Summary
的视频oculography是一个非常量化的方法来研究眼球运动表现以及运动学习。在这里，我们描述如何衡量小鼠视频oculography。对正常应用这项技术，药物治疗或转基因小鼠是一个强有力的研究工具，探索潜在的生理运动行为。
Abstract
为了跟踪一个对象或稳定在视网膜上的图像在运动，眼球运动是非常重要的。没有凹的动物，如鼠标，有能力是有限的目标锁定到他们的眼睛。相反，这些目标导向的眼球运动，代偿眼眼球运动很容易，引起在1,2,3,4 afoveate的动物。补偿眼球运动所产生的处理前庭和视动到一个命令信号的信息，这将推动眼部肌肉。前庭和视动性信息的处理，可以单独和共同研究，使赤字在动眼神经系统的规范。动眼神经系统可以唤起视动反射（OKR），前庭眼反射（VOR）或视觉增强前庭眼反射（VVOR）测试。 OKR是一种反射运动，为“全领域”在视网膜上的图像运动补偿，而VOR是一个反射眼Movement补偿头部运动。 VVOR是反射眼球运动，使用两个前庭以及视动性信息，以作出适当的赔偿。小脑监控，并能够适应这些补偿性眼球运动。因此，oculography是一个非常强大的工具，以探讨在正常脑行为的关系，以及病理条件下（前庭，眼和/或小脑的起源FE）。
测试动眼神经系统，作为一种行为模式，有趣的是以下几个原因。首先，动眼神经系统是一个理解的神经系统。第二，动眼神经系统是相对简单的6球插座架构（“单联”）和额外的眼部肌肉7三对可能眼球运动的数额由有限。第三，行为输出和感官输入可以很容易地进行测量，这使得这对定量一个非常方便的系统分析8。许多行为测试缺乏这定量电源的高层次。最后，动眼神经系统的性能以及可塑性可以进行测试，使研究学习和记忆过程9。
时下广泛使用的转基因小鼠，它们形成了一个在探索10个不同层次的脑功能的重要来源。此外，他们还可以用来作为模型来模拟人类疾病。应用的正常oculography，药物治疗或转基因小鼠是一个强有力的研究工具，以发掘潜在的生理正常和病理条件下的运动行为。在这里，我们描述如何衡量在小鼠8视频oculography。
Protocol
1。准备
与杜赫动物实验伦理委员会根据以下实验进行。
- 准备视频-oculography的小鼠。为了测量眼球运动鼠标，鼠标的头部，需要被固定。因此，一个基座建设鼠标头骨（ 图1）。
- 麻醉由异氟醚的混合物（异氟醚1-1.5％，法国罗地亚Organique精细有限公司）鼠标和氧气在毒气室。过多的气体被清除。通过鼻锥维持麻醉。通过脚趾掐确认的麻醉深度。
- 肛门热敏使用和加热垫（金控，Bowdoinham，ME）的体温保持在37°C。
- 眼膏（duratears，爱尔康，比利时）覆盖保护他们的眼睛。刮胡子背颅毛皮的，清理手术区旋转擦洗和betadine或洗必泰溶液。
- 使中间线切口，暴露头骨的颅背表面。使表面的清洁和干燥。
- 应用磷酸（磷酸凝胶蚀刻37.5％;克尔，CA）的下降，从囟门的lambda头骨的颅背表面上。 15秒后取出腐蚀剂和面颅再次盐水和干燥清洁。
- 申请下降了OptiBond总理（科尔，CA）和空气干燥30秒这个表面蚀刻颅顶部。
- 放置的顶级的OptiBond总理胶粘剂OptiBond（科尔，CA）的下降，治愈1分钟（千里马480可见光固化装置;亨利施恩，美国）。
- 覆盖一层薄薄的魅力复合贺利氏古莎（德国）的粘接层。嵌入两个连接螺母（直径3毫米）的复合材料。与光固化复合事后。必要时，申请额外的复合层与光固化。
- 广告部长丁丙诺啡（0.015毫克/公斤，SC）手术后的镇痛。约5分钟内的动物应该是它的脚。允许鼠标在室温中恢复，手术后至少3天在家里笼。
- 对小鼠的视频oculography设置（ 图2）。
- 鼠标放置在限位和修复的拦阻他的头两个螺丝（ 图1）。鼠标不需要麻醉此过程。限制时间不应超过1小时/天。
- 安装鼠标的头部和身体的XY平台上的拦阻，而这又是后安装的转盘（直径：60厘米）。使用XY平台，可以放置鼠标头以上的转盘中心。移动鼠标可以在俯仰，偏航和辊轴。鼠标的头部被放置在正确的俯仰，偏航和横滚角对准眼睛，用眼，由ISCAN或连结产生的视觉形象米。另外，基座建设，可以放在鼠标的头在一个立体的框架11。
- 转盘连接到交流伺服控制电机（谐波传动公司，荷兰）和转盘的位置进行监测转盘轴连接一个电位（BOURNS公司，加利福尼亚）。
- 圆柱形（直径：63厘米高度：35厘米），与周围的屏幕随机点模式（每个元素2°），涵盖了转盘，这个鼓也配备交流伺服控制电机（谐波传动公司，荷兰） 。监测的圆柱形屏幕上的位置由一个电位连接轴和屏幕可以点亮一盏卤素灯（20瓦）（BOURNS公司，加利福尼亚）。周围的屏幕和转盘独立驱动。
- 转盘和屏幕周围的运动控制由计算机连接到一个I / O接口（海关有限，剑桥，英国）。钽BLE和周围的屏幕上的位置信号进行过滤（截止频率：20赫兹），I / O接口的数字化和存储在这台电脑上。
- 三个红外线发射器照射老鼠的眼睛（600兆瓦，分散角度：7°，峰值波长：880纳米，RS元件，荷兰）。两个红外线发射器是固定在转盘上，第三个发射器连接到相机。这第三个发射器产生一个参考角膜反射（CR），这是在校准过程中和在眼球运动记录。
- 配备变焦镜头（NAVITAR公司变焦6000，纽约）一个红外CCD相机连接到转盘和转盘的中心集中在鼠标头。相机可以完全超过20°解锁并可以在校准过程中的转盘轴yawed。
- 视频信号处理系统的ETL-200，ISCAN，伯灵顿，马眼跟踪。该的ISCAN系统使用算法rithm追踪瞳孔和参考CR中心。该系统可以追踪在水平和垂直方向的瞳孔和参考CR在120赫兹的采样率。
- 参考CR的位置，瞳孔位置和瞳孔大小的信号通过I / O接口的数字化，并存储在相同的文件表和周围的屏幕上的位置信号。视频瞳孔跟踪系统引起的眼球运动信号约27毫秒的延迟。
2。使用视频瞳孔跟踪校准和测量眼球运动
眼球跟踪系统捕获的瞳孔作为平移运动的运动。追踪瞳孔的平移运动包含平移的组成部分，由于旋转中心的眼睛和眼睛的角膜曲率中心（即）的解剖中心，由于眼球的旋转角度和旋转组件之间的轴向差异。通过减不受欢迎的翻译部分参考CR ING从瞳孔运动/位置，被淘汰的信号，致使眼球的旋转，这只是由于在平移运动。虽然他们往往非常小，减法也消除了头部和相机之间的翻译。 8,12以下的标定方法，残余的孤立的平移运动转换成角旋转眼球。该校准之前进行任何眼动实验。
- 调整鼠标的头部位置的摄像头，视频图像的瞳孔位于显示器的中间，位于以上，最好是直接的眼睛瞳孔的垂直中线的参考CR表示，在这样一种方式。最小化的参考CR运动，由于角度的摄像机旋转，可放置在摄像头/表轴角膜曲率中心完成。/ LI>
- 几次旋转的摄像头+ / - 10°垂直轴周围的转盘（即20度的峰峰值）。使用追踪瞳孔（P）和记录在摄像机的旋转的极端立场的参考CR的位置来计算的瞳孔的旋转半径（RP; RP =Δ/罪（20°），其中Δ=（CR -P）参见图3A）。
- 由于RP值瞳孔的大小取决于事实，瞳孔大小校正需要实现12（ 图3B）。重复加强2.2多次在各种光照条件下（即操纵瞳孔的大小， 图3C），以确定瞳孔的大小- RP的关系，并组成一个RP校正曲线（ 图3D）。 RP值还取决于垂直眼位。实验时将导致垂直眼球运动，然后垂直眼睛位置的校准校正是非常可取的13。
- 通过测量参考CR的位置，P位置和瞳孔大小的眼睛（五）确定的角位置。参考CR位置减去学生产生平移免费瞳孔位置的位置。通过测量瞳孔大小的RP值可以提取RP校正曲线和E可以通过使用下列公式计算Ë= arcsin（Δ1）/ RP}（ 图4A，Δ1=（2 - P 1）和P 1和P 2修正的参考CR减法）。
- 一个转盘和/或周围的屏幕旋转的大型剧目，现在可以用来刺激动眼神经系统。为了执行老鼠的眼睛在黑暗中视频oculography，必须用缩瞳药物预处理限制瞳孔扩张，并允许在这种情况下，瞳孔跟踪。在我们的实验中，我们用毛果芸香碱（4％，肖实验室，法国），以限制瞳孔扩张黑暗中。
3。数据分析
- 眼睛的位置，表的位置和周围的屏幕位置都转换成角的位置（ 见图4B和公式2.4）。眼科信号延迟27毫秒诱导其纠正，由瞳孔跟踪系统的图像处理。
- 眼表及周边屏幕的角位置是有区别的，巴特沃斯低通使用截止频率为20赫兹的切割过滤器过滤。
- 扫视眼使用检测阈值的40°/ s的速度信号被删除。数据被删除过路的检测阈值后，开始前，高达80毫秒20毫秒。
- 在每一个人的踪迹（ 图4C）周期表，周围的屏幕和眼睛的速度信号的平均值。
- 平均信号都配有相应的功能。在一般情况下，使用正弦速度刺激和平均周期配备窦或cosinus功能（ 图4C）。然后，增益可眼速度的刺激速度的比值计算，可作为眼睛的速度和刺激的速度之间的差异（度）计算，而阶段。
4。代表结果
，视频oculography可以用来探讨各种的动眼神经表演形式（即视动反射：OKR;前庭眼反射：VOR的视觉增强前庭眼反射：VVOR）以及电机学（VOR的适应; OKR适应）。 OKR补偿使用视觉反馈的低频干扰。 OKR旋转的周围照屏幕（ 电影1）可诱发。旋转超过0.2 -1.0幅度为1.6°赫兹的频率范围内的周边屏幕显示的视动系统在低频率范围内THA是一种更有效的补偿机制如何n在高频率范围内（ 图5A）。 VOR的补偿高频头使用信号从前庭器官的运动。在黑暗中（ 电影2）动物（即转盘）旋转的VOR可诱发。超过幅度为1.6°，0.2 -1.0赫兹的频率范围旋转的转盘，前庭眼系统演示了如何更有效的补偿眼球运动产生的高频率范围比在低频率范围（ 图5A） 。在演唱会视动和前庭眼系统的行为时，图像可以稳定在视网膜上的头部运动的广泛。超过幅度为1.6°，0.2 -1.0赫兹的频率范围旋转的转盘，而周围的屏幕照（ 电影3）眼如何产生“高”在整个频率范围内增益补偿运动（ 图5A ）。所有这些增益和pH值ASE值是为小鼠典型，虽然性别14和应变15,16,17差异。
在转盘和周围的屏幕的独立控制，使我们面对与老鼠之间的视觉和前庭信息不匹配。长期不匹配的视觉和前庭信息和统一的接触后，鼠标的VOR会改变，以弥补改变视觉输入（VOR的适应; 电影4）。旋转转盘阶段（即180°）与周边屏幕（1赫兹，1.6°），增加的VOR增益（ 图5B）。中的VOR增益的最大变化，当使用一个审判的学习范例，往往达到30分钟后。
图1。鼠标的头部和身体限位示意图绘制。鼠标的身体受到抑制使用直径35毫米的塑料圆筒形管。鼠标的头部被铁棍连接鼠标的底座，用两个螺钉固定。铁条，使30度角，以头鼠标定位在行走过程中的正常间距。 *，包含两个螺母座的顶视图。
图2。示意图的鼠标视频oculography的设置。
图3。视频瞳孔跟踪系统的校准。 A）该相机+ / - 10°（即20度，峰峰值）围绕垂直轴转盘旋转几次。跟踪的瞳孔（P）和参考角膜反射（CR）记录在摄像机的旋转的极端立场是用来计算的瞳孔半径旋转（RP）。乙）瞳孔直径的半径是依赖于瞳孔的大小。 c）示例显示在校准过程中的瞳孔大小瞳孔位置的影响（无论是在像素（px））。四）Rp和瞳孔直径之间的关系，在一个单一的鼠标。完成了13个不同的瞳孔直径，通过改变周围的光线强度。
图4。使用视频瞳孔跟踪测量和分析眼球运动。一）角瞳孔位置计算半径（RP）的瞳孔和瞳孔的位置（P，为华润位置纠正）。乙）代偿眼球运动为例诱导刺激前庭和视觉系统（视觉增强的VOR）。转盘旋转正弦幅度为1.6°，0.6赫兹，而周围的屏幕上是良好的照明。 c）分析记录在B所示）。图表显示平均速度跟踪转盘（蓝色）和学生（红色）。这些平均痕迹装有一个正弦函数（黑色）。
图5。一个C57BL6鼠标测量动眼神经系统的性能和学习。周围的屏幕旋转（视动反射：OKR，顶部面板），通过旋转鼠标在黑暗中（前庭眼反射：VOR的，中板），并在光通过旋转鼠标（视）眼球运动所产生的增强前庭眼反射：VVOR，底部面板）频率范围从0.2到1.0赫兹的幅度为1.6°。从眼睛的速度和刺激的速度（右面板）之间的相位差计算眼速度的刺激速度的比值（左侧面板）和相位的反射，反射的增益计算。二）汽车学习完成自适应增加的VOR使用了一个阶段的训练范例。鼠标到visuovestibular培训范式鼠标旋转是与周边屏幕，四十分钟（均在1.0赫兹，1.6°旋转）旋转（180°）相。每隔10分钟测试的VOR（1.0赫兹，1.6°）。在这种鼠标阶段的训练了增加的VOR增益。
电影1。动画显示的范例，诱导小鼠OKR 点击这里观看电影 。
电影2动画显示诱导小鼠的VOR范式。 点击这里观看电影 。
电影3。动画显示的范例诱导小鼠VVOR的。.com/files/ftp_upload/3971/3971movie3.mov“目标=”_blank“>点击这里观看电影。
电影4。动画显示visuovestibular出诱导小鼠（增加）的VOR适应阶段的训练范例。 点击这里观看电影 。
Discussion
为了获得高品质的视频眼球运动记录小鼠几项要求是必要的。校准过程必须在上述的标准化问题。例如偏离中心的校准时，瞳孔不上的参考CR垂直中线定位在校准过程中，会导致的RP被低估，因此高估的眼球运动。此外，我们建议整合在校准过程12瞳孔大小的校正方法，因为试验表明一个非常稳定的瞳孔大小是非常罕见的。即使是在审讯过程中的小应激已经可以大幅改变瞳孔直径。
眼动实验设计时，必须考虑下列因素或控制，因为它们是已知的影响眼球运动反应：14 13,18年龄，性别和应变15,1619。此外，实验动物应该有色素的虹膜是不可能的，当瞳孔和虹膜之间的对比度太低，像在BALB / c小鼠，因为瞳孔检测和跟踪。极度紧张或焦虑的动物需要进行培训，实验前，习惯于实验设置和约束条件。这种动物处理过程的结果在更短的封闭或半封闭的眼睛，并防止在实验过程中产生眼流体，从而实现更好的瞳孔追踪。
最后，获取和分析数据，需要两到三个小时，每头牲畜。因此，眼球运动记录可能会保持一个特定的程序，适用于选择小鼠，不适合作为一种高通量筛选试验。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们诚挚地感谢荷兰健康研究与发展组织（牡丹江，CDZ），荷兰科学研究组织（CDZ），NeuroBasic（CDZ），（CDZ）贝娅特丽克丝全宗，“SENSOPAC（CDZ），C7（CDZ）和Prinses CEREBNET（CDZ）欧洲共同体的财政支持方案。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluran | Rhodia Organique Fine LTD | ||
| Heating pad | FHC | 40-90-8 | |
| Duratears | Alcon | ||
| Phosphoric acid gel | Kerr | 31297 | |
| Optibond prime | Kerr | 35369 | |
| Optibond adhesive | Kerr | 35369 | |
| Charisma composite | Heraeus Kulzer | ||
| Maxima 480 light curing unit | Henry Schein | ||
| AC servo-controlled motor | Harmonic drive AG | ||
| Cylindric screen | |||
| Halogen light (20 W) | RS components | ||
| Potentiometers(precision) | Bourns inc. | 6574 | |
| Power 1401 (I/O interface) | CED limited | ||
| Computers | Dell | ||
| Infrared emmitters | RS components | 195-451 | |
| ETL-200 | ISCAN | ||
| Zoom lens (zoom 6000) | Navitar inc. | ||
| Pilocarpinenitrate (minims) | Laboratoire Chauvin |
References
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