da ligação dupla em tag fluorosa seguido por oxidação do aldeído produzido para um ácido carboxílico. O produto foi purificado por cromatografia em coluna. O passo final foi desprotecção de grupos éter benzílico por paládio catalisada-hidrogenação. O produto foi passado através de celite almofada para se livrar do paládio para obter produto final puro.

2. Alta capacidade funcionalização da superfície de nanopartículas

  1. Alta capacidade de síntese de polímeros e fabricação de nanopartículas é realizada após a mesma protocol e robótico configurar descrito por Petersen et al 19. Os sistemas de copolímero utilizado para a fabricação de partículas são à base de ácido sebácico (SA) e 1,6-bis (para-carboxifenoxi)-hexano (CPH), e 1,8-bis ( para-carboxifenoxi) -3,6 dioxaoctane-(CPTEG) e CPH. Uma representação esquemática do aparelho de deposição robótico utilizada é apresentada na Figura 1b.
  2. Após a fabricação de nanopartículas, o detentor contendo os tubos com a biblioteca de nanopartículas é recolocado para a fase do actuador linear.
  3. Para a fixação de hidratos de carbono para a superfície de partículas de polianidrido, uma amina-carboxílico reacção de acoplamento ácido 20 constituído por duas reacções consecutivas é executada.
  4. Para a reacção em primeiro lugar, a seringa na bomba de seringa primeiro programável é preenchido com 10 equivalentes (eq.) (equivalentes de concentração de ácido carboxílico molar média sobre a superfície da partícula) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-cacloridrato rbodiimide (EDC) e 10 eq. de etilenodiamina em uma solução aquosa, enquanto que a seringa na bomba de seringa segundo programável é carregado com 12 eq. de N-hidroxissuccinimida (NHS) em solução aquosa.
  5. Usando o programa LabVIEW, suspensões reagentes são depositadas na * biblioteca de nanopartículas.
  6. Em seguida, cada amostra é sonicada (30 s em 40 Hz) e do suporte do tubo é separada a partir da plataforma robótico.
  7. As suspensões de nanopartículas são incubadas durante 9 ** h com rotação constante a 4 ° C.
  8. Após o tempo de reacção é completado, os tubos são centrifugados (12000 xg durante 5 min) e voltou para a estação de robótico para realizar duas etapas de lavagem.
  9. Para a lavagem, uma seringa permanece vazio e carregado na bomba de seringa primeiro programável enquanto a seringa na bomba de seringa segundo é enchido com água fria. O sobrenadante de cada tubo é retirada para a seringa vazia e os depósitos segunda bomba de água fria.
  10. Homogeneização de nanosuspensão de partículas é realizada como descrito no passo 2.6. Os tubos são em seguida centrifugada (12000 xg durante 5 min) e um segundo passo de lavagem é realizada como descrito no passo 2.9.
  11. Para a reacção segundo, dois passos de deposição são utilizados. Na etapa de deposição em primeiro lugar, 12 eq. de EDC são carregados com uma bomba e 12 eq. NHS de são carregados com a segunda bomba.
  12. O passo de deposição segundo inclui 10 eq. de um sacárido específica sobre as bombas primeiro e segundo (isto é, galactose, lactose ou di-manose) *** e uma terceira bomba com 10 eq. de ácido glicólico (usado como controlo ****).
  13. As suspensões de nanopartículas é homogeneizada como descrito na etapa 2,6 e incubou-se durante 9 h, com rotação constante a 4 ° C.
  14. Após o tempo de reacção é completada, um passo de lavagem é realizada como descrito nos passos 2.8, 2.9 e 2.10.
  15. A biblioteca de nanopartículas funcionalizado é então colocado numa câmara de vácuo para secar durante pelo menos 2 horas.
  16. As nanopartículas são funcionalizados em seguida carácterzada por espectroscopia de raios X de fotoelétrons e um ensaio de ácido elevada taxa de transferência de fenol-sulfúrico para determinar a composição da superfície e da concentração do sacárido respectivamente. Microscopia electrónica de varrimento e de dispersão de luz dinâmica são utilizados para determinar o tamanho de partícula, distribuição de tamanho, e carga de superfície.

Notas: * Os volumes de deposição variar de acordo com a massa de nanopartículas contidas em cada tubo.
Vezes ** reaccionais para reacções primeiro e segundo pode ser alterado para ajustar a concentração de sacárido final.
Cada *** sacárido é depositado em tubos de ensaio, dependendo do grupo desejado.
**** Para a reacção específico empregue neste estudo para a ligação de hidratos de carbono, o ácido glicólico é usado como um controlo linker desde sacáridos desprotegidos já têm esta molécula ligada covalentemente, que permite a fixação adicional para a superfície de nanopartículas.

3. Os resultados representativos

O fuldimannoside ly protegido mostrado na Figura 2 foi sintetizado utilizando a plataforma de automação. O composto sintetizado foi caracterizado por 1 H RMN num espectrómetro de VXR 400 MHz usando CDCI3 como solvente. O espectro de RMN é mostrado na Figura 3.

Utilizando a fabricação de nanopartículas de alto rendimento e funcionalização de polianidrido nanopartículas aqui descrito, a ligação de dimannose, lactose e galactose foi realizada com sucesso 10, 11. Utilizando esta configuração, as condições reaccionais óptimas (isto é, temperatura de reacção e tempo) foram identificados para atingir funcionalização de nanopartículas desejado e morfologia. Quando a reacção foi realizada a 4 ° C em vez de temperatura ambiente, uma redução na agregação de nanopartículas foi observada por SEM (dados não mostrados). A Tabela 1 mostra os resultados representativos da caracterização de CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas CPH quer com di-manose oulactose, sintetizado a 4 ° C. Os dados indicam um pequeno aumento no diâmetro médio de nanopartículas devido à funcionalização. Enquanto as nanopartículas não-funcionalizados tinha um potencial zeta negativo de aprox. -20 MV, as partículas funcionalizadas mostrou um valor de potencial zeta positivo, demonstrando funcionalização bem sucedida da superfície de nanopartículas. Lactose e di-manose são ambos açúcares neutros, no entanto, os grupos amina livres do etileno diamina ligante utilizado para fixar os sacáridos podem ser responsáveis ​​do potencial zeta positivo.

Tempo de reacção é outra variável que pode afectar tanto morfologia do final das nanopartículas e do grau de ligação alcançados açúcar. Ao ajustar o tempo de reacção, a concentração final de açúcar ligada à superfície nanopartículas podem ser controladas, como mostrado na Figura 4A. Como esperado, a concentração de dimannose sobre a superfície de 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas aumentou como tempo total de reacção e atingiu um máximo após 18 h. As nanopartículas funcionalizados com o tempo de reacção total de 24 hr foram utilizados para avaliar a sua capacidade para atingir CLRs no rato derivadas da medula óssea células dendríticas (DC). A citometria de fluxo foi utilizado para avaliar a expressão de dois receptores de CL (isto é, CIRE (CD209, DC-SIGN) e receptor de manose (CD206)) após estimulação com não-funcionalizado, e lactose, e di-manose nanopartículas funcionalizadas (Figura 4B). Uma maior expressão de ambos os receptores, que é um indicativo de direccionamento eficaz, foi obtido quando as células foram estimuladas com ambos lactose e di-manose nanopartículas funcionalizados. No entanto, di-manose-funcionalizados partículas mostraram um maior nível de expressão indicando uma especificidade deste ligando para os receptores que foram estudados.

Tipo de nanopartícula Diâmetro médio de partícula (nm) AvePartículas raiva ζ-potencial (mV)
Non-funcionalizado 162 ± 43 -20 ± 0,6
Lactose 235 ± 34 26 ± 2,4
Di-manose 243 ± 32 30 ± 4,2

Tabela 1. Caracterização de nanopartículas. Non-funcionalizado e funcionalizado foram caracterizados por quasi-elástica de dispersão de luz e as medições de potencial zeta. Dados de tamanho de partículas representam o valor médio ± desvio padrão (SD) de dados dinâmicos de espalhamento de luz coletados em três experimentos independentes. Dados de potencial zeta representam o valor médio ± DP de três leituras independentes. Mudança no sinal do potencial zeta demonstra que o açúcar era eficiente conjugado com o CPTEG 50:50: superfície de nanopartículas CPH.

A Figura 1 = "/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
Figura 1. (A) representação gráfica da abordagem prosseguido com funcionalização hidrato de carbono de nanopartículas polianidrido e um exemplo das bibliotecas de nanopartículas funcionalizados que poderiam ser concebidos com o descrito abordagem de alto rendimento. (B) representação esquemática do aparelho de deposição automatizado utilizado para funcionalização de partícula, que consiste de (i) três NE 1000 bombas, (ii) uma fase robótico integrado por dois actuadores (Zaber): um para o movimento na direcção X ea outra para o movimento na direcção y, (iii) um segundo estágio robótico com duas cremalheiras adjacentes (adequado para os tubos e tinas) que consiste em três actuadores, um para cada direcção (x, y, ez). As bombas e um total de cinco actuadores estão ligados em série. Atuadores e bombas são operados por um computador utilizando o software LabVIEW. Este diagrama não está em escala.arge.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

A Figura 2
Figura 2. Representação gráfica da automatizado iterativo síntese de hidratos de carbono, usando manose como um exemplo.

A Figura 3
Figura 3. 1 H RMN do dimannoside protegido.

A Figura 4
Figura 4. (A) Efeito do tempo de reacção sobre a concentração de nanopartículas de superfície de sacárido. Nos dados mostrados, 50:50 CPTEG: nanopartículas CPH foram funcionalizados com dimannose em diferentes tempos de reacção ea reacção foi realizada a 4 ° C. O erro médio e padrão de duas experiências independentes de funcionalização é mostrado. (B) nanopartículas lactose e di-manose funcionalizadoseficazmente receptor alvo DC-SIGN (CIRE, CD209) e manose (CD206) em derivadas da medula óssea células dendríticas, como demonstrado pelo aumento da expressão destes dois marcadores após estimulação com CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas CPH, quando comparado com a expressão obtida com não-funcionalizados partículas.

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Discussion

A eficácia de hidratos de carbono como agentes de segmentação a interacções de nanopartículas directos para células do sistema imunológico foi anteriormente demonstrada 10, 11. Uma pesquisa anterior nos nossos laboratórios têm mostrado que os açúcares específicas associadas a nanopartículas polianidrido são capazes de atingir CLRs diferentes em células apresentadoras de antigénio (APCs), aumentando assim a activação de células imunitárias que pode ser importante para a activação das células T adicional 10, 11. No entanto, para alcançar ideal visando parâmetros de tal vários como a química polianidrido, o tamanho, o tipo de açúcar ou açúcar superfície densidade precisam de ser optimizado e, por conseguinte, aumentar a taxa de transferência no método de fabricação para descobrir as complexidades associadas com um tal sistema de multi-paramétrico será de grande valor. Além disso, a utilização de nanopartículas funcionalizados se de grande valor para outras áreas relacionadas de pesquisa, incluindo biosensoriamento, a imobilização de enzimas, e detecção de foodbpatógenos Orne.

Ao utilizar o descrito síntese de alto rendimento de hidratos de carbono, os desafios na síntese de moléculas de carboidratos reprodutíveis podem ser mitigados. Automatizados reacções paralelas do mesmo açúcar pode produzir quantidades maiores de material de conforme necessário. Os papéis conhecidos de açúcares e glicoconjugados estão se expandindo rapidamente. No entanto, uma compreensão dos mecanismos moleculares de carboidratos em muitos processos, por exemplo, vias de transdução de sinal ou processos de reconhecimento celular 21, depende da disponibilidade fácil e barata de estruturalmente bem definidas sacarídeos. De protecção / desprotecção estratégias para controlar a reactividade de vários grupos hidroxilo para a extensão da cadeia precisos são um requisito primário para a síntese de açúcar, mas são tedioso e demorado. Os oligonucleótidos e oligopéptidos são regularmente e eficientemente sintetizados usando sintetizadores automatizados 22, 23. Um sintetizador de fase sólida é Ava ilable para a síntese de oligossacárido 24, mas sofre de alguns inconvenientes graves: por exemplo, grandes excessos de blocos de construção (5 a 20 equivalentes por acoplamento passo), a falta de controlo fácil do progresso da reacção, ea inerente variabilidade das resinas de fase sólida utilizados . Uma plataforma de automação nova solução de fase, no entanto, requer apenas 2 a 3 equivalentes destes blocos de construção preciosos. Nesta plataforma de uma variedade de marcas fluorosas, tais como o grupo alcenilo fluorosa, permite a extracção de fase sólida fluorosa (FSPE) para purificar os produtos intermediários facilmente a partir de não-fluorosas compostos 18, 25, 26. No entanto, como mostrado aqui, essas marcas não se opõem a solução fase-glicosilação e reacções de desprotecção em padrão solventes orgânicos. Além disso, ao contrário de qualquer sintetizador de fase sólida automatizada, esta nova plataforma permite estratégias de reacção padrão de controlo, tais como espectrometria de massa (MS) e cromatografia de camada fina (TLC) em qualquer fase.

ONTEÚDO "> Tal como descrito na secção de resultados, seguindo a funcionalização de alto rendimento de nanopartículas aqui apresentados, as condições de reacção (por exemplo, tempo de reacção e temperatura) para obter o morfologia das nanopartículas óptima após funcionalização foram optimizados. temperatura de reacção óptima pode precisar de ser optimizada dependendo das propriedades de polímeros utilizados para fabricar as nanopartículas (por exemplo, temperatura de transição de vidro (Tg), taxas de degradação). Por exemplo, quando se utiliza polímeros com baixo T g (abaixo da temperatura ambiente), as reacções de funcionalização terá de realizada a baixas temperaturas, o que é o caso de alguns dos produtos químicos utilizados no polianidrido nosso grupo de pesquisa. Optimização do tempo de reacção total empregue para funcionalização de partícula for desejado, especialmente quando a química de partículas com diferentes taxas de degradação precisam de ser funcionalizada. tempo de reacção mais curto pode ser ideal funcionalizar bulk-erosão e materiaisespecialmente quando um açúcar segmentação precisa de ser ligado a partículas de droga ou proteína-carregados. A concentração de açúcares na superfície das partículas, podem ser uma variável importante para dirigir o desempenho biológica destes transportadores. O resultado biológica de variando a concentração de açúcar é uma área actual de estudo nos nossos laboratórios. A utilização desta alta taxa de transferência configurado para fabricar e nanopartículas polianidrido funcionalizados permite o teste de múltiplas variáveis ​​mais rápido do que a fabricação convencional e métodos de funcionalização. A principal limitação da técnica com rendimento elevado é o tamanho de lote máximo de partículas que podem ser obtidos uma vez que é limitada pelo tamanho dos recipientes que podem se encaixam nos suportes aparelhos: no entanto, uma vez que a principal utilização do presente conjunto é para cima para o rastreio lote menor tamanho, podem ser eficazmente usada para esta finalidade.

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Disclosures

NLBP é co-fundador e detém no capital da empresa de carboidratos LuCella Biosciences, Inc.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer os EUA Army Medical Research e Material Command (Grant # W81XWH-10-1-0806) e os Institutos Nacionais de Saúde (Grant # U19 AI091031-01 e Grant # 1R01GM090280) pelo apoio financeiro. BN reconhece a Professorship Balloun em Engenharia Química e Biológica e NLBP reconhece a Professorship Wilkinson de Engenharia Interdisciplinar. Agradecemos Julia Vela por sua assistência na realização dos experimentos de funcionalização de nanopartículas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis Zaber Technologies T-XYZ-LSM050A-KT04
NE-1000 Single Syringe Pump New Era Pump Systems NE-1000
Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes Corning 07-250-125
ASW 1000 Chemspeed Technologies
LabVIEW National Instruments 776671-35
SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc Sigma Aldrich 509507
XL-2000 Sonicator Qsonica Q55
Mini-tube rotator Fisher Scientific 05-450-127

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References

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