Summary
Digital intravital epifluorescensmikroskopi av postkapillära venoler i cremasteric mikrocirkulationen är en bekväm metod för att få insikter i leukocyt-endoteliala interaktionen
Abstract
Ischemi-reperfusionsskada (IRI) har implicerats i ett stort arrangemang av patologiska tillstånd, såsom cerebral stroke, myokardinfarkt, intestinal ischemi såväl som efter transplantationskirurgi och kardiovaskulär kirurgi. 1 Reperfusion av tidigare ischemisk vävnad, medan väsentliga för förhindrande av irreversibel vävnadsskada, framkallar överdrivet inflammation i angripna vävnaden. Intill produktion av reaktiva syrespecies, aktivering av komplementsystemet och ökad mikrovaskulär permeabilitet, är aktiveringen av leukocyter en av de principiella aktörer i patologiska kaskad av inflammatorisk vävnadsskada under reperfusion. 2, 3 är leukocytaktivering en flerstegsprocess som består valsningsriktningen, starka adhesion och och medieras av en komplex interaktion mellan adhesionsmolekyler som svar på kemoattraktanter såsom komplementfaktorer, kemokiner, eller blodplättsaktiverande faktor. 4
<p klass = "jove_content"> Medan leukocytrullning i postkapillära venoler huvudsakligen medieras genom interaktion av selektiner 5 med deras motsvarigheter ligander, fast adhesion av leukocyter till endotelet är selektin-styrd via bindning till intercellulära adhesionsmolekyler (ICAM) och vaskulär cellulära adhesionsmolekyler (VCAM) 6, 7Gyllene standarden för in vivo-observation av leukocyt-endoteliala interaktion är tekniken för intravital mikroskopi, som först beskrevs 1968. 8
Fastän olika modeller av IRI (ischemi-reperfusionsskada) har beskrivits för olika organ, 9-12 endast ett fåtal är lämpliga för direkt visualisering av leukocytrekrytering i den mikrovaskulära bädden på en hög nivå av bildkvalitet. 8
Vi främjar här digitala intravital epifluorescensmikroskopi av postkapillära venolen i cremasteric mikrocirkulationenav rått 13 som en bekväm metod för att kvalitativt och kvantitativt analysera leukocytrekrytering för IRI-forskning i tvärstrimmig muskelvävnad och ger en detaljerad handbok för att åstadkomma tekniken. Vi illustrerar ytterligare gemensamma fallgropar och ger användbara tips som ska hjälpa läsaren att verkligen uppskatta, och säkert utföra metoden.
I ett steg för steg protokoll vi skildra hur du kommer igång med andningen kontrollerad anestesi under tillräcklig övervakning för att hålla djuret ordentligt sövd under längre perioder. Vi beskriver sedan cremasteric beredningen som en tunn platt ark för enastående optisk upplösning och ger ett protokoll för leukocyt avbildning i IRI som har väl etablerade i våra laboratorier.
Protocol
1. Anestesi och övervakning
- Lämpliga nationella och institutionella etik bör vara på plats innan du utför djurförsök. Efter godkännande från etikkommittén bedöva Sprague Dawley råttor med en kroppsvikt från 120 till 180 gram. Leverera 2 till 3 vol% isofluran till Plexiglas boxen via isofluran förångare och placera råttan insidan.
- Så snart en lämplig nivå av anestesi uppnås (brist på reaktion på tå eller svans nypa) är råttan viktas och rakade på ventrala cervikala området.
- Placera råttan i dorsala VILA på en värmedyna för att bibehålla kroppstemperaturen vid 37 ° C och tillsätt isofluran vid 2 volym-% med användning av en silikon masken.
Följande framställningsstegen är bäst åstadkommas med användning av ett kirurgiskt mikroskop.
- För framställning av luftstrupen, karotidartären och jugularvenen, utför en 2 cm horisontell hudsnitt i området OF halsgropen och mobilisera spottkörtlarna i sidled.
- Du står nu inför de ventrala nackmusklerna. Försiktigt separera dem i mittlinjen och hitta luftstrupen. Exponera 1 - 2 cm av luftstrupen och placera en mikro tång under den för att höja upp den.
- Nu skära halvvägs genom den ventrala sidan av trakea. Var noga med att inte skära hela vägen igenom, om du gör det kommer den avskurna ändan av luftstrupen glida tillbaka in i bröstet och vara mycket svårt att arbeta med.
- Sätt en Abbocath rör (14G) användes som trakeal tub in i den nedre delen av luftstrupen, som tidigare har anslutits till ett djur ventilator. Tips: Firm fixering på magneten klämmor samt suturering av luftstrupen runt röret är viktigt att hålla trakealtuben på plats. Generellt använder vi Terylene 5/0 sutur, kan dock liknande sutur material användas.
- Respiration kan sedan volymen styrd (frekvens, 35 - 45 andetag per minut, tidalvolym, 4,5 - 5 ml; FiO 2 14 Atelektas kan förhindras genom att upprätthålla en positivt slutexpiratoriskt tryck av 5 till 10 mm av H 2 O 15
- För den karotiska canulation, är den högra sternohyoid muskeln separeras genom trubbig dissektion för att lokalisera den stora halspulsådern.
- Separera vagusnerven försiktigt från halspulsådern och montera artär på en vinklade mikro pincett för att stoppa blodflödet från hjärtat.
- Passera två stycken med samma längd av suturen under karotidartären. Med hänvisning till hjärtat, desto mer distala suturen knuten hårt för att täppa till blodflödet från huvudet regionen, medan den proximala suturen knyts löst runt halspulsådern.
- Med en mikro sax ett litet snitt görs i halspulsådern mellan de två ligaturer.
- Sätt en polyetenkateter (0,28 mm inre diameter) fylld med fysiologisk koksaltlösning som är ansluten till en trycktransduktor.
- Remove mikro tången och tråden katetern vidare in i artären. Dra sedan åt den proximala ligaturen runt artären och kateter. Tips: Tillämpning av en andra proximal sutur förhindrar blödning efter avlägsnande av mikro pincetten.
- Knyt den distala ligaturen runt halspulsådern och katetern för ytterligare förankring.
- Övervaka anestesi kontinuerligt genom att övervaka hjärtfrekvens och blodtryck. Utför återkommande arteriella analyser blodgaser med hjälp av en analysator blodgas 16. Ett hjärta som är lägre än 300 slag per minut eller mer än 360 slag per minut samt en medelartärtrycket sjunker under 80 mmHg under längre tid än 5 minuter är kriterier för uteslutning. 17, 18 Behåll blod pH inom fysiologiska gränser (7,35 - 7,45). I det fall försöket måste avslutas på grund av onormala övervakning priser, scarify de animaliska nacken störningen eller exanguation.
För intravenös applicering av fluorescerande färgämnen eller andra läkemedel of intresse, utför följande:
- Fokusera på området av den vänstra halsvenen med kirurgiskt mikroskop.
- Med pincett i varje hand, riva den tunna fascia att avslöja halsvenen. Montera venen på ett vinklat mikro pincett. Blodflödet kommer då stanna.
- Användning av pincett, är två stycken med samma längd av suturen passera under halsvenen konkordant till den karotiska canulation. Knyt den distala suturen ordentligt och den proximala suturen löst runt halsvenen.
- Göra ett litet snitt i jugularvenen och infoga en polyetenkateter (0,28 mm inre diameter) som har spolas med saltlösning. Markera att snittet och canulation kan vara mer krävande och tidskrävande än halspulsådern.
- Trär katetern mot hjärtat och dra åt ligaturen närmast hjärtat runt en ven och katetern.
- Efter konform öppenhet, knyta distal ligatur runt katetern. Tips: Ytterligare fixering av Both katetrar med tejp kan förhindra rubbas.
- Skölj katetrar ofta för att förhindra intraluminal koagulering.
2. Framställning av den kremastermuskeln
- Vi använder en aluminium stadium av 1,5 till 2 cm tjocklek för cremasteric avbildning. Steget antar snabbt den önskade temperaturen av värmedynan på så vis minska termisk kontroll av cremasteric vävnad. Detta är avgörande för inflammation studier. Alternativt en Plexiglas plattform kan användas fastän regleringen av cremasteric temperaturen är svårare. Placera pungen i mitten av scenen.
- Den initiala snitt görs i huden och yttre spermatica fascia ovan pungen i själva distala änden, följt av försiktig dilatation av den subdermala rymden med hjälp av fina saxar. Undvik att röra den underliggande vävnaden med instrumenten.
- Så snart som den vävnad exponeras det fuktas med förvärmd (37 ° C) fosfatbuffrad saltlösning wite kalcium och magnesium. Applicera lösningen regelbundet till någon exponerad vävnad.
- Bindväv mellan den externa spermatica fascia och kremastermuskeln avlägsnas försiktigt för att frigöra kremastermuskeln från omgivande vävnad.
- Den yttre ytan av den kremastermuskeln är därefter försiktigt bort från bindväv. Kontinuerlig superfusion under dissektion återfuktar bindväv, vilket underlättar synlighet och borttagning.
- Suturera den distala änden av cremaster säcken för att hålla ner och något förlänga änden av säcken.
- Incisionsfilm den distala änden av säcken på den ventrala aspekten och långsträckta snittet proximalt med en mikro sax. Försiktigt bränna blödning fartyg längs snittlinjerna använder en termisk kauterisation. Undvik onödig kauterisation för att begränsa ytterligare inflammatoriska stimuli. Tips:. Blood flödesdynamik nära periferin av beredningen ändras genom den här vävnadsskada 19 Därför, för att minimerase effekter på insamling av uppgifter bör blodkärl nära mitten av preparatet kan användas för avbildning.
- Den öppna cremaster ligger platt på fot i aluminium men fortfarande ansluten med en tunn ligament i bitestikeln under testikeln. Reflekterande testikeln åt sidan utsätter denna ledbandet med en liten artär och ven som ansluter till bitestiklarna. Använd diatermi att täta kärlen och använda mikro sax för att klippa den sammanbindande ligamentet mellan testikel och cremasteric vävnad.
- Tryck försiktigt tillbaka isolerade testikeln i inguinal kanalen. Andra författare resekera testikeln efter proximala ligatur (orkidektomi) tillsammans med den tillhörande inguinal modefluga pad. 20 I en känslig modell som IRI inducerad leukocytaktivering vi försöker att undvika alla ytterligare kirurgiska stimuli, därför har vi avstå från resektion testiklarna, vilket vanligtvis inte nödvändigt för att få tillräcklig exponering av kremastermuskeln.
- Förutom den förstafixering sutur fyra kanter av vävnad (två på varje sida) och fäst trådarna på band att försiktigt sprida cremasteric vävnaden radiellt på aluminium scenen. Lämna ett mellanrum mellan aluminium scenen och den externa ingången till inguinal kanalen förenklar senare cremasteric klippning för ischemi.
- Placera två ändar av polyeten kateter (0,28 mm inre diameter) nära cremasteric vävnaden för superfusion installationen. Se till att lumen är fri från luft för att undvika luftbubblor i den slutliga fluidkammaren.
- Dra en linje av vaselin (Vaseline) runt kremastermuskeln användning av en spruta. Raden måste utöka storleken på den täckremsa som används för täckning.
- För att skapa en fluidkammare, placera en kvadrat täckglas (32 × 32 mm) över cremasteric vävnaden och stadigt fästa kanterna på vaselin linjen.
- I det fall cremasteric vävnaden inte superfuseras med ett specifikt läkemedel, kontinuerlig ersättning av den omgivande influensaid är onödiga. En enda applicering av fosfatbuffrad saltlösning med kalcium och magnesium in i kammaren skapad kan sedan vara tillräcklig. Lokal stimulering med läkemedel emellertid bör utföras kontinuerligt via mikro-perfusion pumpen med en hastighet av 3 ml per timme.
- Den cremasteric vävnaden är nu klar för mikroskopisk bildanalys.
3. Intravital inställning
Den grundläggande intravital inställningen kan variera. För epifluorescens avbildning försöken bör utföras i ett mörkt rum.
- Djuret överförs till det stadium då en intravital epifluorescensmikroskop utrustat med en 470 nm LED ljuskälla för epi-belysning. Använd ett mål nedsänkning i vatten (20 × / 1,0) för att uppnå förstoring av cirka 800 ×. Spela observationer med hjälp av en högupplöst digitalkamera och register lagra på en persondator för offline utvärdering.
- För leukocyt märkning, injicera rodamin6G intravenöst via den jugulara katetern vid koncentrationer av 0,4 mg / kg kroppsvikt.
- Välj ett postkapillära venolen för observation. Kärlstorlek skall variera mellan 20-60 jim och blodflödet bör vara tillräcklig. För att minimera inverkan av pre-aktivering av vävnaden, kan endast fartyg som leukocytrullning är <20 cells/30 sekunder och antalet vidhäftande celler <10 cells/200μm av venular endotel användas för vidare analys.
- Om möjligt, kan upp till tre postkapillära venoler användas för observation, men de bör vara belägna i en motsvarande sektion av cremasteric vävnaden för att undvika sammanblandning av kärl vid olika tidpunkter.
4. Ischemi-reperfusionsskada (IIR)
- Låt vävnad stabiliseras under 30 minuter.
- Utför en inspelning av 30 sekunder för att fastställa basala värden för leukocyt rullning och vidhäftning. Helst generera totalt tre basala inspelningar att kontrollera cellensnummer och att erhålla standardavvikelser.
- Försiktigt placera en Biemer kärl klämman runt mycket proximala änden av den exponerade cremasteric vävnad med hjälp av tillämpning pincett. Stas bör ske omedelbart och kan visualiseras genom epifluorescensmikroskopi i den observerade fartyget sektionen.
- En mängd olika tidsförlopp kan användas beroende på nivån som krävs skador. Vi tillämpar 30 minuter ischemi tid som beskrivs av andra författare. 21-23 Ta bort fartyget klämman efteråt. Tillåta blodet att stabilisera under ytterligare 15 minuter.
- Efterföljande inspelningar av 30 sekunders varaktighet kan göras under hela reperfusion perioden (t.ex. 30 sekunder var 15: e minut). Spara inspelningar digitalt för offline analys.
- För terminering av experimentet är råttan avlivas genom halshuggning under tillräcklig anestesi genom att trycka ett trubbigt instrument som det dova kanten av ett saxbladet vid skallbasen. Med den andrasidan är basen av svansen snabbt dras, vilket separation av halskotor från skallen.
5. Offline Videouppspelning Analysis
- För offline-videouppspelning analys är det bra att använda programvara som tillåter val av olika bilder och observation av videosekvensen i slow motion. Justera kontrast och ljusstyrka på lämpligt sätt. Vi använder programvara som tillhandahålls av tillverkaren av mikroskop som gör det möjligt längd mätningar och digital förstoring.
- För kvantifiering av leukocyt rullande, definiera en virtuell linje som skär fartyget lodrätt som är konsekvent i alla poster. Räkna antalet rullande leukocyter som passerar linjen i 30 sekunder manuellt.
- För kvantifiering av vidhäftande leukocyter, definierar en 200 avsnitt um fartyg som är konsekvent i alla poster 23 Räkna antal klart synliga leukocyter som finns kvar statiska under 30 sekunder -. Därmed tydligt definierared som vidhäftande. 24
6. Representativa resultat
IRI av kremastermuskeln har ingen effekt på medelartärtrycket (MAP), hjärtfrekvens och blod pH
Använda nämnda setup (figur 1), undersökte vi mikrocirkulationen i IRI under en två timmar protokoll, men en betydligt längre observationstid på upp till 6 timmar är möjlig. Såsom visas i figur 2, har IRI i kremastermuskeln inga signifikanta macrohemodynamic effekter på råtta cirkulationen som det genomsnittliga arteriella trycket och hjärtfrekvensen förbli stabil under hela undersökningsperioden. Dessutom har vi övervakas homeostas av täta mätningar av arteriella blod-pH-värde som sträckte sig inom fysiologiska gränser och visade inga signifikanta skillnader mellan grupper.
IRI inducerar leukocyt rullande i cremasteric cirkulationen
Leukocyt endothelial interaktion är en viktighändelse i den akuta inflammationen. Medelst intravital mikroskopi vi funnit en tidsberoende ökning i antalet rullande leukocyter i IRI av kremastermuskeln (figur 3A) konkordant med tidigare uppgifter 21, 25. Rullande monteras över två timmar observationstiden till högst 137,63 ± 22,55% av utgångsvärdet efter 120 minuters reperfusion tid och sedan nådde statistisk signifikans jämfört med skenopererade djur (137,63 ± 22,55 vs 99,43 ± 14,04% av utgångsvärdet).
IRI inducerar leukocytadhesion i cremasteric cirkulationen
För ytterligare utvärdering av leukocyt-endotel interaktioner vi analyserat leukocytadhesion i en 200 nm fartyg avsnitt. IRI inducerade en ökning av antalet vidhäftande leukocyter som signifikant överskred värden skenopererade djur efter 60 minuter (118,33 ± 6,83 vs 96,27 ± 5,78% av baslinjevärdet) och ytterligare ASCEnded med 120 minuters reperfusion (fig 3B).
Sammanfattningsvis beskrivna in vivo-modell levererar enhetliga uppgifter av akut leukocyt aktivering i IRI medan djuröverlevnad och cirkulation stabilitet är motiverad.
Figur 1. A. Flödesschema för intravital epifluorescensmikroskopi prestanda i ischemi-reperfusionsskada av råttans kremastermuskeln. Efter nödvändiga förberedelser för anestesi och övervakning är råttan kremastermuskeln utsätts för avbildning. Register över leukocyt aktivering tas före och efter vävnadsischemi. Efterföljande videoanalys utförs bäst offline. B. Schematisk figur på den föreslagna intravital installationen. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. IRI av kremastermuskeln har ingen effekt på medelartärtrycket (MAP), hjärtfrekvens och blod pH. Medelartärtryck (A) och hjärtfrekvens (B) kontrolleras var 30 minuter under hela försöket via tryckgivaren efter canulation av rätten karotisartären. Mätning av arteriellt blod-pH (C) utfördes efter 0, 60 och 120 minuter. Värdena är medelvärden ± SEM av 6 olika råttor och varierade på fysiologiska nivåer utan signifikanta skillnader mellan grupper. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. IRI ökar leukocyt-Endoteliala interaktion i cremasteric cirkulationen. Efter märkning av leukocyter med rodamin 6G (0,4 mg / kg kroppsvikt) intravital epifluorescensmikroskopi användes för att bestämma leukocyt-endoteliala interaktion i reperfusionsskada över en 120 minuter protokoll efter 30 minuter av vävnadsischemi. Records togs vid förstoring på ca × 800. A. IRI betydligt ökar antalet rullande leukocyter i postkapillära venoler av kremastermuskeln med 120 minuter reperfusion medan leukocytrullning förblir stabil under hela experimentet i cremasteric vävnad som inte genomgår ischemi. Värdena är medelvärde ± SEM av 6 råttor observerade. # P <0,05 med oparade t-test. B. Antalet vidhäftande leukocyter ökar signifikant i en slumpmässigt vald 200 pm postkapillära fartyget avsnitt efter 30 minuters cremasteric ischemi och efterföljande 60 minuter av vävnad reperfusion. Resultat får även more uttalad efter en två timmar reperfusionsperioden. Värdena är medelvärde ± SEM av 6 råttor observerade. # P <0,05 med oparade t-test. C. Representativa bilder på ett postkapillära venolen före ischemi (vänster) och 120 minuter efter IRI (höger). Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leukocyt-endoteliala interaktion, produktion av reaktiva syrespecies och aktivering av komplementsystemet är de viktigaste egenskaperna hos IRI-inducerad vävnad dysfunktion. 26 mikrocirkulationen av den påverkade vävnaden betraktas som integralen platsen för den inflammatoriska debut. Bortsett från ex vivo experiment som analyser flödeskammare 27, 28 är det obligatoriskt att tillhandahålla väl etablerade modeller av intravital avbildning för att ytterligare utvärdera in vivo relevans. Även IRI har varit inblandad i olika organsystem, beskriver vi här en metod för att systematiskt undersöka leukocyt-endotel interaktion i reperfusionsskada i tvärstrimmig muskelvävnad som först beskrevs av Baez et al 13, vilket särskilt relevant i flikkirurgi (figur 1). 29 Eftersom det antas att post-ischemisk vävnadsskada av andra organ innefattar samma inflammatoriska mekanismer, kan den beskrivna modellen kan användas för att gain princip insikter patofysiologiska mekanismer IRI, relevanta vid tillstånd som hjärtinfarkt, cerebral stroke eller intestinal ischemi.
Använda djur
Modellen som presenteras här är lämplig för de flesta gnagare inklusive råttor och möss. För lång avbildning som är nödvändig i denna modell har vi föredrar i allmänhet råttor som trakeotomi och volym styrd andning lätt kan utföras. I kombination med hjärt-avbildning via arteriell canulation kan råttor hållas cirkulations-och homeostatically stabil i timmar (figur 2). Dessutom cremasteric vävnad är mer omfattande i råtta än i mus lämnar fler alternativ för postkapillära avbildning. Även vävnadsberedning kan vara lättare i förväg i pilsner råttor, bör man anse att cremasteric vävnad och speciellt cremasteric fascia är tunnare i unga råttor (100 -150 g) vilket minskar bakgrundsfluorescens och överlagring av additiOnal bindvävnaden. Men en fördel med att använda möss för intravital mikroskopi är tillgången av transgena djur, ovärderligt för att klargöra betydelsen av enskilda gener i modulerande mikrocirkulatoriska händelser.
Vävnadstyper
Sedan den första beskrivningen har intravital mikroskopi använts i en mängd av mikrocirkulatoriska beredningar innefattande master kindpåsen, kaninöra, gnagare tarmkäxet och cremaster. En viktig nackdel med de flesta av dessa preparat är den potentiella aktivering av celler genom kirurgisk manipulation tillsammans med en övergående ökning av rullande och anhängare leukocyter som har beskrivits väl för tarmkäxet. 30 Cremasteric Beredningen har därför utföras med stor försiktighet. Vår erfarenhet, hjälper ofta uppfuktning av den exponerade vävnaden och restriktiva kauterisation samt en tillräcklig vävnad stabiliseringsperiod på minst 30 minuter för att undvika eller minska leukocytstimulering.
En stor fördel med cremasteric avbildning över mesenterica avbildning är den enkla tillgänglighet som skonar öppning av bukhålan. Totalt kirurgiskt trauma minskar och montering på antingen plexiglas tittar scenen för genomlysning eller, som utnyttjade vi protokoll, en termiskt styrd aluminium plattform för epi-illumintaion är lätt utförs. Vidare är fett som samlar omkring postkapillära venoler hos äldre djur begränsar mesenterica avbildning saknas runt cremasteric vävnaden.
Leukocyt märkning
Reagens såsom rhodamin 6G 31, akridinorange eller akridin rött som fläck kärnor och / eller intracellulära organeller som inte finns i röda blodkroppar ansamlas selektivt i leukocyter (och i viss grad i trombocyter och endotelceller) 32. Vi föredrar att använda Rhodamine 6G för leukocyt-detektion vid koncentrationer av 0,4 mg / kg kroppsvikt, som har previously visat sig ha någon signifikant effekt vid aktivering av neutrofiler. 33 akridinorange visade mycket mer bakgrundsinformation fläcken och fototoxicitet genom arteriolär vasokonstriktion (opublicerade observationer). Användningen av lysdioder för fluorescens avbildning ger exakt excitationsspektra och tillåter mer komplexa applikationer såsom en kombination av olika våglängder t.ex. för upptäckt av leukocyt aktivering och kapillär läckage vid samma tidpunkt och bör därför vara den metod som väljs i framtiden i vivo-avbildning.
IRI i cremasteric vävnad
Tillämpa ischemi till kremastermuskeln kan lätt utföras och perfekt avspeglar kliniskt relevanta förhållanden såsom fri flikkirurgi. Dessutom kan modifieringar som kall ischemi, varmt ischemi eller cremasteric superfusion med ämnen som påverkar inflammationen lätt appliceras. Intrascrotal injektion kan vara förfarandet enligt Choice när behandling av cremasteric vävnaden behövs timmar eller dagar före inspelning.
En mängd tid kurser för IRI kan användas beroende på nivån som krävs skador. Vi beskriver här en modell av 30 minuter ischemi att producera signifikanta nivåer av valsning efter två timmar av reperfusion (fig 3) genom att räkna vita blodkroppar som passerar en fast punkt tvärs över kärlet. Som ökning i löpande är måttlig lämnar nog potential att stimulera leukocyter hos IRI genom andra läkemedel av intresse. Emellertid kan en mängd olika tidsförlopp användas beroende på graden av leukocyt krävs aktivering 21, 25 Leukocytadhesion oftast mäts genom att räkna celler klart synliga i kärlväggen i en 100 -. 200 m sträcka som förblir stationära i 30 sekunder , även om denna tid kan variera mellan laboratorier. Vi observerade en markant ökning av antalet vidhäftande leukocyter i IRI som fick signifikant efter 60 minuter.
Sammanfattningsvis intravital epifluorescensmikroskopi i IRI i tvärstrimmig muskelvävnad kan väl genomförd hos råtta cremasteric vävnad, eftersom det ger reproducerbara data in vivo leukocyt aktivering av inflammationsforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag av "Deutsche Forschungsgemeinschaft" för att SU Eisenhardt (EI 866/1-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the equipment: | Company: | Catalogue No.: | Comments: |
| Forene 100% (V/V) | Abbot | B506 | API isoflurane |
| Terylene Suture | Serag Weissner | OC108000 | |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smiths Medical | 800/100/100 | 0.28 mm inner Diameter |
| 0,9% saline solution | Fresinus Kabi | 808771 | |
| Change-A-tip deluxe cautery kit | Bovie Medical | DEL1 | |
| Abbocath -T 14G | Venisystems | G713 - A01 | used as lens tube |
| Servo Ventilator 900C | Maquet | used as animal ventialtor | |
| Logical pressure transducer | Smiths Medical | MX1960 | |
| Sirecust 404 Monitor | Siemens | ||
| ABL 700 Benchtop Analyzer | Radiometer | for blood gas measurement | |
| Heating pad | Effenberger | 8319 | |
| Aluminum stage | Alfun | AW7022 | |
| Surgical microscope OPMI 6-SDFC | Carl Zeiss | ||
| Microsurgical instruments lab set | S&T | 767 | |
| Biemer vessel clip | Diener | 64.562 | |
| Applying forceps | Diener | 64.568 | for Biemer vessel clip |
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | R4127 | |
| Vaseline white DAB | Winthrop | 2726853 | |
| Cover glasses | 32x32 mm | ||
| Intravital setup | |||
| Zeis Axio Scope A-1 MAT | Carl Zeis | 490036 | epifluorescence microscope |
| 470 nm LED | Carl Zeis | 423052 | fluorescence light source |
| Colibri 2 System | Carl Zeis | 423052 | |
| W Plan-Apochromat 20x/1,0 DIC | Carl Zeis | 421452 | water immersion objective |
| AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeis | 426509 | high resolution digital camera |
| Axio vision LE software | Carl Zeis | 410130 | use for offline analysis |
References
- Cetin, C. Protective effect of fucoidin (a neutrophil rolling inhibitor) on ischemia reperfusion injury: experimental study in rat epigastric island flaps. Ann. Plast. Surg. 47, 540-546 (2001).
- Granger, D. N. Role of xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am. J. Physiol. 255, H1269-H1275 (1988).
- Lazarus, B. The role of mast cells in ischaemia-reperfusion injury in murine skeletal muscle. J Pathol. 191, 443-448 (2000).
- van den Heuvel, M. G. Review: Ischaemia-reperfusion injury in flap surgery. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg. 62, 721-726 (2009).
- Rosen, S. D. Cell surface lectins in the immune system. Semin. Immunol. 5, 237-247 (1993).
- van der Flier, A., Sonnenberg, A. Function and interactions of integrins. Cell Tissue Res. 305, 285-298 (2001).
- Panes, J., Perry, M., Granger, D. N. Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Sutton, T. A. Injury of the renal microvascular endothelium alters barrier function after ischemia. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 285, 191-198 (2003).
- Serracino-Inglott, F. Differential nitric oxide synthase expression during hepatic ischemia-reperfusion. Am. J. Surg. 185, 589-595 (2003).
- Eppinger, M. J. Mediators of ischemia-reperfusion injury of rat lung. Am J Pathol. 150, 1773-1784 (1997).
- Dumont, E. A. Real-time imaging of apoptotic cell-membrane changes at the single-cell level in the beating murine heart. Nat Med. 7, 1352-1355 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Woeste, G. Octreotide attenuates impaired microcirculation in postischemic pancreatitis when administered before induction of ischemia. Transplantation. 86, 961-967 (2008).
- Schultz, J. E., Hsu, A. K., Gross, G. J. Morphine mimics the cardioprotective effect of ischemic preconditioning via a glibenclamide-sensitive mechanism in the rat heart. Circ. Res. 78, 1100-1104 (1996).
- Dobschuetz, E. von Dynamic intravital fluorescence microscopy--a novel method for the assessment of microvascular permeability in acute pancreatitis. Microvasc Res. 67, 55-63 (2004).
- Vutskits, L. Adverse effects of methylene blue on the central nervous system. Anesthesiology. 108, 684-692 (2008).
- Takasu, A. Improved survival time with combined early blood transfusion and fluid administration in uncontrolled hemorrhagic shock in rats. J. Trauma. 8, 312-316 (2010).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, 34-41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation. J. Vis. Exp. (52), e2874 (2011).
- Kanwar, S., Hickey, M. J., Kubes, P. Postischemic inflammation: a role for mast cells in intestine but not in skeletal muscle. Am. J. Physiol. 275, 212-218 (1998).
- Leoni, G. Inflamed phenotype of the mesenteric microcirculation of melanocortin type 3 receptor-null mice after ischemia-reperfusion. FASEB J. 22, 4228-4238 (2008).
- Simoncini, T. Interaction of oestrogen receptor with the regulatory subunit of phosphatidylinositol-3-OH kinase. Nature. 407, 538-541 (2000).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ. Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Mori, N. Ischemia-reperfusion induced microvascular responses in LDL-receptor -/- mice. Am. J. Physiol. 276, H1647-H1654 (1999).
- Eisenhardt, S. U. Monitoring Molecular Changes Induced by Ischemia/Reperfusion in Human Free Muscle Flap Tissue Samples. Ann. Plast. Surg. , (2011).
- Eisenhardt, S. U. Generation of activation-specific human anti-{alpha}M{beta}2 single-chain antibodies as potential diagnostic tools and therapeutic agents. Blood. 109, 3521-3528 (2007).
- Eisenhardt, S. U. Dissociation of pentameric to monomeric C-reactive protein on activated platelets localizes inflammation to atherosclerotic plaques. Circ Res. 105, 128-137 (2009).
- Eisenhardt, S. U. C-reactive protein: how conformational changes influence inflammatory properties. Cell Cycle. 8, 3885-3892 (2009).
- Granger, D. N. Physiology and pathophysiology of leukocyte adhesion. , Oxford University Press. New York. 520 (1995).
- Baatz, H. Kinetics of white blood cell staining by intravascular administration of rhodamine 6G. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 15, 85-91 (1995).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J. Immunol. Methods. 239, 109-119 (2000).
