Summary
Digital intravital epifluorescence mikroskopi av postcapillary venules i cremasteric mikrosirkulasjonen er en praktisk metode for å få innsikt i leukocytt-endotelial interaksjon
Abstract
Iskemi-reperfusjon skade (IRI) har vært innblandet i et stort utvalg av patologiske tilstander som hjerneslag, hjerteinfarkt, intestinal iskemi samt følge transplantasjon og kardiovaskulær kirurgi. En reperfusjon av tidligere iskemisk vev, mens avgjørende for forebygging av irreversibel vevsskade, utløser overdreven betennelse i vev. I tilknytning til produksjon av reaktive oksygenforbindelser, aktivering av komplementsystemet og økt mikrovaskulær permeabilitet, er aktivering av leukocytter en av de fremste aktørene i patologisk kaskade av inflammatoriske vevsskader under reperfusjon. 2, 3 leukocyttantigener aktivisering en multistep prosess bestående av 4 rullende, fast heft og sjelevandring og formidles av et komplekst samspill mellom adhesjonsmolekyler i respons til chemoattractants som komplement faktorer, chemokines eller blodplate-aktiverende faktor.
<p class = "jove_content"> Mens leukocytt rullende i postcapillary venules hovedsakelig skjer av et samspill av selectins 5 med sine telleren ligander, fast adhesjon av leukocytter til endotel er selektin-kontrollert via binding til intercellulær adhesjonsmolekyler (ICAM) og vaskulær cellulære adhesjonsmolekyler (VCAM). 6, 7Gullstandard for in vivo observasjon av leukocytt-endotelial interaksjon er teknikken for intravital mikroskopi, først beskrevet i 1968. 8
Selv om ulike modeller for IRI (iskemi-reperfusjon skade) har blitt beskrevet for ulike organer, 9-12 bare få er egnet for direkte visualisering av leukocytt rekruttering i mikrovaskulær sengen på et høyt nivå av bildekvalitet. 8
Vi her fremme digital intravital epifluorescence mikroskopi av postcapillary venule i cremasteric mikrosirkulasjonenav rotte 13 som en praktisk metode for å kvalitativt og kvantitativt analysere leukocytt rekruttering for IRI-forskning i tverrstripet muskelvev og gir en detaljert manual for å utføre teknikken. Vi ytterligere illustrere vanlige fallgruvene og gir nyttige tips som bør sette leseren virkelig setter pris på, og sikkert utføre metoden.
I en trinnvis protokollen skildre hvordan vi skal komme i gang med åndedrett kontrollert anestesi henhold tilstrekkelig overvåking for å holde dyret fast bedøvet for lengre perioder av gangen. Så beskriver cremasteric forberedelse som en tynn flat ark for fremragende optisk oppløsning og gi en protokoll for leukocytt bildebehandling i IRI som er godt etablert i våre laboratorier.
Protocol
1. Anestesi og overvåking
- Egnede nasjonale og institusjonelle etikk bør være på plass før du utfører dyreforsøk. Etter godkjenning fra etisk komité anesthetize mannlige Sprague Dawley rotter med en kroppsvekt 120-180 gram. Lever 2-3 vol% isofluran til en pleksiglass boks via isofluran vaporizer og plassere rotte inni.
- Så snart det riktige nivået av anestesi oppnås (mangel på reaksjon til tå eller hale knipe) rotta vektes og barbert på ventrale cervical området.
- Plasser rotte i dorsal recumbency på en varmepute for å holde kroppstemperaturen ved 37 ° C og gjelder isofluran på 2 vol% ved hjelp av en silikon maske.
Følgende forberedelse trinn er best gjøres ved hjelp av et kirurgisk mikroskop.
- For utarbeidelse av luftrøret, carotisar og vena jugularis, utføre en 2 cm horisontal hud innsnitt i området of suprasternal hakk og mobilisere spyttkjertlene sidelengs.
- Du står nå overfor den ventrale nakkemusklene. Nøye skille dem i midtlinjen og finne luftrøret. Expose 1 - 2 cm av luftrøret og plassere en mikro tang under det så som å heve den opp.
- Nå slit omtrent halvveis gjennom ventrale siden av luftrøret. Vær forsiktig med å skjære helt igjennom, hvis du gjør det, vil den avskårne enden av luftrøret gli tilbake i brystet og være svært vanskelig å jobbe med.
- Sett en Abbocath tube (14g) brukt som trakealtuben inn i den nedre delen av luftrøret, som tidligere har vært koblet til en dyr ventilator. Tips: Firm fiksering på magneten klemmer samt suturing av luftrøret rundt røret er viktig å holde trakealtuben på plass. Vanligvis bruker vi Terylene 5/0 sutur, kan imidlertid lignende sutur materiale brukes.
- Respirasjon kan da være volum kontrollert (frekvens, 35 - 45 åndedrag per minutt, tidevolum, 4,5 - 5 ml; FiO 2 14 atelektase kan forebygges ved å opprettholde en positiv end-ekspiratorisk trykk på 5 til 10 mm av H 2 O. 15
- For carotis canulation, er retten sternohyoid muskelen adskilt med stump disseksjon for å finne halspulsåren.
- Skill nervus vagus nøye fra halspulsåren og montere arterie på en vinklet mikro tang for å stoppe blod strømmer fra hjertet.
- Pass to stykker av samme lengde sutur under halspulsåren. I referanse til hjertet, blir det mer distale sutur knyttes tett til occlude blod som strømmer fra hodet regionen, mens den proksimale sutur er bundet løst rundt halspulsåren.
- Ved hjelp av mikro saks et lite kutt er gjort i halspulsåren mellom de to ligaturer.
- Sett en polyetylen kateter (0,28 mm innvendig diameter) fylt med fysiologisk saltvann som er koblet til en trykkgiver.
- Remove mikro tang og tråd kateteret lenger inn i arterien. Stram deretter den proksimale ligatur rundt arterien og kateteret. Tips: Bruk av en andre proksimale sutur hindrer blødning etter fjerning mikro tang.
- Bind den distale ligatur rundt carotis og kateteret for ytterligere forankring.
- Overvåk anestesi kontinuerlig ved å overvåke puls og arterietrykk. Utfør periodiske arteriell blodgass-analyser ved en blodgass analysator. 16 A hjertefrekvens lavere enn 300 bpm eller over 360 bpm, samt en gjennomsnittlig arterietrykk synker under 80 mmHg i mer enn 5 minutter er kriteriene for utelukkelse. 17, 18 Oppretthold blod pH innenfor fysiologiske grenser (7,35 til 7,45). Dersom forsøket må sies opp på grunn av unormale overvåking priser, scarify dyret ved halsen forvridning eller exanguation.
For intravenøs bruk av fluorescerende fargestoffer eller andre rusmidler of interesse, utføre følgende:
- Fokus området venstre vena jugularis med den kirurgiske mikroskop.
- Med tang i hver hånd, rive den tynne fascia å avdekke vena jugularis. Monter blodåre på en vinklet mikro tang. Blodstrøm vil da stoppe.
- Ved hjelp av pinsett, er to stykker av samme lengde sutur passerte under vena jugularis konkordant til carotis canulation. Knyt distale sutur tett og proksimale sutur løst rundt vena jugularis.
- Lag et lite snitt i vena jugularis og sette inn en polyetylen kateter (0,28 mm indre diameter) som har blitt skylt med saltvann. Marker det snittet og canulation kan være mer krevende og tidkrevende enn den carotis.
- Træ kateteret mot hjerte og stram ligatur nærmest hjertet rundt venen og kateteret.
- Etter konform patency, knytte distal ligatur rundt kateteret. Tips: Ekstra fiksering av both kateter med tape kan forhindre dislodgment.
- Skyll katetre ofte for å hindre intraluminal blodpropp.
2. Klargjøring av Cremaster Muscle
- Vi bruker en aluminium stadium på 1,5 - 2 cm tykkelse for cremasteric bildebehandling. Scenen vedtar raskt ønsket temperatur på varmeputen dermed lindre termisk kontroll over cremasteric vev. Dette er avgjørende for betennelser studier. Alternativt en pleksiglass plattform kan benyttes om regulering av cremasteric temperaturen er vanskeligere. Plasser pungen i sentrum av scenen.
- Den første innsnitt er gjort i huden og ytre spermatic fascien over pungen i selve distale enden etterfulgt av forsiktig utvidelse av subdermal plass med fin saks. Unngå å berøre det underliggende vevet med instrumentene.
- Så snart vevet blir utsatt den er fuktet med forvarmet (37 ° C) fosfatbufret saltvannsoppløsning with kalsium og magnesium. Påfør løsningen regelmessig for å utildekket vev.
- Bindevev mellom ekstern spermatic fascia og cremaster muskelen er nøye fjernes for å frigjøre cremaster muskel fra omkringliggende vev.
- Den ytre overflaten av cremaster muskelen er så forsiktig ryddet av bindevev. Kontinuerlig superfusion under disseksjon hydrater bindevev, tilrettelegging synlighet og fjerning.
- Suture den distale enden av cremaster sekk å holde nede og litt forlenge slutten av sekken.
- Incise den distale enden av sekken på den ventrale aspektet og forlenge snittet proksimalt bruker mikro saks. Nøye cauterize blødning fartøy langs snittet linjene benytter et termisk elektrokirurgi. Unngå unødvendig cauterization å begrense ytterligere inflammatoriske stimuli. Tips:. Blodstrøm dynamikk nær periferien av preparatet er endret av denne vevsskade 19 Derfor, for å minimerese påvirker på datainnsamling, bør blodårer nær sentrum av preparatet brukes til bildebehandling.
- Den åpne cremaster ligger flatt på aluminium pidestall men fortsatt forbundet med en tynn ligament til bitestikkelen under testikkel. Gjenspeiler den testikkel til en side eksponerer dette ligament inkludert en liten arterie og vene som kobles til bitestikkelen. Bruk elektrokirurgi å forsegle skipene og ansette de mikro saks til å klippe den connective ligament mellom testikkel og cremasteric vev.
- Skyv tilbake den isolerte testikkel i lyskekanalen. Andre forfattere resect testikkelen etter proksimale ligatur (orchiectomy) sammen med tilhørende inguinal kjepphest pad. 20. I en følsom modell som IRI indusert leukocytt aktivering vi prøver å unngå alle andre kirurgiske stimuli, derfor vi avstå fra resecting testis, som vanligvis ikke nødvendig for å få tilstrekkelig eksponering av cremaster muskelen.
- I tillegg til den førstefiksering sutur fire kantene av vev (to på hver side) og fest trådene til kassetter for å forsiktig spre cremasteric vev radialt på aluminium scenen. Forlate et gap mellom aluminium scenen og den eksterne inngangen til lyskekanalen forenkler påfølgende cremasteric klipping for iskemi.
- Place to endene av polyetylen kateter (0,28 mm indre diameter) nær cremasteric vev for superfusion oppsett. Kontroller at lumen er fri for luft for å unngå luftbobler i eventuell væske kammeret.
- Tegn en linje av vaselin (vaselin) rundt cremaster muskel med en sprøyte. Linjen må utvide størrelsen på dekkglass som brukes til dekning.
- For å opprette en væske kammer, plasserer en firkant dekkglass (32 × 32 mm) over cremasteric vev og fest kantene til vaselin linjen.
- I tilfelle cremasteric vevet ikke er superfused med en bestemt medikament, kontinuerlig utskifting av den omkringliggende influensaid er uviktig. En enkelt påføring av fosfatbufret saltvannsoppløsning med kalsium og magnesium i laget kammeret kan da være tilstrekkelig. Lokal stimulering med narkotika derimot bør utføres kontinuerlig via micro-perfusjon pumpe med en hastighet på 3 ml per time.
- Den cremasteric vev er nå klar for mikroskopisk bildebehandling.
3. Intravital Setup
Den grunnleggende intravital oppsett kan variere. For epifluorescence bildebehandling forsøkene bør utføres i et mørkt rom.
- Dyret overføres til scenen av en intravital epifluorescence mikroskop utstyrt med en 470 nm LED lysende kilde for epi-belysning. Bruk en nedsenking i vann objektiv (20 × / 1,0) for å oppnå en forstørrelse på ca 800 ×. Vanlig observasjoner ved hjelp av et høyoppløselig digitalt kamera og lagre poster på en personlig datamaskin for frakoblet evaluering.
- For leukocytt merking, injiserer rhodamine6G intravenøst via vena kateteret i konsentrasjoner på 0,4 mg / kg kroppsvekt.
- Velg en postcapillary venule for observasjon. Fartøy størrelse bør ligge mellom 20-60 mikrometer og blodstrøm bør være tilstrekkelig. For å minimere påvirkning av pre-aktivering av vev, kan bare fartøy som leukocytt rullende er <20 cells/30 sekunder og antall heftende celler <10 cells/200μm av venular endotelet benyttes for videre analyse.
- Hvis mulig, kan opptil tre postcapillary venules brukes til observasjon, men de bør plasseres i en tilsvarende del av cremasteric vev for å unngå forvirrende fartøyene på ulike tidspunkter.
4. Iskemi-reperfusjon Injury (IIR)
- La vev stabilisere i 30 minutter.
- Utfør et opptak av 30 sekunder å etablere basal verdier for leukocytter rullende og etterlevelse. Ideelt sett generere totalt tre basale opptak for å bekrefte celletall og for å få standardavvik.
- Stikk forsiktig en Biemer fartøy klipp rundt selve proksimale enden av utsatt cremasteric vev ved hjelp av Application tang. Stasis bør skje umiddelbart og kan visualiseres ved epifluorescence mikroskopi i den observerte fartøyet delen.
- En rekke av tid kurs kan utnyttes avhengig av nivået av skade som kreves. Vi bruker 30 minutter av iskemi tid som beskrevet av andre forfattere. 21-23 Ta fartøyet klemmen etterpå. La blodet til å stabilisere ytterligere 15 minutter.
- Senere opptak av 30 sekunders varighet kan gjøres gjennom hele reperfusion periode (f.eks 30 sekunder hvert 15. minutt). Lagre opptakene digitalt for offline analyse.
- For avslutning av forsøket, er rotta avlives ved cervical forvridning henhold tilstrekkelig anestesi ved å trykke på en stump gjenstand som kjedelig kanten av en saks blad i bunnen av hodeskallen. Med den andrehånd, er haleroten raskt trukket, forårsaker utskillelse av cervical vertebrae fra skallen.
5. Offline Videoavspilling Analysis
- For offline videoavspilling analyse er det nyttig å bruke programvare som tillater valg av forskjellige bilder og observasjon av videosekvensen i slow motion. Juster kontrast og lysstyrke på riktig måte. Vi bruker programvare levert av produsenten av mikroskop som tillater lengdemålingene og digital forstørrelse.
- For kvantifisering av leukocytt rullende, definere en virtuell linje som skjærer fartøyet vertikalt som er konsistent i alle rekorder. Tell antall rullende leukocytter som passerer linjen innen 30 sekunder manuelt.
- For kvantifisering av heftende leukocytter, definere en 200 mikrometer fartøy delen som er konsistent i alle postene 23 Tell antall klart synlige leukocytter som forblir statisk under 30 sekunder -. Dermed å definereed som tilhenger. 24
6. Representative Resultater
IRI av cremaster muskelen har ingen effekt på gjennomsnittlig arterietrykk (MAP), hjertefrekvens og blod pH
Bruke nevnte oppsett (figur 1), undersøkte vi mikrosirkulasjonen i IRI over en to timer protokoll, men en mye lengre observasjonstid opp til 6 timer er mulig. Som vist i figur 2, har IRI av cremaster muskelen ingen signifikante macrohemodynamic effekter på rotte omløp som gjennomsnittlig arterietrykk og pulsen forbli stabil gjennom hele undersøkelsesperioden. Videre har vi overvåket homeostase ved hyppige målinger av arterielt blod-pH som varierte innenfor fysiologiske grenser og viste ingen signifikante inter-gruppeforskjeller.
IRI induserer leukocytt rullende i cremasteric sirkulasjon
Leukocytt endotelial interaksjon er et viktighendelse i akutt betennelse. Ved hjelp av intravital mikroskopi fant vi en tidsavhengig økning i antall rullende leukocytter i IRI av cremaster muskelen (figur 3A) konkordant med tidligere data 21, 25. Rolling montert over to timer observasjon tid til maksimalt 137,63 ± 22,55% av baseline verdi etter 120 minutter reperfusjon tid og deretter nådde statistisk signifikans i forhold til falske opererte dyr (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% av baseline verdi).
IRI induserer leukocytt heft i cremasteric sirkulasjon
For ytterligere evaluering av leukocytt-endotelial interaksjon analysert vi leukocytt heft i en 200 mikrometer fartøy delen. IRI induseres en økning i antall heftende leukocytter som vesentlig oversteg verdien av humbug operert dyr etter 60 minutter (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% av grunnverdi) og videre ascended av 120 minutter med reperfusjon (Figur 3B).
I sammendraget den beskrevne in vivo modell leverer konsistente data til akutt leukocytt aktivering i IRI mens dyr overlevelse og sirkulasjon stabilitet garanteres.
Figur 1. A. Flytskjema for intravital epifluorescence mikroskopi ytelse i iskemi-reperfusjon skade av rotte cremaster muskelen. Etter nødvendige forberedelser for anestesi og overvåking, er rotta cremaster muskelen utsettes for bildebehandling. Registreringer av leukocytt aktivering blir tatt før og etter vev iskemi. Etterfølgende videoanalyse er best å utføre offline. B. Skjematisk figur på den foreslåtte intravital oppsettet. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. IRI av cremaster muskelen har ingen effekt på gjennomsnittlig arterietrykk (MAP), hjertefrekvens og blod pH. Gjennomsnittlig arterietrykk (A) og hjertefrekvens (B) ble overvåket hvert 30. minutt hele eksperimentet via trykkgiveren etter canulation av retten carotisar. Måling av arterielle blod-pH (C) ble utført etter 0, 60 og 120 minutter. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av 6 forskjellige rotter og varierte på fysiologiske nivåer uten betydelige inter-gruppeforskjeller. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. IRI øker leukocytt-Endotelial interaksjon i cremasteric sirkulasjon. Etter merking av leukocytter med rhodamine 6G (0,4 mg / kg kroppsvekt) intravital epifluorescence mikroskopi ble brukt til å bestemme leukocytt-endotelial interaksjon i reperfusion skade over en 120 minutter protokollen etter 30 minutter av vev iskemi. Records ble tatt på forstørrelse på ca × 800. A. IRI signifikant øker antallet rullende leukocytter i postcapillary venules av cremaster muskel ved 120 minutter reperfusjon mens leukocytt rullende forblir stabil gjennom hele forsøket i cremasteric vev som ikke gjennomgår iskemi. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av 6 observerte rotter. # P <0,05 bruker uparet t-test. B. Antallet heftende leukocytter er betydelig økt i en tilfeldig valgt 200μm postcapillary fartøy seksjon etter 30 minutter av cremasteric iskemi og påfølgende 60 minutter av vev reperfusjon. Resultater blir enda more uttalt etter en to timer reperfusjon periode. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av 6 observerte rotter. # P <0,05 bruker uparet t-test. C. Representative bilder av en postcapillary venule før iskemi (til venstre) og 120 minutter etter IRI (til høyre). Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leukocytt-endotelial interaksjon, produksjon av reaktive oksygenforbindelser og aktivering av komplementsystemet er de viktigste funksjonene i IRI-indusert vev dysfunksjon. 26 mikrosirkulasjonen i det berørte vevet er regnet som den integrerende nettstedet for inflammatorisk utbruddet. Bortsett fra ex vivo eksperimenter som flyt kammerkor analyser 27, 28 er det obligatorisk å gi veletablerte modeller av intravital bildebehandling for å ytterligere evaluere in vivo relevans. Selv IRI har vært innblandet i ulike organsystemer, vi her beskriver en metode for å systematisk undersøke leukocytt-endotelial interaksjon i reperfusion skade av tverrstripet muskelvev som først ble beskrevet av Baez et al 13, dermed spesielt relevant i klaffen kirurgi (figur 1). 29 Da det antas at post-iskemisk vev skade av andre organer innebærer de samme inflammatoriske mekanismer kan beskrives modellen brukes til Gain prinsippet innsikt i patofysiologiske mekanismer av IRI, relevante i forhold som hjerteinfarkt, hjerneslag eller intestinal iskemi.
Dyr som brukes
Modellen som presenteres her er egnet for de fleste gnagere inkludert rotter og mus. For den lange perioden med bildebehandling som er nødvendig i denne modellen generelt foretrekker vi rotter som tracheotomy og volum kontrollert respirasjon lett kan utføres. I kombinasjon med kardiovaskulær bildediagnostikk via arteriell canulation, kan rotter holdes sirkulasjons-og homeostatically stabil i flere timer (figur 2). Videre cremasteric vev er mer omfattende i rotter enn det er i mus forlater flere alternativer for postcapillary avbildning. Selv om vevet forberedelse kan være lettere preformed i lager rotter, bør man vurdere at cremasteric vev og særlig cremasteric konseptet er tynnere i unge rotter (100 -150 g) og dermed redusere bakgrunnsfluorescens og overlapping av additional fascial vev. Men en fordel med å bruke mus for intravital mikroskopi er tilgjengeligheten av transgene dyr, uvurderlig for å belyse den rolle de enkelte gener i modulerende microcirculatory hendelser.
Vevstyper
Siden først beskrev, har intravital mikroskopi vært brukt i en rekke microcirculatory preparater inkludert master kinnet posen, kanin øret, gnager mesenteriet, og cremaster. Ett største ulempen forbundet med de fleste av disse preparatene er potensialet aktivering av celler ved kirurgisk manipulering ledsaget med en forbigående økning i rullende og tilhenger leukocytter som har blitt godt beskrevet for mesenteriet. 30 Cremasteric forberedelse har derfor utføres med ekstrem varsomhet. Vår erfaring, bidrar hyppig fuktes av eksponert vev og restriktive cauterization samt en tilstrekkelig vev stabilisering periode på minst 30 minutter for å unngå eller redusere leukocyttstimulering.
En stor fordel med cremasteric bildeteknologi enn mesenteric bildediagnostikk er det lett tilgjengelighet som sparer åpning av bukhulen. Samlet kirurgisk traume reduseres og montering på enten en pleksiglass ser scenen for overført belysning eller, som utnyttet vår protokoll, en termisk kontrollert aluminium plattform for epi-illumintaion enkelt utført. Videre er fett som samler rundt postcapillary venules i voksne dyr begrensende mesenteric bildebehandling fraværende rundt cremasteric vev.
Leukocytt merking
Reagenser som rhodamine 31 6G, acridine oransje eller acridine rød som flekken kjerner og / eller intracellulære organeller som ikke finnes i røde blodlegemer akkumuleres selektivt i leukocytter (og til en viss grad i blodplater og endotelceller) 32. Vi foretrekker å bruke rhodamine 6G for leukocytt påvisning i konsentrasjoner på 0,4 mg / kg kroppsvekt, som har previously vist seg å ha noen signifikant effekt på aktivering av nøytrofile. 33 Acridine oransje viste mye mer bakgrunn flekken og fototoksisitet ved hjelp av arteriolar vasokonstriksjon (upubliserte observasjoner). Utnyttelsen av lysdioder for fluorescens bildebehandling gir presis eksitasjon spektra og gir mer komplekse applikasjoner som for eksempel en kombinasjon av ulike bølgelengder for eksempel for påvisning av leukocytt aktivering og kapillær lekkasje samtidig, og bør derfor være metoden for valg i fremtiden for i vivo imaging.
IRI i cremasteric vev
Anvendelse iskemi til cremaster muskel kan lett utføres og gjenspeiler perfekt klinisk relevante forhold som for eksempel gratis klaff kirurgi. Videre kan endringer som kulde iskemi, varm iskemi eller cremasteric superfusion med stoffer som påvirker betennelser være lett å påføre. Intrascrotal injeksjon kan være metoden for ChoiCE når behandling av cremasteric vev er nødvendig timer eller dager før innspilling.
En rekke av tid kurs for IRI kan utnyttes avhengig av nivået av skade som kreves. Vi her beskriver en modell på 30 minutter iskemi å produsere betydelige nivåer av rullende etter to timer med reperfusjon (figur 3) ved å telle hvite blodlegemer passerer et fast punkt på tvers av fartøyet. Som økning i rullende er moderat den forlater nok potensial til å stimulere leukocytter i IRI gjennom andre legemidler av interesse. Imidlertid kan en rekke tid kurs benyttes avhengig av nivået på leukocytt aktivering kreves 21, 25 leukocyttantigener heft er oftest målt ved å telle celler klart synlige i åreveggen i en 100 -. 200 mikrometer strekningen som gjenstår stillestående for 30 s , men denne gangen kan variere blant laboratorier. Vi observerte en markert økning i antall heftende leukocytter i IRI som fikk signifikant etter 60 minutter.
I konklusjonen intravital epifluorescence mikroskopi i IRI av tverrstripet muskelvev kan godt utføres i rotte cremasteric vev som det gir reproduserbare data fra in vivo leukocytt aktivering for betennelse forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend av "Deutsche Forschungsgemeinschaft" til SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 - A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32x32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. von Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , Oxford University Press. New York. 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
