Summary
Digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie von postkapillären Venolen in der cremasterica Mikrozirkulation ist eine bequeme Methode, um Einblicke in die Leukozyten-Endothel Interaktion zu gewinnen
Abstract
Ischämie-Reperfusionsschaden (IRI) wurde in einer großen Reihe von pathologischen Zuständen, wie z. B. Schlaganfall, Herzinfarkt, intestinale Ischämie sowie nach der Transplantation und Herz-Kreislauf-Chirurgie. 1 Reperfusion des zuvor ischämischen Gewebe in Verbindung gebracht, während die wesentlich für die Vorbeugung irreversibler Gewebeverletzung, entlockt übermäßige Entzündung des betroffenen Gewebes. Angrenzend an die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies, die Aktivierung des Komplementsystems und erhöhte mikrovaskuläre Permeabilität, die Aktivierung von Leukozyten eine der wichtigsten Akteure in der pathologische Kaskade von Gewebeschäden während der Reperfusion ist. 2, 3 ist Leukozytenaktivierung ein mehrstufiger Prozess, bestehend Walzen, feste Adhäsion und und wird durch eine komplexe Interaktion zwischen Adhäsionsmolekülen in Reaktion auf Lockstoffe wie Komplement, Chemokine oder der Plättchen-aktivierenden Faktor vermittelt werden. 4
<p class = "jove_content"> Während Leukozytenrollen in postkapillären Venolen wird überwiegend durch die Wechselwirkung der Selektine mit ihren fünf Zähler Liganden, feste Adhäsion von Leukozyten an das Endothel ist Selectin-gesteuerten über Bindung an intrazelluläre Adhäsionsmoleküle (ICAM) und vaskuläre zellvermittelten Adhäsionsmoleküle (VCAM). 6, 7Goldstandard für die in vivo-Beobachtung von Leukozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung ist die Technik der Intravitalmikroskopie, erstmals 1968 beschrieben. 8
Obwohl verschiedene Modelle von IRI (Ischämie-Reperfusionsschaden) für verschiedene Organe beschrieben worden sind, sind nur wenige 9-12 geeignet für die direkte Visualisierung der Rekrutierung von Leukozyten in der mikrovaskulären Bett auf einem hohen Niveau der Bildqualität. 8
Wir fördern hier die digitale intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie der postkapillären Venole in der Mikrozirkulation cremastericader Ratte 13 als eine bequeme Methode, um qualitativ und quantitativ analysieren Leukozytenrekrutierung für IRI-Forschung in der quergestreiften Muskulatur und eine detaillierte Anleitung zur Durchführung des Verfahren. Wir erläutern häufigsten Fallstricke und geben nützliche Tipps, die den Leser in den wirklich zu schätzen, und sicher ausführen sollte die Methode.
In einer Schritt für Schritt zeigen wir Protokoll, wie man mit der Atmung gesteuerten Anästhesie unter ausreichender Kontrolle zu halten, das Tier narkotisiert fest für längere Zeit loszulegen. Anschließend beschreiben wir das cremasterica Vorbereitung als dünne flache Platte für herausragende optische Auflösung und ein Protokoll für die Leukozyten-Bildgebung in der IRI, aber gut in unseren Labors etabliert.
Protocol
1. Anästhesie und Monitoring
- Entsprechende nationale und institutionelle Ethik sollten vorhanden sein, bevor Tierversuche. Nach Zustimmung der Ethikkommission Anesthetize männlichen Sprague Dawley Ratten mit einem Körpergewicht von 120 bis 180 g. Liefern Sie 2 bis 3 Vol.% Isofluran zu einer Plexiglas-Box über Isofluran Verdampfer und legen Sie die Ratte im Inneren.
- Sobald die angemessene Höhe der Anästhesie erreicht wird (fehlende Reaktion bis Fuß oder Schwanz Pinch) der Ratte gewichtet wird rasiert und auf der ventralen zervikalen Bereich.
- Platzieren Sie die Ratte in Rückenlage auf ein Heizkissen auf Körpertemperatur bei 37 ° C gehalten wird und gelten für 2 Vol.% unter Verwendung einer Silikon-Maske Isofluran.
Die folgenden Schritte sind Vorbereitung am besten mit einem Operationsmikroskop.
- Für die Herstellung der Luftröhre, die Halsschlagader und die Halsschlagader, führen Sie einen 2 cm horizontalen Hautschnitt im Bereich of das Jugulum und mobilisieren die Speicheldrüsen seitlich.
- Sie stehen nun vor der ventralen Halsmuskeln. Sorgfältig trennen sie in der Mittellinie und finden Sie die Luftröhre. Expose 1 - 2 cm der Luftröhre und platzieren Sie ein Mikropinzette unter sie, um ihn wieder aufrichten.
- Jetzt etwa auf halber Strecke Schlitz durch die Bauchseite der Luftröhre. Achten Sie darauf, den ganzen Weg durch geschnitten, wenn Sie das tun, das abgeschnittene Ende der Luftröhre rutscht wieder in die Brust und sehr schwierig sein, mit zu arbeiten.
- Einfügen eines Abbocath Rohr (14G) als Trachealtubus in den unteren Teil der Luftröhre, die zuvor an ein Tier Beatmungsgerät angeschlossen verwendet. Tipp: Firma Fixierung auf Magnet Schellen sowie die Vernähung der Luftröhre um das Rohr ist wesentlich, den Trachealtubus an Ort und Stelle zu halten. Im Allgemeinen haben wir terylene 5/0 Nahtmaterial verwenden, können jedoch ähnliche Nahtmaterial verwendet werden.
- Die Atmung kann dann sein Volumen kontrollierte (Frequenz, 35 bis 45 Atemzüge / Minute; Atemzugvolumen, 4,5 bis 5 ml; FiO 2 14 Atelektase kann durch Aufrechterhaltung eines positiven endexspiratorischen Druck von 5 bis 10 mm H 2 O. 15 verhindert werden
- Für die Karotis canulation, wird der rechte M. sternohyoideus stumpf getrennt, um die Halsschlagader finden.
- Trennen Sie den Vagusnerv vorsichtig aus der Arteria carotis und montieren Sie die Arterie auf einer abgewinkelten Mikropinzette zu stoppen Blut fließt aus dem Herzen.
- Überwindet zwei gleich lange Stücke von Nahtmaterial unter der Halsschlagader. In Bezug auf das Herz, die mehr distalen Naht eng an Blut aus dem Kopfbereich während das proximale Naht lose um die Halsschlagader gebunden zu verschließen gebunden.
- Verwendung Mikroscheren ein kleiner Schnitt in die Halsschlagader zwischen den Ligaturen aus.
- Einfügen eines Polyethylenkatheter (0,28 mm Innendurchmesser) mit normaler Kochsalzlösung, die mit einem Druckwandler verbunden ist gefüllt.
- Remove die Mikropinzette und Gewinde der Katheter weiter in die Arterie. Ziehen Sie dann die proximale Ligatur um die Arterie und Katheter. Tipp: Die Anwendung eines zweiten proximalen Naht verhindert Blutungen nach dem Entfernen der Mikro-Pinzetten.
- Binden Sie das distale Ligatur um die A. carotis und den Katheter für eine zusätzliche Verankerung.
- Überwachen Narkose kontinuierlich durch Überwachung der Herzfrequenz und Blutdruck. Führen intermittierende arterielle Blutgasanalyse mit einem Blutgasanalysator. 16 A Herzfrequenz unter 300 Schlägen pro Minute oder mehr als 360 Schlägen pro Minute sowie einen mittleren arteriellen Druck fallen unter 80 mmHg für länger als 5 Minuten sind Kriterien für einen Ausschluss. 17, 18 Pflegen Sie Blut pH-Wert innerhalb der physiologischen Grenzen (7,35-7,45). Sollte das Experiment muss durch eine abnorme Überwachung Raten gekündigt werden, Vertikutieren, das Tier durch Hals Dislokation oder exanguation.
Für die intravenöse Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen oder anderen Drogen of Interesse, machen Sie Folgendes:
- Konzentrieren der Bereich der linken Jugularvene mit dem Operationsmikroskop.
- Mit einer Pinzette in jeder Hand, reißt die dünne Faszie, um die Halsschlagader zu offenbaren. Montieren Sie die Vene auf einer abgewinkelten Mikropinzette. Der Blutfluss wird dann zu stoppen.
- Mit einer Pinzette werden zwei gleich lange Stücke der Naht unter der Halsschlagader konkordant auf die Halsschlagader canulation weitergegeben. Binden Sie das distale Naht dicht und das proximale Naht locker um die Halsschlagader.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Halsschlagader und legen Sie eine Polyethylen-Katheter (0,28 mm Innendurchmesser), die mit Kochsalzlösung gespült worden ist. Markieren Sie, dass Schnitt und canulation kann immer anspruchsvoller und zeitaufwendiger als die der Carotis.
- Führen Sie den Katheter zum Herzen hin und ziehen Sie die Ligatur am nächsten an der Mitte um die Vene und dem Katheter.
- Nach konforme Durchgängigkeit, binden distalen Ligatur um den Katheter. Tipp: Zusätzliche Fixierung von both Katheter mit Band kann verhindern Verrutschen.
- Spülen Katheter häufig intraluminale Blutgerinnung.
2. Vorbereitung des M. cremaster
- Wir nutzen ein Aluminium-Phase von 1,5 - 2 cm Dicke für cremasterica Bildgebung. Die Bühne nimmt schnell die gewünschte Temperatur des Heizkissen Dadurch sollen die thermische Kontrolle des cremasterica Gewebe. Dies ist entscheidend für eine Entzündung Studien. Alternativ kann eine Plexiglas-Plattform verwendet werden, obwohl die Verordnung von cremasterica Temperatur ist schwieriger werden. Setzen Sie den Hodensack in der Mitte der Bühne.
- Die erste Schnitt wird in der Haut und externen Fascia spermatica über dem Hodensack in der sehr distalen Ende durch vorsichtige Dilatation des subdermalen Raum mit einer feinen Schere gefolgt gemacht. Berühren Sie nicht die darunter liegende Gewebe mit den Instrumenten.
- Sobald das Gewebe ausgesetzt ist, wird mit vorgewärmtem angefeuchtet (37 ° C) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung with Calcium und Magnesium. Tragen Sie die Lösung regelmäßig zu jedem Gewebe ausgesetzt.
- Bindegewebe zwischen den externen und der Fascia spermatica Cremastermuskel wird vorsichtig entfernt, um den M. cremaster vom umgebenden Gewebe zu befreien.
- Die Außenfläche des M. cremaster ist dann vorsichtig aus Bindegewebe gelöscht. Kontinuierliche Superfusion beim Präparieren Hydrate das Bindegewebe, die Erleichterung Sichtbarkeit und Entfernung.
- Nähen Sie die distale Ende des Cremaster Sack gedrückt zu halten und leicht erweitern das Ende des Sackes.
- Inzision das distale Ende des Sackes auf der ventralen Seite und längliche den Einschnitt proximal mit Mikro Schere. Sorgfältig cauterize blutende Gefäße entlang den Schnittlinien Verwendung eines thermischen Kauter. Vermeiden Sie unnötige Kauterisation zusätzliche entzündliche Reize zu begrenzen. Tipp:. Blut Strömungsdynamik nahe dem Umfang der Herstellung werden durch dieses Gewebeschädigung 19 Daher verändert, zur Minimierung dersich Auswirkungen auf die Datenerfassung, sollte Blutgefäße in der Nähe der Mitte des für die Abbildung verwendet werden.
- Die offene cremaster liegt flach auf dem Aluminium-Sockel allerdings noch durch eine dünne Bänder an den Nebenhoden unter dem Hoden verbunden. Geleitet von dem Hoden auf der einen Seite macht diese Band mit einer kleinen Arterie und Vene, die dem Nebenhoden zu verbinden. Mit dem Kauter, um die Gefäße verschließen und verwenden die Mikro-Schere, um die Binde-Ligament zwischen Hoden und cremasterica Gewebe zu schneiden.
- Drücken Sie vorsichtig die Rückseite isolierten Hoden in den Leistenkanal. Andere Autoren resezieren den Hoden nach proximaler Ligatur (Orchiektomie) zusammen mit den zugehörigen Leisten-FAD-Pad. 20. In einem sensiblen Modell als IRI induzierte Leukozytenaktivierung wir versuchen, alle zusätzlichen chirurgischen Stimuli zu vermeiden, damit wir aus der Resektion des Hodens, die in der Regel nicht verzichten notwendig, um eine ausreichende Belichtung der Cremastermuskel bekommen.
- Zusätzlich zu der erstenFixationsnaht vier Kanten des Gewebes (zwei auf jeder Seite) und befestigen Sie die Fäden, Bänder vorsichtig zu verbreiten cremasterica Gewebe radial auf dem Alu-Bühne. Wobei ein Spalt zwischen der Aluminium-Bühne und dem externen Eingang des Leistenkanals vereinfacht spätere cremasterica Clipping für Ischämie.
- Platz zwei Enden von Polyethylen-Katheter (0,28 mm Innendurchmesser) an den cremasterica Gewebe schließen für die Superfusion Setup. Stellen Sie sicher, dass das Lumen frei von Luft, um Luftblasen in der etwaigen Fluidkammer zu vermeiden.
- Ziehen Sie eine Linie von Vaseline (Vaseline) rund um den M. cremaster mit einer Spritze. Die Linie muss sich die Größe des Deckglases, die für die Berichterstattung verwendet wird.
- Um eine Fluidkammer erstellen, platzieren Sie ein quadratisches Deckglas (32 × 32 mm) über die cremasterica Gewebe und fest an die Ränder der Vaseline Linie.
- Falls die cremasterica Gewebe nicht mit einem spezifischen Arzneimittel, kontinuierliches Ersetzen des umgebenden Grippe superfundiertID ist nicht essentiell. Eine einzige Anwendung von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium in den entstandenen Kammer kann dann ausreichend sein. Lokale Stimulation mit Medikamenten jedoch sollte kontinuierlich über Mikro-Perfusionspumpe durchgeführt werden, bei einer Rate von 3 ml pro Stunde.
- Die cremasterica Gewebe ist nun bereit für eine mikroskopisch visuelle Darstellung.
3. Intravital-Setup
Das grundlegende Setup intravitalen können variieren. Für die Experimente Epifluoreszenz Bildgebung sollte in einem dunklen Raum ausgeführt werden.
- Das Tier wird in einem Stadium der intravitale Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer 470 nm LED Lichtquelle für Auflicht-Beleuchtungseinrichtung ausgestattet war. Verwenden Sie einen Wasserimmersionsobjektiv (20 x / 1,0), um die Vergrößerung von ca. 800 × zu erreichen. Rekord Beobachtungen mit Hilfe einer hoch auflösenden Digitalkamera und speichern Aufzeichnungen auf einem Personal Computer für Offline-Auswertung.
- Für Leukozyten-Kennzeichnung, injizieren Rhodamin6G intravenös über die Vena Katheters in Konzentrationen von 0,4 mg / kg Körpergewicht.
- Wählen Sie eine postkapillären Venole zur Beobachtung. Gefäßgröße sollte zwischen 20-60 um und Durchblutung reichen sollte ausreichend sein. Um den Einfluss der Voraktivierung des Gewebes zu minimieren, ist nur Gefäße, in denen Leukozytenrollen <20 cells/30 Sekunden und die Anzahl der adhärenten Zellen <10 cells/200μm der venösen Endothel zur weiteren Analyse verwendet werden.
- Wenn möglich, kann bis zu drei postkapillären Venolen zur Beobachtung verwendet werden, allerdings sollten sie in einem entsprechenden Abschnitt des cremasterica Gewebe entfernt werden, um nicht zu verwirren, die Schiffe zu unterschiedlichen Zeitpunkten.
4. Ischämie-Reperfusionsverletzung (IIR)
- Wir Gewebe 30 Minuten lang stabilisieren.
- Führen Sie eine Aufzeichnung von 30 Sekunden auf basale Werte für Leukozytenrollen und die Einhaltung zu etablieren. Im Idealfall insgesamt drei basalen Aufnahmen erzeugen zu Zelle zu überprüfenZahlen und Standardabweichungen zu erhalten.
- Vorsichtig einen Behälter Biemer Klammer um den sehr proximale Ende des freiliegenden cremasterica Gewebe unter Verwendung der Anwendung einer Pinzette. Stasis sollte sofort auftreten und können visualisiert durch Epifluoreszenzmikroskopie in der beobachteten Gefäßabschnitt.
- Eine Vielzahl von Zeitspannen können verwendet je nach Ausmaß des Schadens erforderlich. Wir wenden 30 Minuten Ischämiezeit als die von anderen Autoren beschrieben. 21-23 Entfernen Sie das Gefäß Schelle danach. Erlauben Sie Blutstrom zu weitere 15 Minuten stabilisieren.
- Spätere Aufnahmen von 30 Sekunden Dauer kann das ganze Reperfusion Zeitraum (zB 30 Sekunden alle 15 Minuten) durchgeführt werden. Speichern Aufnahmen digital zur Offline-Analyse.
- Für die Beendigung des Versuchs, wird die Ratte durch Genickbruch unter ausreichender Betäubung durch Drücken einer stumpfen Instrument wie dem stumpfen Kante eines Scherenblatt auf der Basis des Schädels getötet. Mit der anderenSeite ist die Basis des Schwanzes schnell herausgezogen, wodurch die Trennung der Halswirbel aus dem Schädel.
5. Offline-Video-Wiedergabe-Analyse
- Für die Offline-Wiedergabe von Videos Analyse ist es hilfreich, Software, die Auswahl an verschiedenen Bildern und Beobachtung der Videosequenz in Zeitlupe ermöglicht den Einsatz. Stellen Sie Kontrast und Helligkeit entsprechend. Wir verwenden Software vom Hersteller des Mikroskops, die Längenmessungen und digitale Vergrößerung ermöglicht vorgesehen.
- Für die Quantifizierung der Leukozytenrollen, definieren Sie eine virtuelle Linie, die das Schiff senkrecht schneidet das ist konsequent in allen Datensätzen. Zähle die Anzahl der rollenden Leukozyten, die die Linie passieren innerhalb von 30 Sekunden manuell.
- Für die Quantifizierung der adhärenten Leukozyten, definieren Sie eine 200 um Gefäßabschnitt, die konsequent in allen Datensätzen ist 23 Zähle die Anzahl der Leukozyten deutlich sichtbar, die statisch bleiben während 30 Sekunden -. Damit definED als Anhänger. 24
6. Repräsentative Ergebnisse
IRI des Cremaster-Muskel hat keine Auswirkung auf den mittleren arteriellen Druck (MAP), Herzfrequenz und Blut-pH-
Mit dem oben genannten Setup (Abbildung 1) untersuchten wir die Mikrozirkulation in der IRI über einen 2 Stunden-Protokoll, aber eine viel längere Beobachtungszeit bis zu 6 Stunden möglich ist. Wie in Abbildung 2 gezeigt, hat der IRI Cremastermuskel keine signifikanten Auswirkungen auf die macrohemodynamic Ratte Umlauf mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz während des Untersuchungszeitraums stabil bleiben. Außerdem haben wir beobachtet Homöostase durch häufige Messungen des arteriellen Blut-pH-Wert, der innerhalb der physiologischen Grenzen lagen und zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.
IRI induziert Leukozytenrollen im Umlauf cremasterica
Leukozyten Endothel Interaktion ist ein wichtigerEreignis in der akuten Entzündung. Durch intravitale Mikroskopie ergab eine zeitabhängige Zunahme der Zahl von Fahrzeugen Leukozyten in der IRI Cremastermuskel (3A) zur vorherigen übereinstimmenden Daten 21, 25. Rollen über die 2 Stunden Beobachtungszeit zu einem Höchstbetrag von 137,63 ± 22,55% des Ausgangswertes nach 120 Minuten der Reperfusion Zeit montiert und dann erreichte statistische Signifikanz im Vergleich zu sham operierten Tieren (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% des Ausgangswertes).
IRI induziert Adhäsion von Leukozyten in der Zirkulation cremasterica
Zur weiteren Auswertung der Leukozyten-Endothel Interaktion, die wir analysiert Leukozytenadhäsion in einem 200 um Gefäßabschnitt. IRI bewirkte einen Anstieg in der Anzahl der adhärenten Leukozyten, die deutlich über Werte von scheinoperierten Tieren nach 60 Minuten (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% des Ausgangswertes) und weitere ASCEnded um 120 Minuten Reperfusion (3B).
Zusammenfassend wird die In-vivo-Modell beschrieben liefert konsistente Daten von akuten Leukozytenaktivierung in IRI, während das Überleben der Tiere und Kreislauf Stabilität gewährleistet ist.
Abbildung 1. A. Ablaufschema für intravitale Epifluoreszenzmikroskopie Leistung in Ischämie-Reperfusionsschaden der Ratte Cremastermuskel. Nach erforderlichen Vorbereitungen für die Narkose und Überwachung, wird die Ratte Cremastermuskel für die Bildgebung ausgesetzt. Aufzeichnungen der Leukozytenaktivierung werden vor und nach Gewebeischämie gemacht. Nachfolgende Video-Analyse lässt sich am besten offline durchgeführt. B. Schematische Darstellung der vorgeschlagenen intravitalen Setup. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. IRI des Cremaster-Muskel hat keine Auswirkung auf den mittleren arteriellen Druck (MAP), Herzfrequenz und Blut-pH. Mittleren arteriellen Druck (A) und Herzfrequenz (B) wurden überwacht alle 30 Minuten während des gesamten Versuchs über Druckaufnehmer nach canulation des Rechts Halsschlagader. Messung der arteriellen Blut-pH-Wert (C) wurde nach 0, 60 durchgeführt, und 120 Minuten. Werte sind Mittelwerte ± SEM von 6 verschiedenen Ratten und reichte auf physiologische Werte ohne signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. IRI Leukozyten erhöht-Endothel-Interaktion in der cremasterica Verkehr. Nach der Markierung von Leukozyten mit Rhodamin 6G (0,4 mg / kg Körpergewicht) intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um Leukozyten-Endothelzellen-Wechselwirkung in Reperfusionsverletzung über einen 120 Minuten-Protokoll nach 30 Minuten Gewebeischämie bestimmen. Aufzeichnungen wurden bei einer Vergrößerung von etwa × 800 aufgenommen. A. IRI erhöht die Anzahl der rollenden Leukozyten in postkapillären Venolen des Cremastermuskel nach 120 Minuten, während der Reperfusion Leukozytenrollen bleibt während des gesamten Experiments in cremasterica Gewebe, das nicht unterzogen wurden Ischämie stabil. Werte sind Mittelwerte ± SEM von 6 Ratten beobachteten. # P <0,05 unter Verwendung des ungepaarten t-Test. B. Die Anzahl der adhärenten Leukozyten wird deutlich in einem zufällig ausgewählten 200 um postkapillären Gefäßabschnitt nach 30 Minuten cremasterica Ischämie und nachfolgenden 60 Minuten von Gewebe Reperfusion erhöht. Ergebnisse zu bekommen, auch more nach einer 2 Stunden Reperfusion Zeitraum ausgesprochen. Werte sind Mittelwerte ± SEM von 6 Ratten beobachteten. # P <0,05 mit dem ungepaarten t-Test. C. Repräsentative Bilder eines postkapillären Venole vor Ischämie (links) und 120 Minuten nach IRI (rechts). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Leukozyten-Endothel-Interaktion, sind die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und die Aktivierung des Komplementsystems die Hauptmerkmale der IRI-induzierten Gewebe Dysfunktion. 26. Die Mikrozirkulation des betroffenen Gewebes als integraler Standort für die entzündliche Entstehung betrachtet wird. Abgesehen von Ex-vivo-Experimente wie Flow Assays Kammer 27, 28 ist es zwingend notwendig, um gut etablierte Modelle der intravitalen Bildgebung weiter zu der in vivo-Relevanz zu bewerten. Obwohl IRI hat in verschiedenen Organsystemen in Verbindung gebracht, wir hier beschreiben eine Methode, systematisch zu untersuchen Leukozyten-Endothel Interaktion in Reperfusionsschaden der quergestreiften Muskulatur, die zuerst von Baez et al 13 wurde beschrieben, daher besonders relevant in Lappenoperation (Abbildung 1). 29 Wie es wird angenommen, dass post-ischämische Gewebeschädigung anderer Organe die gleichen entzündlichen Mechanismen beinhaltet, kann das beschriebene Modell verwendet werden gain Prinzip Einblicke in pathophysiologischen Mechanismen von IRI, in relevanten Bedingungen wie Herzinfarkt, Schlaganfall oder nach intestinaler Ischämie.
Die eingesetzten Tiere
Das hier vorgestellte Modell ist für die meisten Nagetiere wie Ratten und Mäuse. Für die lange Zeit der Bildgebung, die notwendig ist in diesem Modell, das wir generell lieber Ratten als Tracheotomie und Beatmung Volumen leicht durchgeführt werden können. In Kombination mit kardiovaskulären Bildgebung über arterielle canulation, können Ratten Kreislauf gehalten werden und homöostatisch über Stunden stabil (Abbildung 2). Darüber cremasterica Gewebe ist umfangreicher, als es bei Ratten bei Mäusen bleibt mehr Optionen für postkapillären Bildgebung ist. Obwohl Gewebeaufbereitung könnte einfacher sein vorgeformt in Lagerbier Ratten, sollte man bedenken, dass cremasterica Gewebe und vor allem die cremasterica Faszie dünner ist bei jungen Ratten (100 -150 g) wodurch Hintergrundfluoreszenz und Überlagerung von additiOnal Fasziengewebe. Aber ein Vorteil der Verwendung von Mäusen für Intravitalmikroskopie ist die Verfügbarkeit von transgenen Tieren, von unschätzbarem Wert, um die Rolle einzelner Gene bei der Modulation der Mikrozirkulation Ereignisse aufzuklären.
Gewebetypen
Da zuerst beschrieben, hat intravitale Mikroskopie in einer Vielzahl von mikrozirkulatorischen Zubereitungen einschließlich des Master-Backentasche, Hasenohr, Nagetier-Mesenterium und cremaster verwendet. Ein wesentlicher Nachteil der meisten dieser Präparate verbunden ist, ist die mögliche Aktivierung von Zellen durch chirurgische Manipulation mit einem vorübergehenden Anstieg der rollenden und adhärenten Leukozyten, aber gut für das Mesenterium beschrieben. Cremasterica 30 Vorbereitung hat sich daher auf die mit besonderer Vorsicht durchgeführt werden, begleitet. Um unsere Erfahrung, hilft häufiges Befeuchten des exponierten Gewebes und restriktive Verätzungen sowie einer ausreichenden Stabilisierung Gewebe Zeitraum von mindestens 30 Minuten zur Vermeidung oder Verringerung LeukozytenStimulation.
Ein großer Vorteil der Bildgebung über cremasterica mesenterialen Bildgebung ist die leichte Erreichbarkeit, die Öffnung der Bauchhöhle erspart. Insgesamt chirurgische Trauma wird reduziert und Montage entweder auf einem Plexiglas-Anzeige Bühne für Durchlicht oder, wie unser Protokoll genutzt, eine thermische kontrollierten Aluminium-Plattform für Auflicht-illumintaion ist leicht durchführbar. Darüber hinaus ist Fett, das rund sammelt postkapillären Venolen bei älteren Tieren Begrenzung mesenterialen Imaging fehlen rund um die cremasterica Gewebe.
Leukozyten-Kennzeichnung
Reagenzien wie Rhodamin 6G 31, Acridinorange oder Acridin-rot, die Zellkerne Flecken und / oder intrazellulären Organellen, die nicht in den roten Blutkörperchen gefunden werden vermehrt in Leukozyten (und in gewissem Maße in Thrombozyten und Endothelzellen). Wir bevorzugen 32 mit Rhodamin 6G für Leukozyten-Detektion bei Konzentrationen von 0,4 mg / kg Körpergewicht, die PR hateviously sich gezeigt, dass keine signifikante Wirkung auf die Aktivierung von Neutrophilen haben. Acridinorange 33 zeigte viel mehr Hintergrund Fleck und Phototoxizität durch arteriolären Vasokonstriktion (unveröffentlichte Beobachtungen). Die Verwendung von LEDs für die Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht eine präzise Anregungsspektren und ermöglicht, dass komplexere Anwendungen wie die Kombination von verschiedenen Wellenlängen für den Nachweis von Leukozyten-Aktivierung und kapillares Leck zur gleichen Zeit und daher zB die Methode der Wahl werden in der Zukunft in vivo-Bildgebung.
IRI in cremasterica Gewebe
Anwenden von Ischämie auf die Cremastermuskel kann leicht durchgeführt und spiegelt perfekt klinisch relevanten Bedingungen wie freie Lappenplastik. Darüber hinaus können Modifikationen wie kalter Ischämie, warme Ischämie oder cremasterica Superfusion mit beeinflussenden Substanzen Entzündung leicht angewendet werden. Intrascrotal Injektion kann das Verfahren der Choi seince, wenn die Behandlung des Gewebes cremasterica Stunden oder Tage vor der Aufnahme erforderlich ist.
Eine Vielzahl von Zeit-Verläufe für IRI genutzt abhängig vom Ausmaß des Schadens erforderlich. Wir beschreiben hier ein Modell von 30 Minuten Ischämie zu einem beträchtlichen Maß rollen nach zwei Stunden Reperfusion (Abbildung 3) durch Zählen weißer Blutkörperchen vorbei einen festen Punkt über dem Schiff zu produzieren. Als Steigerung der Walzen ist es moderate lässt genügend Potenzial, um Leukozyten in IRI durch andere Drogen von Interesse zu stimulieren. Jedoch kann eine Vielzahl von Zeit-Verläufe verwendet je nach dem Grad der Leukozyten-Aktivierung erforderlich 21, 25 Leukozytenadhäsion wird am häufigsten durch Zählen von Zellen deutlich sichtbar in der Gefäßwand in einem 100 gemessen -. 200 um Strecke, die stationär bleiben für 30 s , obwohl diese Zeit kann von Labor zu Labor unterschiedlich sein. Wir beobachteten einen deutlichen Anstieg bei der Zahl der adhärenten Leukozyten in IRI, die erhebliche nach 60 Minuten bekam.
Abschließend intravitalen Epifluoreszenzmikroskopie IRI in der quergestreiften Muskulatur kann auch in der Ratte cremasterica Gewebe durchgeführt werden, wie es reproduzierbare Daten von In-vivo-Leukozyten-Aktivierung für die Entzündung der Forschung zur Verfügung stellt.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des "Deutschen Forschungsgemeinschaft", um SU Eisenhardt (EI 866/1-1) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 - A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32x32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
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