Summary
Bu makale, yüksek bir verim yöntemi antijen sunan hücreler üzerinde belirli reseptörlerine yönelik olarak kullanım için polianhidrid Nanopartiküllerin yüzeyine oligosaccharidler ve ekin sentezi için sunulmuştur.
Abstract
Bu malzeme tasarım, nanoteknoloji, kimya ve immünoloji gibi alanlarda ilgili Transdisipliner yaklaşımlar rasyonel etkili aşılar taşıyıcıları tasarlamak için kullanılmıştır gerekir. Nanopartikül-tabanlı platformlar aşı immünojenitesi 1 artırabilirsiniz aşı antijenleri sebat uzatabilir. Çeşitli biyo-bozunabilir polimerler aşı dağıtım araçları 1 olarak ele alınmıştır, özellikle de, polianhidrid partikülleri stabil protein antijenleri arasında sürekli bir şekilde tahliye edilmesini sağlayacak ve antijen sunan hücreler aktif hale getirmek ve bağışıklık yanıtı 2-12 modüle etmek için yeteneğini göstermişlerdir.
Bu aşı taşıyıcıların moleküler tasarım polimerin özelliklerinin rasyonel seçimi gibi uygun bir hedef ajanların eklenmesi entegre gerekiyor. Ligandlar ve fonksiyonlandırılmış parçacıklar hedefliyorsunuz Yüksek throughput otomatik imalat geniş bir r çalışma yeteneğini artıracak güçlü bir araçtırözelliklerinin ange ve tekrarlanabilir bir aşı uygulama araçları tasarımına yol açacaktır.
Bağışıklık hücreleri belirli reseptörleri tarafından kabul olma yeteneğine sahip ligandların hedefleme Ayrıca 10,11,13 C-tipi lektin reseptörleri (CLRs) üzerine karbonhidrat mevcut tanıması örüntü tanıma reseptörleri (PRR) olan modüle ve kişiye bağışıklık yanıtlarını gösterilmiştir patojenlerin yüzey. CLRs ile bağışıklık hücreleri antijene uyarılması ve daha da T hücresi aktivasyonu için 14,15 sonraki sunum geliştirilmiş interne sağlar. Bu nedenle, karbonhidrat molekülleri immün yanıtın çalışmada önemli bir rol oynar, ancak bu biyomoleküllerin kullanımı sıklıkla yapısal olarak iyi tanımlanmış ve saf karbonhidrat kullanılabilirlik eksikliğinden muzdarip. Çözüm fazlı reaksiyonlar iteratif dayalı bir otomasyon platformu anlamlı derecede düşük b kullanarak bu zorlu sentetik moleküllerin hızlı ve kontrollü sentezi etkinleştirebilirsinizGeleneksel bir katı-faz yöntemleri 16,17 'den blok miktarlarda uilding.
Bu yazıda böyle bir ara arıtma için fluorous katı-faz ekstraksiyon ile mannoz tabanlı ligandları olarak oligosakkarid otomatikleştirilmiş bir çözüm-faz sentezi için bir protokol rapor. Karbonhidrat bazlı hedeflemeyi ajan yapmak için otomatik yöntemler geliştirilmesi sonra, daha önce açıklandığı gibi 10 LabVIEW tarafından işletilen bir otomatik robotlu kurulum istihdam polianhidrid Nano partikülleri yüzeyinde bağlılığını yöntemleri açıklanmaktadır. Karbonhidrat ile yüzeyi fonksiyonlandırmalar CLRs 10,11 hedefleme ve ortaya çıkarmak bir çoklu-parametrik sistemi ile ilişkili karmaşıklıklara büyük bir değer (Şekil 1a) olacak kadar imalat yönteminin verim artan etkinlik göstermiştir.
Protocol
1. Yüksek verim Karbonhidrat Sentez
- Önce dimannoside ve otomatik sentezi, uygun bir şekilde korunan şeker donör, genellikle trichloroacetimidate, ve alıcı, özellikle bir alkenil fluorous alkol için tezgah-üst sentezlenir.
- Bir program dimannoside arasında otomatik sentezi için yazılmıştır. Temel otomatikleştirilmiş prosedürün bir şematik Şekil 2 'de gösterilmiştir. Program, bu promotör eklenmesinden önce, verici ve alıcı bir karışımı, en azından 30 dakika süreyle karıştırıldı sağlanır.
- Sentetik donör, alıcı ve trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate çözeltileri diklorometan içinde yapılır. Toluen ve diklorometan glikozilasyon reaksiyonlar için, en sık kullanılmaktadır.
- Ayrıca,% 80 metanol ve% 100 metanol içindeki geçici koruyucu gruplarının korumasının kaldırılması için reaktifler çözeltileri hazırlanır.
- Programın başlamasından önce, emin relatOdadaki ive nem otomasyonu odacık içinde% 30 ya da daha düşüktür. Yüksek nem glikozilasyon reaksiyonlar için zararlıdır.
- Program başladıktan sonra, robot kol sırayla reaksiyon şişeye donör ve alıcı çözümleri aktarır. Daha sonra karışım, 30 dakika boyunca karıştırıldı.
- Robotik kol karışımı içine trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate arasında 0,2-0,3 benzerleri aktarır Sonra, tipik olarak oda sıcaklığında, -20 gibi düşük sıcaklıklarda ° C de elde edilebilir. Reaksiyon karışımı 30 dakika boyunca karıştırıldı.
- 30 dk sonra reaksiyon durduruldu ve küçük bir alikotu reaksiyon ilerlemesini izlemek için çıkarılır. Tamamlanmaz, reaksiyon devam edilebilir ve sonuçta gerekli süreyi modifiye edilebilir.
- Reaksiyon tamamlandıktan sonra, reaksiyon karışımı saflaştırılması için C'de 8 F 17-değiştirilmiş silika jel içeren fluorous katı faz ekstraksiyonu (FSPE) kartuşlar transfer edilir.
- Sepetisırtlar birinci non-fluorous fraksiyonu kurtulmak için% 80 metanol-su karışımı (8 mL) ile yıkanır.
- Sonra kartuşlar istenen fluorous-etiketli ürünü elde etmek için% 100 metanol ile yıkanır. Ek saflaştırma isteniyorsa, makinenin durduruldu ve reaksiyon ürünü (ler) ilave yoluyla saflaştırma için çıkarılabilir.
- Arıtma döngüsü sonra, robot kol reaksiyon şişeye sodyum metoksid saçıyor. Reaksiyon 2 saat boyunca karıştırıldı. Tam edilmediğinde, reaksiyon yeniden daha uzun bir süre boyunca devam edilebilir ve sonuçta gerekli programlanmış bir süre modifiye edilebilir.
- Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, ürün FSPE ile saflaştırılır ve daha sonra kalan suyu uzaklaştırmak için ardından buharlaştırma ile susuz tolüen içinde çözünmesi tabi tutuldu.
- İstenen zincir uzunluğu hedef molekül elde edilir kadar daha sonra çevrimi (adım 6-13 arası) tekrar edilir.
- Otomasyonu elde edilen ürün th korumalı olduğuen fazla saflaştırılmış ve tamamen gibi nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi gibi teknikler ile karakterize edilmektedir. Genellikle patlayıcı hidrojen gazı ve paladyum içerir, çünkü son hedef moleküle korumasının giderilmesinden tam (tüm kalan koruyucu grubun çıkartılması) daha sonra, bir kural olarak otomasyon platformu dışında tamamlanır. Nihai korunmasına son verme işlemi otomasyon platformu dışında tezgah üstü üzerinde gerçekleştirildi. Birinci aşama, bir karboksilik asit ile üretilen aldehit oksidasyonu ile takip fluorous etiketi çift bağın ozonlanmasından idi. Ürün kolon kromatografi ile saflaştırıldı. Son adım paladyum katalizli hidrojenasyon ile benzil eter gruplarının korumasının kaldırılması idi. Ürün, saf nihai ürün elde etmek için paladyum kurtulmak için selit yastığı içinden geçirilmiştir.
2. Yüksek verim Nanopartikül Yüzey fonksiyonlandırmalar
- Yüksek verim polimer sentezi ve nanoparçacık fabrikasyon aynı pr takip yapılırotocol ve robotik kadar Petersen ve ark 19 tarafından tarif ayarlanır. partikül imalatı için kullanılan kopolimer sistemleri sebasik asit (SA) ve 1,6-bis (para-karboksifenoksi) heksan (CPH), ve 1,8-bis (dayanmaktadır para-karboksifenoksi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) ve CPH. Kullanılmıştır robotik yerleştirme tertibatı şematik temsili Şekil 1b sunulmuştur.
- Nanoparçacık fabrikasyon ardından, nanoparçacık kütüphane ile tüpler içeren tutucu lineer aktüatör sahneye tutturulur.
- Polianhidrid parçacıklarının yüzeyine karbonhidrat tutturulması için, iki ardışık reaksiyon oluşan bir amin-karboksilik asit bağlama reaksiyonu 20 gerçekleştirilir.
- Birinci reaksiyon için, ilk programlanabilir şırınga pompası şırınga 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) ve benzerleri 10 (denklem) (parçacığın yüzey üzerinde ortalama mol karboksilik asit konsantrasyonunun eşdeğer) ile doldurulmuştur-carbodiimide hidroklorür (EDC) ve 10 eq. bir sulu çözelti içinde etilendiaminin, ikinci programlanabilir şırınga pompası şırınganın 12 eq ile yüklenir iken. sulu çözelti içinde N-hidroksisüksinimid (NHS).
- LabVIEW programı kullanarak, reaktif süspansiyonlar nanoparçacık kütüphane * yatırılır.
- Sonra, her bir numune sonicated edilir (40 Hz 30 s) ve tüp tutucu robot platformu kopar.
- Nanoparçacık süspansiyonlar 4 ° C'de sabit dönüş ile 9 saat süreyle inkübe edilir **
- Reaksiyon süresi tamamlandıktan sonra, tüpler santrifüjlendi (5 dakika boyunca 12.000 x g) ve iki yıkama işlemleri uygulamaya robotik istasyonundan geri gönderilir.
- Ikinci bir şırınga pompası şırınga soğuk su ile doldurulur ise yıkama için, bir şırınga boş ve ilk programlanabilir şırınga pompası yerleştirilmiş kalır. Her bir tüp içinde süpernatan boş bir şırınga pompası ve ikinci yataklarının soğuk su içine geri çekilir.
- Nano HomojenizasyonAdım 2,6 tarif edildiği gibi parçacık süspansiyonu yapılır. Tüpler daha sonra santrifüj edilir (5 dakika boyunca 12.000 x g) ve 2,9 adım tarif edildiği gibi ikinci bir yıkama adımı gerçekleştirilir.
- İkinci reaksiyon için, iki biriktirme adımları kullanılır. Birinci yerleştirme adımda, 12 eq. EDC bir pompa ve 12 eq ile yüklenir. NHS ikinci pompa ile yüklenir.
- İkinci yerleştirme basamağı 10 eq içerir. Birinci ve ikinci pompaları (yani, galaktoz, laktoz ya da di-mannoz) ve *** 10 eq ile üçüncü bir pompa, bir spesifik bir sakarit. ve glikolik asit (kontrol olarak kullanılmıştır ****).
- 4 ° C'de adım 2.6 'da açıklanan ve sürekli rotasyon ile 9 saat inkübe olarak Nanopartikül süspansiyonlar homojenize edilir
- Reaksiyon süresi tamamlandıktan sonra adım 2.8, 2.9 ve 2.10 'da anlatıldığı gibi, bir yıkama adımı gerçekleştirilir.
- Fonksiyonlandırılmış nanoparçacık kütüphanesi sonra, en azından 2 saat boyunca kurumaya bir vakum hücresinin yerleştirilir.
- Fonksiyonlandırılmış nanopartiküller sonra karakter olanX-elektron Spektroskopisi ve sırasıyla yüzey bileşimi ve sakarit konsantrasyonunu belirlemek için yüksek bir verim fenol-sülfürik asit deneyine göre ized. Elektron mikroskobu ve dinamik ışık saçılımı Tarama tane boyutu, boyut dağılımı ve yüzey yükü belirlemek için kullanılır.
Notlar: * Biriktirme hacmi her tüpte bulunan nanoparçacıkların kütlesi ile değişir.
Birinci ve ikinci reaksiyonlar için ** Reaksiyon süresi, nihai konsantrasyonu sakarit ayarlamak için değiştirilebilir.
*** Her sakkarit istenen gruba bağlı olarak test tüpleri içine yatırılır.
Koruması giderilmiş sakaritlerin zaten nanoparçacık yüzeyine daha takılabilir kovalent olarak bağlanmış bu molekülün, beri **** karbonhidrat tutturulması için bu çalışmada kullanılan belli bir tepkime için, glikolik asit, bir bağlayıcının kontrol olarak kullanılmıştır.
3. Temsilcisi Sonuçlar
FulŞekil 2 de gösterildiği ly korunan dimannoside otomasyon platformu kullanılarak sentezlenmiştir. Sentezli bir bileşim çözücü olarak kullanarak, bir CDCl3 VXR 400 MHz spektrometre 1 H NMR ile karakterize edilmiştir. NMR spektrum Şekil 3 'de gösterilmiştir.
Polianhidrid yüksek verimlilik nanoparçacık imalat ve işlevsel kullanmak burada açıklanan nanoparçacıklar, dimannose, laktoz ve galaktoz eki başarıyla 10, 11 yapılmıştır. Bu set up kullanarak, optimum reaksiyon koşulları (yani, reaksiyon sıcaklığı ve zaman) istenen nanoparçacık fonksiyonlandırmalar ve morfolojisi ulaşmak için belirlenmiştir. Reaksiyon 4 azından gerçekleştirildiği zaman ° C yerine, oda sıcaklığı arasında, nanoparçacık yığılmasında bir azalma ile SEM ile gözlenmiştir (veri gösterilmemiştir). Di-mannoz veya biriyle CPH nanopartiküller: Tablo 1 fonksiyonlandırılmış 50:50 CPTEG karakterizasyonu temsilcisi sonuçlarını gösterir4 de sentezlenen laktoz, ° C. Veri fonksiyonlandırmalar nedeniyle ortalama nanoparçacık çapı küçük bir artış gösterir. Olmayan fonksiyonlandırılmış nanopartiküller yaklaşık bir negatif zeta potansiyeline sahipti. -20 MV, fonksiyonlandırılmış parçacıklar nanoparçacık yüzeyinin başarılı fonksiyonlandırmalar gösteren, pozitif zeta potansiyel değeri gösterdi. Laktoz ve di-mannoz hem de nötr şeker olmakla birlikte, etilen gelen serbest amin gruplarının sakaritlerin bağlamak için kullanılan bağlayıcı pozitif zeta potansiyelinin sorumlu olabilir diamin.
Reaksiyon zamanı nanopartiküllerin son morfolojisi ve elde şeker bağlanma derecesi hem de etkileyebilecek bir diğer değişkendir. Reaksiyon süresi ayarlayarak, nanopartiküller yüzeyine iliştirilmiş nihai şekeri konsantrasyonları Şekil 4A'da gösterildiği gibi, kontrol edilebilir. Beklenildiği gibi, 50:50 CPTEG yüzeyinde dimannose konsantrasyonu: CPH nanoparçacıklar artmıştırReaksiyon süresi ve toplam 18 saat sonra maksimum ulaşmıştır. 24 saat toplam reaksiyon zamanı ile fonksiyonelleştirilmiş Nanopartiküller fare kemik iliği kökenli dendritik hücreler (DC) üzerine CLRs hedef yeteneklerini değerlendirmek için kullanıldı. Flow sitometri iki CL reseptörleri (yani, Cire (CD209, DC-SIGN) ve mannoz reseptörü (CD206)) non-fonksiyonlandırılmış ile uyarılması sonrasında ve laktoz ve di-mannoz fonksiyonlandırılmış nanopartiküller (Şekil 4B) ifadesi değerlendirmek için kullanıldı. Hücreler laktoz ve di-mannoz fonksiyonlandırılmış nanopartiküller her ikisi ile uyarılan edildiğinde etkili hedefleme bir göstergesidir Her iki reseptör daha yüksek bir ifadesi, elde edildi. Bununla birlikte, di-mannoz-fonksiyonlu parçacıklar incelenmiştir reseptörleri için, bu bir ligant spesifite gösteren ifade daha yüksek bir seviyeye gösterdi.
| Nanopartikül tipi | Ortalama Partikül Çapı (nm) | Aveöfke Parçacık ζ-Potansiyeli (mV) |
| Sigara fonksiyonlandırılmış | 162 ± 43 | -20 ± 0.6 |
| Laktoz | 235 ± 34 | 26 ± 2.4 |
| Di-mannoz | 243 ± 32 | 30 ± 4.2 |
Tablo 1. Nanopartikül karakterizasyonu. Sigara fonksiyonlandırılmış ve fonksiyonlandırılmış yarı elastik ışık saçılması ve zeta potansiyel ölçümleri ile karakterize edildi. Parçacık boyutu verileri ortalama değer ± üç bağımsız deneyde toplanan dinamik ışık saçılımı verilerinin standart sapma (SD) temsil eder. Zeta potansiyel veriler ortalama değer ± SD üç bağımsız okuma temsil eder. CPH nanoparçacık yüzey: zeta potansiyelin işareti olarak değiştirin ki şeker 50:50 CPTEG verimli konjuge göstermektedir.
= "/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
Şekil 1. Karbonhidrat polianhidrid nanopartiküllerin fonksiyonlandırmalar ve açıklanan yüksek verimlilik yaklaşımı ile tasarlanmış olabilir fonksiyonlandırılmış nanoparçacık kütüphanelerin bir örnek ile izlenen yaklaşımın (A) grafiksel gösterimi. (B) otomatik yerleştirme tertibatı şematik gösterimi (i) Üç KD 1000 pompaları oluşan parçacık fonksiyonlandırmalar için kullanılan, (ii) bir robot aşamada iki aktüatörler (Zaber) tarafından entegre: x yönünde hareket için bir ve diğer iki komşu raf (tüpler ve küvetler için uygun) üç aktüatörler, her yön için bir (x, y ve z) oluşan ile (iii) bir ikinci aşama robotik; y yönde hareket için. Pompalar ve beş aktüatörler toplam seri olarak bağlanmış. Aktüatörler ve pompalar LabVIEW yazılımı kullanarak bir bilgisayar tarafından işletilmektedir. Bu şema ölçek değildir.arge.jpg "target =" _blank "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Otomatik grafiksel gösterimi örnek olarak mannoz kullanarak karbonhidrat sentezi iteratif.
Şekil 3. Korunan dimannoside 1 H-NMR.
Şekil 4. (A) Sakkarit ve nanoparçacık yüzey konsantrasyonu reaksiyon süresi etkisi. Gösterilen veriler, 50:50 CPTEG: CPH nanopartiküller farklı reaksiyon bazen dimannose ile fonksiyonelleştirilmiş edildi ve reaksiyon 4 gerçekleştirildi ° C. İki bağımsız fonksiyonlandırmalar deneylerin ortalama ve standart hata gösterilir. (B) Laktoz ve di-mannoz fonksiyonlandırılmış nanopartiküllerelde ifadesi ile karşılaştırıldığında CPH nanopartiküller: Kemik fonksiyonlandırılmış 50:50 CPTEG ile uyarıldıktan sonra bu iki belirteçlerin gelişmiş ifadesi gösterdiği gibi iliği kökenli dendritik hücreler üzerinde etkili hedef DC-SIGN (Cire, CD209) ve mannoz reseptörü (CD206) non-fonksiyonlu partikülleri ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bağışıklık hücreleri için doğrudan nanoparçacık etkileşimler maddeleri hedeflemek olarak karbonhidrat etkinliği, daha önce 10, 11 gösterilmiştir. Laboratuvarlarımızda Önceki araştırma ve böylece daha fazla T hücre aktivasyonunun 10, 11 için önemli olabilir bağışıklık hücreleri aktivasyonu arttırılması, polianhidrid nanopartiküller bağlı belirli şekerler antijen sunan hücreler (APC) üzerinde farklı CLRs hedeflemek için mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, çeşitli parametreleri gibi polianhidrid-kimya, boyut, şeker veya yüzey şeker tipi yoğunluğu-gerekir optimize edilmesi ve bu nedenle böyle bir çok-parametrik sistemi ile ilişkili karmaşıklıklara ortaya çıkarmak için imalat yönteminde verim olarak artan hedefleme elde etmek için uygun büyük bir değer olacaktır. Ayrıca, biyo, enzim immobilizasyonu ve foodb tespiti de dahil olmak üzere araştırma diğer ilgili alanlarda, büyük değeri ise fonksiyonlandırılmış nanopartiküllerin kullanımıOrne patojenler.
Karbonhidrat anlatılan yüksek verimli sentezi kullanarak, karbonhidrat moleküllerinin tekrarlanabilir sentezinde zorlukları hafifletilebilir. Aynı şeker otomatikleştirilmiş paralel reaksiyonlar gerektiği gibi malzemeden daha büyük miktarda üretebilir. Şeker ve glycoconjugates ile bilinen rolleri hızla genişletiyoruz. Bununla birlikte, birçok işlemler karbonhidrat moleküler mekanizmaları, örneğin sinyal iletim yollarının veya hücresel tanıma işlemlerinin 21 bir anlayış, yapısal olarak iyi tanımlanmış sakkaritlerin kolay ve ucuz bulunup bulunmamasına bağlıdır. Hassas zincir uzantılı için çeşitli hidroksil gruplarının reaktivitesi kontrol etmek için koruma / korumanın kaldırılması stratejiler şeker sentezi için gerekli olan bir asal, fakat yorucu ve zaman alıcı. Oligonükleotidler ve oligopeptid düzenli ve verimli bir şekilde otomatikleştirilmiş birleştiriciler 22, 23 ile sentezlenir. Bir katı faz synthesizer ava olduğunu yapı blokları arasında, örneğin, aşırı geniş (adım kuplaj başına 5-20 eşdeğer), reaksiyonun basit ilerleme izleme olmaması, ve kullanılan katı-faz reçine değiş: oligosakarit sentezi 24, fakat uğrar ciddi dezavantajlarından için ilable . Yeni bir çözelti faz otomasyonu platform, bununla birlikte, bu değerli yapı blokları arasında, sadece 2-3 eşdeğer gerektirir. Bu tür bir platform alkenil grubu olarak fluorous fluorous etiketler, çok çeşitli, non-fluorous bileşikler 18, 25, 26 kolaylıkla ara ürünler arındırmak için (FSPE) fluorous katı faz ekstraksiyonu sağlar. Burada gösterildiği gibi Bununla birlikte, bu etiketlerin çözelti faz glikozilasyon ve standart bir organik solvent içinde deproteksiyon reaksiyonları önlemek değildir. Ayrıca, her bir katı-faz otomatik bir sentezleyici farklı olarak, bu yeni bir platform gibi kütle spektrometre (MS) ve herhangi bir aşamada, ince tabaka kromatografisi (TLC) gibi standart bir reaksiyon izleme stratejiler sağlar.
ontent "> olarak burada sunulan nanopartiküllerin yüksek verimlilik fonksiyonlandırmalar ardından sonuç bölümünde açıklanan, fonksiyonlandırmalar sonra optimal nanoparçacık morfolojisi ulaşmak için reaksiyon koşulları (örneğin, reaksiyon süresi ve sıcaklık) optimize edilmiştir. Optimum reaksiyon sıcaklığı optimize edilmesi gerekebilir nanopartiküller (örneğin, cam geçiş sıcaklığı (Tg), degradasyon oranı) imal etmek için kullanılan polimerin özellikleri bağlı. Örneğin, düşük T g (oda sıcaklığı altında) sahip polimerler kullanılırken, fonksiyonlandırmalar reaksiyonlar gerçekleştirildi gerekecektir Araştırma grubumuzda kullanılan polianhidrid kimyaları bazıları için durum düşük sıcaklıklarda,. parçacık fonksiyonlandırmalar için istihdam toplam tepki sürelerini kısaltıyor farklı bozulma oranları ile partikül kimya fonksiyonelleştirilmiş gerekir özellikle arzu edilir. kısa reaksiyon süresi idealdir olabilir toplu aşındırarak malzemeler e fonksiyonalizeözel bir hedefleme şeker ilaç veya protein yüklü parçacıkların bağlı gerektiğinde. Partikül yüzeyinde şeker konsantrasyonu, bu taşıyıcılar biyolojik performansı yönlendirmek için önemli bir değişken olabilir. Şeker konsantrasyonu değişen biyolojik sonucu laboratuarımızda çalışmanın güncel bir alandır. Bu yüksek performans kullanımı imal kurmak ve fonksiyonlandırılmış polianhidrid nanopartiküller hızlı konvansiyonel imalat ve işlevsel yöntemlerden daha çok değişkenlerin test için izin verir. Yüksek verimlilik tekniğin ana sınırlaması cihazı sahipleri sığabilecek kapların boyutu ile sınırlı olduğundan elde edilebilir parçacıkların maksimum parti boyutu: Ancak, bu set kadar ana kullanım yana tarama için Daha küçük boyutu kesikli verimli bir şekilde, bu amaçla kullanılacak edilebilir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
NLBP kurucularından ve karbonhidrat şirket LuCella Biosciences, Inc özkaynak tutar
Acknowledgments
Yazarlar, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı teşekkür (Grant # W81XWH-10-1-0806) ve mali destek için Ulusal Sağlık Enstitüleri (Grant # U19 AI091031-01 ve Grant # 1R01GM090280) olacaktır. BN Kimya ve Biyoloji Mühendisliği Balloun Profesörlük kabul eder ve NLBP Disiplinlerarası Mühendislik Wilkinson Profesörlük kabul eder. Biz nanoparçacık fonksiyonlandırmalar deneyler ona yardım için Julia Vela teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Motorized XYZ Stage: 3x T-LSM050A, 50 mm travel per axis | Zaber Technologies | T-XYZ-LSM050A-KT04 | |
| NE-1000 Single Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE-1000 | |
| Pyrex* Vista* Rimless Reusable Glass Culture Tubes | Corning | 07-250-125 | |
| ASW 1000 | Chemspeed Technologies | ||
| LabVIEW | National Instruments | 776671-35 | |
| SGE Gas Tight Syringes, Luer Loc | Sigma Aldrich | 509507 | |
| XL-2000 Sonicator | Qsonica | Q55 | |
| Mini-tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 |
References
- Zepp, F. Principles of vacine design-lessons from nature. Vaccine. 28, C14-C24 (2010).
- Ulery, B. D., Phanse, Y., Sinha, A., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B., Bellaire, B. H. Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres. Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).
- Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Lopac, S. K., Phanse, Y., Carrillo-Conde, B., Ramer-Tait, A. E. Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation. Acta Biomater. 7, 2857-2864 (2011).
- Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release. Biomaterials. 28, 108-116 (2007).
- Petersen, L. K., Ramer-Tait, A. E., Broderick, S. R., Kong, C. S., Ulery, B. D., Rajan, K. Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants. Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).
- Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells. Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).
- Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres. J. Biomed. Mater. Res. B. 91, 938-947 (2009).
- Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Protein stability in the presence of polymer degradation products: Consequences for controlled release formulations. Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).
- Determan, A. S., Lin, V. S. Y., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres. J. Controlled Release. 100, 97-109 (2004).
- Chavez-Santoscoy, A., Roychoudhury, R., Ramer-Tait, A. E., Pohl, N. L. B., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. Tailoring the immune response of alveolar macrophages by targeting different C-type lectin receptors using "pathogen-like" amphiphilic polyanhydride nanoparticles. Biomaterials. , Forthcoming (2011).
- Carrillo-Conde, B., Song, E. -H., Chavez-Santoscoy, A., Phanse, Y., Ramer-Tait, A., Pohl, N. L. Mannose-functionalized "pathogen-like" polyanhydride nanoparticles target C-type lectin receptors on dendritic cells. Mol. Pharmaceutics. 8, 1877-1886 (2011).
- Carrillo-Conde, B., Schiltz, E., Torres, M. P., Yu, J., Phillips, G., Minion, C. Amphipilic polyanhydrides for stabilization of Yersinia pestis antigens. Acta. Biomater. 6, 3110-3119 (2010).
- Reddy, S. T., Swartz, M. A., Hubbell, J. A. Targeting dendritic cells with biomaterials: developing the next generation of vaccines. Trends Immunol. 27, 573-580 (2006).
- Higashi, N., Fujioka, K., Denda-Nagai, K., Hashimoto, S., Nagai, S., Sato, T. The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derived immature dendritic cells. J. Biol. Chem. 277, 20686 (2002).
- Geijtenbeek, T. B. Signalling through C-type lectin receptors: shaping immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9, 465-479 (2009).
- Seeberger, P. H. Automated oligosaccharide synthesis. Chem. Soc. Rev. 37, 19-28 (2008).
- Seeberger, P. H. Automated Carbohydrate Synthesis as Platform to Address Fundamental Aspects of Glycobiology-Current Status and Future Challenges. Carb. Res. 343, 1889-1896 (2008).
- Jaipuri, F. A., Pohl, N. L. Toward solution-phase automated iterative synthesis: fluorous-tag assisted solution-phase synthesis of linear and branched mannose oligomers. Org. Biomol. Chem. 6, 2686-2691 (2008).
- Petersen, L. K., Chavez-Santoscoy, A., Narasimhan, B. Combinatorial synthesis of and high-throughput protein release from polymer film and nanoparticle libraries. J. Vis. Exp. , Forthcoming (2011).
- Song, E. -H., Osanya, A. O., Petersen, C. A., Pohl, N. L. B. Synthesis of multivalent tuberculosis and Leishmania-associated capping carbohydrates reveals structure-dependent responses allowing immune evasion. J. Am. Chem. Soc. 132, 11428-11430 (2010).
- Hakamori, S. Aberrant glycosylation in tumor and tumor associated carbohydrate antigens. Adv. Cancer Res. 59, 257-331 (1989).
- Atherton, T., Sheppard, R. C. Solid-phase peptide synthesis: a practical approach. , Oxford Univ Press. Oxford, UK. (1999).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA chemistry and the uses. Science. 230, 281-285 (1985).
- Plante, O. J., Palmacci, E. R., Seeberger, P. H. Automated solid- phase synthesis of oligosaccharides. Science. 291, 1523-1527 (2001).
- Ko, K. -S., Park, G., Yu, Y., Pohl, N. L. Protecting group-based colorimetric monitoring of fluorous-phase and solid-phase synthesis of oligoglucosamines. Org. Lett. 10, 5381-5384 (2008).
- Pohl, N. L. Automated solution-phase oligosaccharide synthesis and carbohydrate microarrays: development of fluorous-based tools for glycomics. Chemical Glycobiology. Chen, X. H. R., Wang, G. P. , American Chemical Society. Washington, DC. 272-287 (2008).
