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Medicine

Ischemia-reperfusion की चोट में ल्युकोसैट - endothelial सहभागिता के वास्तविक समय डिजिटल चूहा cremaster स्नायु की इमेजिंग (IRI)

Published: August 5, 2012 doi: 10.3791/3973

Summary

डिजिटल cremasteric microcirculation में postcapillary venules intravital epifluorescence माइक्रोस्कोपी एक सुविधाजनक तरीका है लिए ल्युकोसैट - endothelial बातचीत में अंतर्दृष्टि लाभ

Protocol

1. संज्ञाहरण और निगरानी

  1. उपयुक्त राष्ट्रीय और संस्थागत नैतिकता जगह में पहले पशु प्रयोगों प्रदर्शन करना चाहिए. 180 जी नैतिकता समिति चतनाशून्य करना 120 से शरीर के वजन के साथ पुरुष Sprague Dawley चूहों से मंजूरी के बाद. एक Plexiglas बॉक्स में 3 वॉल% isoflurane isoflurane vaporizer के माध्यम से और चूहा अंदर जगह - 2 उद्धार.
  2. जैसे ही संज्ञाहरण के उचित स्तर हासिल की है चूहा (पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी करने के लिए प्रतिक्रिया की कमी के कारण) भारित और उदर गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र पर मुंडा.
  3. एक हीटिंग पैड पर पृष्ठीय अवलंबन में चूहा प्लेस को 37 में शरीर का तापमान बनाए रखने के डिग्री सेल्सियस और खंड 2% एक सिलिकॉन मुखौटा का उपयोग कर isoflurane लागू होते हैं.

निम्नलिखित तैयारी चरणों का सबसे अच्छा एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पूरा कर रहे हैं.

  1. ट्रेकिआ की तैयारी के लिए, मन्या धमनी और गले का शिरा, ओ क्षेत्र में एक 2 सेमी क्षैतिज त्वचा चीरा प्रदर्शनच पायदान suprasternal और लार की गिल्टी है laterally जुटाने.
  2. अब उदर गर्दन की मांसपेशियों का सामना करना पड़ता है. Midline में ध्यान से उन्हें अलग और ट्रेकिआ मिल. बेनकाब - 1 ट्रेकिआ के 2 सेमी और सूक्ष्म संदंश के तहत यह जगह इतनी के रूप में इसे बढ़ाने के लिए.
  3. अब ट्रेकिआ के उदर पक्ष के माध्यम से आधे रास्ते के बारे भट्ठा. नहीं के माध्यम से सभी तरह, कटौती यदि आप करते हैं, ट्रेकिआ की कटौती अंत छाती में वापस पर्ची जाएगा और के साथ काम करने के लिए बहुत मुश्किल हो सावधान.
  4. एक Abbocath (14G) ट्यूब ट्रेकिआ, जो पहले एक पशु वेंटीलेटर जोड़ा गया है के निचले हिस्से में सांस की नली ट्यूब के रूप में इस्तेमाल किया डालें. सुझाव: चुंबक clamps पर फर्म के निर्धारण के रूप में अच्छी तरह के रूप में ट्यूब के आसपास ट्रेकिआ के suturing जगह में सांस की नली ट्यूब रखने के लिए आवश्यक है. आम तौर पर हम 5 Terylene / 0 सीवन का उपयोग करें, लेकिन इसी तरह की सीवन सामग्री का उपयोग किया जा सकता है.
  5. श्वसन तो मात्रा नियंत्रित कर सकते हैं (आवृत्ति, 35 - 45 साँस / मिनट, ज्वार मात्रा, 4.5 - 5 मिलीग्राम, 2 FiO 14 श्वासरोध 2 एच 10 मिमी के लिए एक 5 के अंत expiratory दबाव सकारात्मक बनाए रखने के द्वारा रोका जा सकता है 15 ओ.
  6. मन्या canulation के लिए, सही sternohyoid मांसपेशी कुंद विच्छेदन से अलग है मन्या धमनी का पता लगाने.
  7. Vagus तंत्रिका ध्यान मन्या धमनी से अलग करें और एक angled सूक्ष्म संदंश पर धमनी माउंट करने के लिए दिल से खून बह बंद.
  8. मन्या धमनी के नीचे सीवन के बराबर लंबाई के दो टुकड़े से गुजरती हैं. दिल के संदर्भ में, और अधिक बाहर सीवन कसकर बंधा हुआ है करने के लिए सिर क्षेत्र से बह रही है जबकि समीपस्थ सीवन शिथिल मन्या धमनी के चारों ओर बंधा हुआ है रक्त रोक देना.
  9. सूक्ष्म कैंची का प्रयोग एक छोटे से काट दो ligatures के बीच मन्या धमनी में किया जाता है.
  10. एक polyethylene (0.28 मिमी भीतरी व्यास) कैथिटर सामान्य नमक समाधान है कि दबाव transducer जुड़ा हुआ है के साथ भर डालें.
  11. रेमसूक्ष्म संदंश और धागा धमनी में कैथेटर आगे ove के. फिर धमनी और कैथेटर के आसपास समीपस्थ संयुक्ताक्षर कस लें. सुझाव: एक दूसरे समीपस्थ सीवन के आवेदन सूक्ष्म संदंश निकालने के बाद खून बह रहा से बचाता है.
  12. मन्या के आसपास बाहर का संयुक्ताक्षर और अतिरिक्त लंगरवानी के लिए कैथेटर टाई.
  13. संज्ञाहरण निगरानी दिल की दर और धमनी दबाव के द्वारा लगातार निगरानी. आंतरायिक धमनियों से रक्त गैस का उपयोग कर एक रक्त गैस विश्लेषक का विश्लेषण प्रदर्शन 16 एक दिल की दर से 300 bpm से या अधिक 360 bpm से कम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मतलब है एक धमनी दबाव अब से 5 मिनट के लिए 80 mmHg नीचे गिर बहिष्करण के लिए मापदंड हैं. 17, 18 रक्त बनाए रखें शारीरिक सीमाओं के भीतर पीएच (7.35-7.45). मामले में प्रयोग करने के लिए असामान्य निगरानी दर के कारण समाप्त हो गया है, गर्दन अव्यवस्था या exanguation के द्वारा पशु पुछने लगाना.

फ्लोरोसेंट रंजक या अन्य दवाओं के ओ की नसों में आवेदन के लिएच ब्याज, निम्नलिखित प्रदर्शन:

  1. सर्जिकल माइक्रोस्कोप साथ बाईं गले नस के क्षेत्र पर ध्यान दें.
  2. प्रत्येक हाथ में संदंश के साथ, गले का शिरा प्रकट करने के लिए पतली प्रावरणी आंसू. एक angled सूक्ष्म संदंश पर नस माउंट. रक्त के प्रवाह को तो बंद हो जाएगा.
  3. संदंश का प्रयोग, सीवन के बराबर लंबाई के दो टुकड़े से मन्या canulation सुरीला कंठ का शिरा के तहत पारित कर रहे हैं. बाहर सीवन कसकर गले नस के आसपास समीपस्थ सीवन शिथिल टाई.
  4. गले नस में एक छोटे से काट कर और एक polyethylene (0.28 मिमी भीतरी व्यास) कैथेटर कि नमक के साथ प्लावित डालें. मार्क है कि चीरा और canulation अधिक मांग और मन्या की तुलना में काफ़ी समय हो सकता है.
  5. दिल की ओर कैथेटर धागा और संयुक्ताक्षर कस नस और कैथेटर के आसपास दिल के सबसे करीब है.
  6. अनुरूप प्रत्यक्षता के बाद, कैथेटर के आसपास बाहर का संयुक्ताक्षर टाई. सुझाव: बो के अतिरिक्त निर्धारणटेप के साथ वें कैथेटर dislodgment रोक सकता है.
  7. कैथेटर बार का कुल्ला लिए intraluminal थक्के रोकने के लिए.

2. Cremaster स्नायु की तैयारी

  1. 2 सेमी मोटाई - cremasteric इमेजिंग के लिए हम 1.5 की एक एल्यूमीनियम मंच का उपयोग करें. मंच तेजी से हीटिंग पैड इस प्रकार cremasteric ऊतक के थर्मल नियंत्रण को समाप्त करने के वांछित तापमान को गोद ले. यह सूजन अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. वैकल्पिक रूप से एक Plexiglas मंच हालांकि cremasteric तापमान के विनियमन और अधिक कठिन है इस्तेमाल किया जा सकता है. मंच के केंद्र में अंडकोश की थैली रखें.
  2. प्रारंभिक चीरा और बहुत बाहर subdermal ठीक कैंची का उपयोग कर अंतरिक्ष की सतर्क फैलने के बाद अंत में अंडकोश की थैली के ऊपर बाहरी शुक्र - संबंधी प्रावरणी त्वचा में किया जाता है. उपकरणों के साथ अंतर्निहित ऊतकों को छूने से बचें.
  3. जैसे ही ऊतक उजागर किया जाता है यह पूर्व गर्म के साथ सिक्त है (37 डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट बफर नमकीन घोल वाईवें कैल्शियम और मैग्नीशियम. किसी उजागर ऊतक के लिए नियमित रूप से समाधान लागू होते हैं.
  4. बाहरी शुक्र - संबंधी प्रावरणी और cremaster मांसपेशियों के बीच संयोजी ऊतक ध्यान cremaster मांसपेशियों के ऊतकों आसपास से मुक्त करने के लिए हटा दिया है.
  5. cremaster मांसपेशियों की बाहरी सतह है तो सावधानी से संयोजी ऊतक की मंजूरी दे दी है. निरंतर superfusion विच्छेदन हाइड्रेट्स के दौरान संयोजी ऊतक, दृश्यता और हटाने की सुविधा.
  6. Cremaster बोरी के लिए नीचे पकड़ के बाहर का अंत सिवनी और थोड़ा बोरी के अंत का विस्तार.
  7. उदर पहलू पर बोरी के बाहर का अंत काटकर अलग कर देना और चीरा proximally बढ़ाना सूक्ष्म कैंची का उपयोग. सावधानी से चीरा एक थर्मल प्रदाहान का उपयोग लाइनों के साथ वाहिकाओं से खून बह रहा दाग़ना. अनावश्यक दाग़ना से बचने के लिए अतिरिक्त भड़काऊ उत्तेजनाओं को सीमित करने के लिए. सुझाव: तैयारी की परिधि के निकट रक्त प्रवाह की गतिशीलता इस ऊतकों को नुकसान से बदल रहे हैं 19 इसलिए, कम करने के लिएसे डेटा संग्रह पर प्रभावित करता है, तैयारी के केन्द्र के निकट रक्त वाहिकाओं इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  8. खुला cremaster एल्यूमीनियम हालांकि अभी भी एक पतली बंधन से अंडकोष नीचे अधिवृषण से जुड़े कुरसी पर फ्लैट झूठ. एक तरफ अंडकोष को दर्शाते हुए एक छोटे धमनी और शिरा जो अधिवृषण से कनेक्ट करने सहित इस बंधन को उजागर. वाहिकाओं मुहर और सूक्ष्म अंडकोष और cremasteric ऊतकों के बीच संयोजी बंध कटौती कैंची रोजगार दाग़ना का प्रयोग करें.
  9. धीरे वापस वंक्षण नहर में अलग अंडकोष धक्का. अन्य लेखकों समीपस्थ संयुक्ताक्षर अंडग्रंथि () बाद जुड़े वंक्षण सनक पैड के साथ साथ अंडकोष 20 IRI प्रेरित ल्युकोसैट सक्रियण हम सभी अतिरिक्त शल्य उत्तेजनाओं से बचने की कोशिश के रूप में एक संवेदनशील मॉडल में, इसलिए हम वृषण, जो आमतौर पर नहीं है resecting से बचना बांटना. cremaster मांसपेशियों के लिए पर्याप्त जोखिम पाने के लिए आवश्यक है.
  10. इसके अलावा करने के लिए पहलीनियतन सीवन ऊतक के चार किनारों (प्रत्येक पक्ष पर दो) और टेप करने के लिए सूत्र देते सावधानी से एल्यूमीनियम मंच पर cremasteric ऊतक के त्रिज्यात फैल. एल्यूमीनियम मंच और वंक्षण नहर के बाहरी द्वार के बीच एक अंतर को छोड़कर ischemia के लिए की बाद cremasteric कतरन सरल करता है.
  11. जगह पॉलीथीन कैथेटर के दोनों सिरों (0.28 मिमी भीतरी व्यास) superfusion स्थापना के लिए cremasteric ऊतक के करीब है. सुनिश्चित करें कि लुमेन हवा की अंतिम तरल पदार्थ कक्ष में हवाई बुलबुले से बचने के लिए स्वतंत्र है.
  12. पेट्रोलियम जेली (वेसिलीन) cremaster मांसपेशियों के चारों ओर एक सिरिंज का उपयोग कर एक लाइन ड्रा. लाइन कवर पर्ची है कि कवरेज के लिए प्रयोग किया जाता है के आकार का विस्तार करना चाहिए.
  13. एक द्रव कक्ष बनाने के लिए, cremasteric ऊतक पर एक वर्ग कवर पर्ची (32 × 32 मिमी) जगह और दृढ़ता से वेसिलीन लाइन किनारों देते हैं.
  14. मामले में cremasteric ऊतक एक विशिष्ट दवा, आसपास के फ्लू के लगातार प्रतिस्थापन के साथ नहीं superfusedआईडी nonessential है. फॉस्फेट का एक भी आवेदन बफर खारा बनाया चैम्बर में कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ समाधान तो पर्याप्त हो सकता है. दवाओं के साथ स्थानीय उत्तेजना लेकिन सूक्ष्म छिड़काव पंप के माध्यम से लगातार होना चाहिए प्रति घंटे 3 मिलीलीटर की दर पर प्रदर्शन किया.
  15. अब cremasteric ऊतक सूक्ष्म इमेजिंग के लिए तैयार है.

3. Intravital सेटअप

बुनियादी intravital सेटअप भिन्न हो सकते हैं. Epifluorescence इमेजिंग के लिए प्रयोग एक अंधेरे कमरे में निष्पादित किया जाना चाहिए.

  1. पशु intravital epifluorescence एक 470 एनएम महामारी रोशनी के लिए चमकदार स्रोत एलईडी के साथ सुसज्जित खुर्दबीन के चरण के लिए स्थानांतरित कर रहा है. पानी विसर्जन उद्देश्य (20 × / 1.0) का उपयोग करने के लिए लगभग 800 × बढ़ाई प्राप्त करने के. एक उच्च संकल्प डिजिटल कैमरा और ऑफ़लाइन मूल्यांकन के लिए एक व्यक्तिगत कंप्यूटर पर स्टोर रिकॉर्ड के माध्यम से रिकॉर्ड टिप्पणियों.
  2. ल्युकोसैट लेबलिंग के लिए, rhodamine इंजेक्षन0.4 शरीर मिलीग्राम / किग्रा वजन की सांद्रता में कंठ कैथेटर के माध्यम से नसों 6G.
  3. अवलोकन के लिए एक postcapillary venule चुनें. पोत आकार 20-60 माइक्रोन और रक्त प्रवाह के बीच सीमा के लिए पर्याप्त होना चाहिए. ऊतक के पूर्व सक्रियण के प्रभाव को कम करने के लिए, केवल वाहिकाओं में ल्युकोसैट रोलिंग <20 cells/30 सेकंड और अनुयायी कोशिकाओं की संख्या <venular endothelium के 10 cells/200μm के है आगे के विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है.
  4. यदि संभव हो तो, में तीन postcapillary venules अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वे cremasteric ऊतक के एक इसी खंड में स्थित होना चाहिए करने के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर जहाजों भ्रमित से बचने.

4. Ischemia-reperfusion की चोट (IIR)

  1. ऊतक 30 मिनट के लिए स्थिर है.
  2. 30 सेकंड की रिकॉर्डिंग के लिए ल्युकोसैट रोलिंग और पालन करने के लिए बेसल मूल्यों की स्थापना प्रदर्शन करते हैं. आदर्श रूप में, कुल तीन बेसल रिकॉर्डिंग में उत्पन्न करने के लिए सेल सत्यापितसंख्या और मानक विचलन प्राप्त करने के लिए.
  3. धीरे उजागर cremasteric ऊतक की बहुत प्रॉक्सिमल अंत के आसपास आवेदन संदंश का उपयोग करके एक Biemer पोत क्लिप जगह. ठहराव तुरंत हो और epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया पोत अनुभाग में देखे जा सकते हैं चाहिए.
  4. समय पाठ्यक्रम की एक किस्म की आवश्यकता क्षति के स्तर पर निर्भर करता है उपयोग किया जा सकता है. हम ischemia के समय के 30 मिनट के आवेदन के रूप में अन्य लेखकों द्वारा वर्णित 21-23 पोत दबाना बाद में निकालें. रक्त प्रवाह में एक और 15 मिनट के लिए स्थिर करने के लिए अनुमति देते हैं.
  5. 30 सेकंड की अवधि के बाद रिकॉर्डिंग reperfusion की अवधि (हर 15 मिनट में जैसे 30 सेकंड) भर में बनाया जा सकता है. ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए रिकॉर्डिंग डिजिटल सहेजें.
  6. प्रयोग की समाप्ति के लिए, चूहा गर्भाशय ग्रीवा के अव्यवस्था से पर्याप्त संज्ञाहरण के तहत के रूप में खोपड़ी के आधार पर एक कैंची ब्लेड की सुस्त धार कुंद साधन दबाकर euthanized है. दूसरे के साथहाथ, पूंछ के आधार जल्दी से खींच लिया, खोपड़ी से ग्रीवा vertebrae के जुदाई के कारण.

5. ऑफ़लाइन वीडियो प्लेबैक विश्लेषण

  1. ऑफ़लाइन वीडियो प्लेबैक के विश्लेषण के लिए यह उपयोगी है कि अलग चित्रों और वीडियो अनुक्रम में धीमी गति के अवलोकन के चयन की अनुमति देता है सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. उचित विपरीत और चमक समायोजित करें. हम माइक्रोस्कोप है कि लंबाई माप और डिजिटल बढ़ाई अनुमति देता है के निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग करें.
  2. ल्युकोसैट रोलिंग की मात्रा का ठहराव के लिए, एक आभासी लाइन है कि पोत खड़ी intersects की है कि सभी रिकॉर्ड में संगत है को परिभाषित. रोलिंग leukocytes है कि मैन्युअल रूप से 30 सेकंड के भीतर लाइन से गुजारें की संख्या गिनती.
  3. पक्षपाती leukocytes की मात्रा का ठहराव के लिए, एक 200 माइक्रोन पोत अनुभाग है कि सभी रिकॉर्ड में संगत है, को परिभाषित 23 30 सेकंड के दौरान स्पष्ट रूप से दिखाई leukocytes कि स्थिर रहना की संख्या की गणना इस प्रकार definएड के रूप में पक्षपाती 24

6. प्रतिनिधि परिणाम

Cremaster मांसपेशियों की IRI मतलब धमनी दबाव (एमएपी), हृदय की दर और रक्त पीएच पर कोई प्रभाव नहीं है

इस aforementioned सेटअप (चित्रा 1) का उपयोग करना, हम एक दो घंटे प्रोटोकॉल पर IRI में microcirculation की जांच की, लेकिन एक बहुत लंबे समय तक अवलोकन के 6 घंटे तक समय संभव है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, cremaster मांसपेशियों की IRI एक चूहा संचलन पर कोई महत्वपूर्ण macrohemodynamic प्रभाव के रूप में मतलब धमनी दबाव और हृदय की दर को जांच अवधि के दौरान स्थिर रहते हैं. इसके अलावा हम धमनी रक्त पीएच कि शारीरिक सीमाओं के भीतर लेकर लगातार माप द्वारा homeostasis को नजर रखी और कोई महत्वपूर्ण अंतर - समूह मतभेद दिखाया.

IRI cremasteric संचलन में ल्युकोसैट रोलिंग लाती

ल्युकोसैट endothelial बातचीत एक कुंजी हैघटना में तीव्र सूजन. Intravital माइक्रोस्कोपी के माध्यम से हम IRI (चित्र 3) पिछले 21, 25 डेटा के लिए सहमत cremaster मांसपेशियों में रोलिंग leukocytes की संख्या में वृद्धि समय पर निर्भर पाया. रोलिंग दो घंटे अवलोकन समय के साथ 137.63 की अधिकतम ± में reperfusion समय के 120 मिनट के बाद आधारभूत मूल्य के 22.55% के लिए मुहिम शुरू की और फिर नकली संचालित पशुओं की तुलना में सांख्यिकीय महत्व पर पहुंच गया (137.63 ± 22.55 बनाम 99.43 ± आधारभूत मूल्य के 14.04%).

IRI cremasteric परिसंचरण में ल्युकोसैट आसंजन लाती

ल्युकोसैट endothelial बातचीत के आगे मूल्यांकन के लिए हम एक 200 माइक्रोन पोत अनुभाग में ल्युकोसैट आसंजन का विश्लेषण किया. IRI पक्षपाती leukocytes उल्लेखनीय है कि नकली के मूल्यों से अधिक की संख्या में वृद्धि प्रेरित किया 60 मिनट के बाद जानवरों संचालित (118.33 ± 6.83 बनाम आधारभूत मूल्य के 96.27 ± 5.78%) और आगे ASCEreperfusion की 120 मिनट (3B चित्रा) द्वारा nded.

सारांश में vivo मॉडल में वर्णित IRI whilst के पशु अस्तित्व और परिसंचरण स्थिरता में तीव्र ल्युकोसैट सक्रियण के अनुरूप डेटा की आपूर्ति warranted है.

चित्रा 1
आकृति 1. Intravital ischemia-reperfusion की चूहा cremaster मांसपेशियों की चोट में epifluorescence माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन के लिए फ्लो चार्ट संज्ञाहरण और निगरानी के लिए आवश्यक तैयारी के बाद., चूहा cremaster मांसपेशियों इमेजिंग के लिए संपर्क में है. ल्युकोसैट सक्रियण के रिकार्ड ऊतक ischemia के पहले और बाद में लिया जाता है. बाद के वीडियो विश्लेषण सबसे अच्छा ऑफ़लाइन किया जाता है बी. प्रस्तावित intravital स्थापना पर योजनाबद्ध आंकड़ा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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चित्रा 2. Cremaster मांसपेशियों की IRI मतलब धमनी दबाव (एमएपी), हृदय की दर और रक्त पीएच पर कोई प्रभाव नहीं है धमनी दबाव (ए) और हृदय की दर (बी) का मतलब. दबाव transducer के माध्यम से प्रयोग भर सही की canulation के बाद हर 30 मिनट की निगरानी मन्या धमनी. धमनियों से रक्त पीएच (सी) के मापन 0, 60 के बाद किया गया था, और 120 मिनट. मान ± मतलब 6 अलग चूहों के SEM और महत्वपूर्ण अंतर - समूह मतभेदों के बिना शारीरिक स्तर पर बताया गया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. IRI ल्युकोसैट बढ़ जाती हैCremasteric परिसंचरण में endothelial rhodamine 6G (0.4 शरीर के वजन मिलीग्राम / किग्रा) के साथ leukocytes की लेबलिंग intravital epifluorescence माइक्रोस्कोपी ऊतक ischemia के 30 मिनट के बाद एक 120 मिनट प्रोटोकॉल पर reperfusion चोट में बातचीत ल्युकोसैट endothelial निर्धारण किया गया था के बाद. बातचीत. रिकॉर्ड्स लगभग की बढ़ाई × 800 में ले जाया गया, IRI काफी reperfusion की 120 मिनट से cremaster मांसपेशियों की postcapillary venules में रोलिंग leukocytes की संख्या बढ़ जाती है जबकि ल्युकोसैट रोलिंग cremasteric ऊतक में प्रयोग कि ischemia नहीं गुजरना था भर में स्थिर बनी हुई है. मान ± 6 मनाया चूहों के SEM मतलब कर रहे हैं. # <0.05 पी unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर बी. पक्षपाती leukocytes की संख्या में काफी बेतरतीब ढंग से चुनी 200μm cremasteric ischemia के 30 मिनट और ऊतक reperfusion के बाद 60 मिनट के बाद postcapillary पोत अनुभाग में वृद्धि हुई है. परिणाम भी मो मिलता हैकर रहे हैं एक दो घंटे reperfusion की अवधि के बाद सुनाया. मान ± 6 मनाया चूहों के SEM मतलब कर रहे हैं. पी # <0.05 unpaired टी परीक्षण का उपयोग सी. एक postcapillary venule के प्रतिनिधि तस्वीरें. Ischemia (बाएं) से पहले और IRI (सही) के बाद 120 मिनट. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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Discussion

ल्युकोसैट endothelial बातचीत, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और पूरक व्यवस्था के सक्रियण, IRI प्रेरित ऊतकों में शिथिलता के प्रमुख विशेषताएं हैं 26 प्रभावित ऊतकों की microcirculation भड़काऊ शुरुआत के लिए अभिन्न साइट के रूप में माना जाता है. इसके अलावा प्रवाह कक्ष 27, assays 28 के रूप में पूर्व vivo प्रयोगों से यह intravital इमेजिंग की अच्छी तरह से स्थापित मॉडल प्रदान करने के लिए और vivo में प्रासंगिकता का मूल्यांकन करने के लिए अनिवार्य है. हालांकि IRI विभिन्न अंग प्रणालियों में शामिल किया गया है, हम यहाँ करने के लिए एक व्यवस्थित ल्युकोसैट - endothelial धारीदार मांसपेशी ऊतक कि पहले Baez एट अल 13 के द्वारा वर्णित किया गया था की reperfusion की चोट में बातचीत की जांच की विधि का वर्णन है, इस प्रकार फ्लैप सर्जरी (चित्रा 1) में विशेष रूप से प्रासंगिक है. 29 के रूप में यह माना जाता है कि बाद इस्कीमिक अन्य अंगों के ऊतक चोट ही भड़काऊ तंत्र शामिल है, वर्णित मॉडल गाय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैn IRI के pathophysiological तंत्र, रोधगलन, प्रमस्तिष्क स्ट्रोक या आंतों ischemia के रूप में इस तरह की स्थितियों में प्रासंगिक में सिद्धांत अंतर्दृष्टि.

प्रयुक्त जानवर

यहाँ प्रस्तुत मॉडल सहित चूहों और चूहों सबसे कृन्तकों के लिए उपयुक्त है. इमेजिंग की लंबी अवधि है कि इस मॉडल में आवश्यक है के लिए हम आम तौर पर चूहों के रूप में ट्रेकिआटमी और मात्रा नियंत्रित श्वसन आसानी से किया जा सकता है पसंद करते हैं. चूहों, संचार धमनी canulation के माध्यम से हृदय इमेजिंग के साथ संयोजन में रखा जा सकता है है और homeostatically घंटे के लिए स्थिर (चित्रा 2). इसके अलावा cremasteric ऊतक चूहों में व्यापक की तुलना में यह अधिक विकल्प postcapillary इमेजिंग के लिए छोड़ने के चूहों में है. हालांकि ऊतक तैयारी बीर चूहों में preformed आसान हो सकता है, एक है कि cremasteric ऊतक पर विचार और खासकर cremasteric प्रावरणी युवा (100 -150 ग्राम) चूहों इस प्रकार पृष्ठभूमि और additi प्रतिदीप्ति उपरिशायी को कम करने में पतली है चाहिएonal प्रावरणीय ऊतक. हालांकि intravital माइक्रोस्कोपी के लिए चूहों का उपयोग करने का एक फायदा ट्रांसजेनिक जानवर की उपलब्धता, के लिए में नियमन microcirculatory घटनाओं व्यक्तिगत जीन की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए अमूल्य है.

ऊतक प्रकार

के बाद से पहली वर्णित है, intravital माइक्रोस्कोपी microcirculatory तैयारी के एक मास्टर गाल पाउच, खरगोश कान, कृंतक अन्त्रपेशी, और cremaster सहित विभिन्न प्रकार के में इस्तेमाल किया गया. एक मुख्य इन तैयारियों के अधिकांश के साथ जुड़े वापसी शल्य है कि अच्छी तरह से किया गया है अन्त्रपेशी के लिए 30. Cremasteric तैयारी वर्णित किया गया है इसलिए चरम देखभाल के साथ किया जा रोलिंग और पक्षपाती leukocytes में एक क्षणिक वृद्धि के साथ साथ हेरफेर के द्वारा कोशिकाओं के संभावित सक्रियण है. हमारे अनुभव करने के लिए, उजागर ऊतक और प्रतिबंधात्मक दाग़ना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कम से कम 30 मिनट के लिए पर्याप्त ऊतक स्थिरीकरण की अवधि के लगातार moistening से बचने के लिए या ल्युकोसैट को कम करने में मदद करता हैउत्तेजना.

Mesenteric इमेजिंग पर एक cremasteric इमेजिंग के एक प्रमुख लाभ के लिए आसान पहुँच है कि उदर गुहा खोलने की जरूरत नहीं पड़ती है. कुल मिलाकर शल्य आघात कम है और या तो एक प्रेषित रोशनी के लिए मंच को देखने या Plexiglas, के रूप में हमारे प्रोटोकॉल, एक थर्मल महामारी illumintaion के लिए नियंत्रित एल्यूमीनियम मंच का उपयोग किया जाता है आसानी से प्रदर्शन पर बढ़ते. इसके अलावा, वसा है कि चारों ओर पुराने mesenteric इमेजिंग सीमित जानवरों में postcapillary venules एकत्र cremasteric ऊतक के आसपास अनुपस्थित है.

ल्युकोसैट लेबलिंग

Rhodamine 31 6G, acridine नारंगी या लाल acridine जो दाग नाभिक और / या कि लाल रक्त कोशिकाओं में पाया जाता है नहीं intracellular organelles के leukocytes में चुनिंदा जमा (और प्लेटलेट्स और endothelial कोशिकाओं में कुछ डिग्री करने के लिए) के रूप में 32 अभिकर्मकों. हम rhodamine 6G का उपयोग 0.4 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन, जो जनसंपर्क की सांद्रता में ल्युकोसैट पता लगाने के लिएeviously neutrophils की सक्रियता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव है दिखाया गया है 33 acridine नारंगी. बहुत अधिक दाग और arteriolar वाहिकासंकीर्णन के माध्यम (अप्रकाशित टिप्पणियों) के द्वारा पृष्ठभूमि phototoxicity दिखाया. प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एल ई डी का उपयोग सटीक उत्तेजना स्पेक्ट्रा प्रदान करता है और ल्युकोसैट सक्रियण और एक ही समय में केशिका रिसाव का पता लगाने के लिए जैसे विभिन्न तरंगदैर्य के संयोजन के रूप में और अधिक जटिल अनुप्रयोगों की अनुमति देता है और इसलिए में की भविष्य में पसंद की विधि होना चाहिए vivo इमेजिंग.

Cremasteric ऊतक में IRI

Cremaster मांसपेशियों ischemia के लागू आसानी से प्रदर्शन हो और पूरी तरह से मुक्त फ्लैप सर्जरी के रूप में नैदानिक ​​प्रासंगिक शर्तों को दर्शाता है. इसके अलावा, ठंड ischemia, गर्म ischemia या cremasteric superfusion के जैसे सूजन प्रभावित पदार्थों के साथ संशोधन आसानी से लागू किया जा सकता है. Intrascrotal इंजेक्शन choi का तरीका हो सकता हैCE के जब cremasteric ऊतक के उपचार रिकॉर्डिंग से पहले घंटे या दिन की जरूरत है.

IRI के लिए समय पाठ्यक्रमों की एक किस्म की आवश्यकता क्षति के स्तर पर निर्भर करता है उपयोग किया जा सकता है. हम यहाँ 30 मिनट ischemia के एक मॉडल का वर्णन करने के लिए पोत भर में एक नियत बिन्दु गुजर सफेद रक्त कोशिकाओं की गिनती reperfusion के दो घंटे के बाद रोलिंग के महत्वपूर्ण स्तर (चित्रा 3) का उत्पादन. रोलिंग में वृद्धि के रूप में मध्यम है कि यह पर्याप्त क्षमता के लिए, IRI में ब्याज की अन्य दवाओं के माध्यम से leukocytes उत्तेजित पत्ते. बहरहाल, समय के पाठ्यक्रमों की एक किस्म ल्युकोसैट आवश्यक सक्रियण के स्तर के आधार पर उपयोग किया जा सकता है 21, 25 ल्युकोसैट आसंजन सबसे अक्सर एक 100 में पोत दीवार में स्पष्ट रूप से दिखाई कोशिकाओं की गिनती से मापा जाता है. 200 माइक्रोन खिंचाव है कि 30 के लिए स्थिर रहना हालांकि इस समय प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न हो सकती हैं. हम IRI में पक्षपाती leukocytes है कि 60 मिनट के बाद महत्वपूर्ण है की संख्या में चिह्नित वृद्धि मनाया.

निष्कर्ष में धारीदार मांसपेशी ऊतक की intravital IRI में epifluorescence माइक्रोस्कोपी अच्छी तरह को चूहा cremasteric ऊतक में प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में यह सूजन अनुसंधान के लिए ल्युकोसैट सक्रियण vivo में की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्रदान करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम र Eisenhardt "ड्यूश Forschungsgemeinschaft (866/1-1 ईआइ) के एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the equipment: Company: Catalogue No.: Comments:
Forene 100% (V/V) Abbot B506 API isoflurane
Terylene Suture Serag Weissner OC108000
Portex Fine Bore Polythene Tubing Smiths Medical 800/100/100 0.28 mm inner Diameter
0,9% saline solution Fresinus Kabi 808771
Change-A-tip deluxe cautery kit Bovie Medical DEL1
Abbocath -T 14G Venisystems G713 - A01 used as lens tube
Servo Ventilator 900C Maquet used as animal ventialtor
Logical pressure transducer Smiths Medical MX1960
Sirecust 404 Monitor Siemens
ABL 700 Benchtop Analyzer Radiometer for blood gas measurement
Heating pad Effenberger 8319
Aluminum stage Alfun AW7022
Surgical microscope OPMI 6-SDFC Carl Zeiss
Microsurgical instruments lab set S&T 767
Biemer vessel clip Diener 64.562
Applying forceps Diener 64.568 for Biemer vessel clip
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich R4127
Vaseline white DAB Winthrop 2726853
Cover glasses 32x32 mm
Intravital setup
Zeis Axio Scope A-1 MAT Carl Zeis 490036 epifluorescence microscope
470 nm LED Carl Zeis 423052 fluorescence light source
Colibri 2 System Carl Zeis 423052
W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC Carl Zeis 421452 water immersion objective
AxioCam MRm Rev. 3 FireWire Carl Zeis 426509 high resolution digital camera
Axio vision LE software Carl Zeis 410130 use for offline analysis

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References

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चिकित्सा अंक 66 इम्यूनोलॉजी फिजियोलॉजी आण्विक जीवविज्ञान microcirculation ischemia reperfusion की चोट चूहा cremaster मांसपेशियों ल्युकोसैट सक्रियण intravital माइक्रोस्कोपी
Ischemia-reperfusion की चोट में ल्युकोसैट - endothelial सहभागिता के वास्तविक समय डिजिटल चूहा cremaster स्नायु की इमेजिंग (IRI)
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Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark,More

Thiele, J. R., Goerendt, K., Stark, G. B., Eisenhardt, S. U. Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle. J. Vis. Exp. (66), e3973, doi:10.3791/3973 (2012).

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