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Engineering

水中での超分子ポリマーのサイズ、形状と安定性を制御する

doi: 10.3791/3975 Published: August 2, 2012

Summary

この実験の目的は、水中で自己組織ディスコ両親媒性物質のサイズ、形状と安定性を決定し、制御することである。水性ベースの超分子ポリマーの制御のようなレベルは非常に困難である。私たちは、反発と引力相互作用の両方を使用して戦略を適用します。このシステムを特徴づけるために適用された実験的な技術が広く適用されます。

Abstract

水性ベースの超分子ポリマーの場合は、形状、大きさと安定性を超える同時制御は、1は非常に困難です。同時に、そうする能力は、エレクトロニクス、バイオメディカル工学、センサーなどの機能ソフトマターのアプリケーションの数の観点から極めて重要である。一般的にテンプレート2,3、エンドキャッパー4または選択溶媒のテクニック5の使用に焦点を当てた超分子ポリマーの大きさや形状を制御するために、過去、成功した戦略である。

ここでは、順序付けられた、キラル円柱状の凝集体のスタックの長さと形状の制御につながる自己組織化円盤状両親媒性に基づいた戦略を開示している。親水性のリムと重合ビルディングブロックの疎水性コア内の魅力的な非共有結合力に静電的斥力相互作用のバランスを調整することにより、我々は小さいと離散球状のオブジェクト6,7を作成し管理します。 Increa電荷が球から棒の遷移を誘発スクリーニングするために塩濃度を歌います。興味深いことに、この遷移は温度依存性自己組織化機構の協同の増加で表現され、より安定した凝集体が得られる。

我々の研究のために我々は、疎水性、フッ素L-フェニルアラニンベースのスペーサー( スキーム1)を介して親水性の金属キレートに接続されているベンゼン-1,3,5 - tricarboxamide(BTA)コアを選択します。選択した金属キレートは複雑で、必ずしも2つの対イオンあたり2つの全体の残りの費用が含まれているのGd(III)-DTPA複合体である。集約の一次元成長がπ-πスタッキングと分子間水素結合によって指示される。ただし、特定のサイズに達するとのGd(III)-DTPA複雑なスタートはBTA-ベースのディスコの一次元成長を制限することで、電荷から生じ、静電反発力。ミリモル濃度で形成された凝集体は、SPHEがありrical形状と1 H-NMR分光法、小角X線散乱、及び極低温透過型電子顕微鏡(クライオTEM)から推定される約5 nmの直径。分子間の静電斥力相互作用の強さは、緩衝液の塩濃度を増加させることによって減らすことができます。この電荷のスクリーニングは、長さ> 25 nmの細長い棒に球状の凝集体からの移行を誘導する。クライオTEMは、形や大きさの変化を可視化することができます。また、CD分光法は、塩の添加前と後の自己組織化プロセスのメカニズムの詳細を導出することを許可します。静電相互作用をスクリーニングすることによって飛躍的に生産·超分子ポリマーの増加の物理的性質を規定する重要なことは、協同キー機能。水中で形成された超分子ポリマーの分子量の大幅な増加に協同の結果で、この増加した。

Protocol

スキーム1
スキームは、1。ビルディングブロックのミリモルの濃度で、約5 nmの直径を示す球状の凝集体にクエン酸緩衝液にBTAベースdiscoticsの自己集合。約3 nmと長さ> 25 nmの直径を持つ細長い棒の形成におけるNaClの結果を添加することによりイオン強度を増加させること。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

1。 NaClの濃度の関数としての温度依存CDスペクトルのCD分光法と測定のためのBTA-GD(III)DTPA溶液の調製

  1. 100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)を準備します。
  2. 2 M NaClで100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)を準備します。
  3. BTA-GD(III)の100mMクエン酸緩衝液、10mLのDTPA(MW = 3184グラム•モル-1)tの0.254 mgを溶解するarget濃度8•BTA-GD(III)DTPAの10 -3 mMの。
  4. 5分のためのソリューションを超音波処理してください。
  5. ソリューションを1センチメートルUVキュベットを記入し、230から350 nmのCDスペクトル及び363から最高強度のCDバンドのCDの冷却曲線(例えば、λ= 269 nm)の測定- 1 K minの速度で283 Kを- 1。
  6. MのNaClの半分の濃度にdiscoticsを希釈し、1MのNaClのイオン強度を増加させるために、BTA-GD(III)DTPAの緩衝溶液クエン酸を緩衝溶液2の同じボリューム、目標濃度4•10 -3を追加します。 BTA-GD(III)DTPAのMM。
  7. 5分間増加したイオン強度と渦ソリューションを提供します。
  8. 1 K min -1の速度で283 K - 230から350 nmおよび363から最高強度のCDバンドのCDの冷却曲線からCDスペクトルを再測定。

2。 T-依存するためにモデルにT-依存CDのデータを当てはめENTセルフアセンブリ

  1. raw CDデータはOrigin 8.5の正規化に輸出された。これが0に等しい、1に等しいとして最低測定温度でのCDの効果として最高測定温度でのCDの効果を定義することによって達成された。 CD効果の大きさは凝集8の度合いに比例するので、正規化されたCD-曲線は凝集の程度に比例します。
  2. 正規化されたデータは、ファンデSchoot 8,9により導出T-依存性の自己組織化モデルを使用してOriginPro 8.5の非線形カーブフィットオプションを使用して取り付けました。このモデルでは、核形成と伸長政権は区別されます。最初の伸長体制(T <T e)の凝集の程度は次の式を使用して、装着されました。

式(1)
上記の式(変数温度、T、およびAGGR度隣に含まれていますegation、Φn)の3パラメータ;伸長H E、伸長温度T E(自己組織化が始まる温度)とΦN土がないことを確認するために導入されたパラメータΦ すなわちエンタルピー凝集の程度は統一を超えることができない制約から、以下の団結を、超えてはなりません。

継手は、所定の濃度のために分子の自己集合を特徴付ける伸長H E(J / mol)と伸長温度T E(K)のエンタルピーをレンダリングします。取り付ける場合、1拘束は、式2.1は、伸長領域でのみ有効ですので、T E以下の温度で凝集の唯一の程度は、装着する必要があることである従うべきである。

次に、内凝集の実験的発見度核体制は以下の式を使用して、装着することができます。

式(2)
すなわち、伸長H E、伸長温度T eとパラメータΦのエンタルピーは、SAT、上記の式はすでに3は式2.1で決定された4つのパラメータ(T、Φnは変数の隣にある)が含まれています。唯一の未知のパラメータは、核形成相-T e以上の温度で凝集の実験的発見度をフィッティングすることにより検出されたの協同を価値の記述Kです。

3。極低温電子顕微鏡を介した超分子ポリマーの透過電子顕微鏡と可視化のためにBTA-GD(III)DTPA溶液を調製

  1. 100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)および100mMクエン酸緩衝液(pH6.0)W:2つのバッファを準備するi番目の5 M NaClを。
  2. 準備されたバッファの各0.1 mLのBTA-GD(III)DTPA(MW = 3184グラム•モル-1)の0.318ミリグラム、目標濃度BTA-GD(III)DTPAの1mMを溶解する。
  3. 低温TEM用のサンプルガラスは、自動化されたガラス化ロボット(FEI VitrobotマークIII)を用いて行われる。 CryoTEMグリッド(R2 / Quantifoilマイクロツール社から2 Quantifoilイエナグリッド)は、前の40秒を5 mAでCressington 208カーボンコーターの動作を使用してガラス化プロシージャへの表面処理をプラズマである。水溶液は、その後自動化されたFEI Vitrobot上にガラスの間にグリッドに適用されます。これは、液体エタンで非常に迅速にグリッドを浸漬することにより、グリッドおよびその後のガラス上に水溶液の薄膜を作成するために余分な液体のブロッティング、グリッド上のサンプルのアプリケーションが含まれます。ガラス化後、試料を液体窒素中で保持され、オートローダカセットを手動で転送され、またcoole液体窒素を持つD。カセットは、その後、TEMのオートローダに挿入されます。このすべては手動で行われます。
  4. cryoTEM実験はTU / eのcryoTITAN(FEI)、(上で実行されwww.cryotem.nl )。 TU / eのcryoTITANは300 kVでフィールドエミッション銃(FEG)の動作が装備されています。画像はポストカラムガタンエネルギーフィルタ(GIF)を搭載したの2k x 2kのガタンCCDカメラを用いて記録した。

(4)低イオン強度下では球面自己組織化BTA-GD(III)DTPAの1 H-DOSY NMR測定

  1. D 2 O( 'pHは6.0')の50 mMのD 6-コハク酸緩衝液を準備し、バッファは1 M ND 4 ODを使用してpHを6.0に調整し、続いてD 2 O における d 6-コハク酸を溶解して調製されたD 2 O 50mMのコハク酸の最終濃度は、追加のD 2 Oで調整した。
  2. のGd(III)が非常に常磁性であるため、1 H信号は、それによって大幅に拡大されると、Gdの(III)は、Y(III)に置換した。
  3. BTA-Y(III)DTPA(MW = 2979グラム•モル-1)の50 mM、1 mLのD 2 O( 'pH6.0の')、目標濃度 d 6-コハク酸緩衝液、1mMの2.98 mgを溶解BTA- Y(III)DTPA。
  4. 1 H-DOSY NMR測定は、バリアンから5 mmのID-PFGプローブを搭載したバリアンユニティイナバ500分光計で行われている。 DOSY実験はDOSYワンショット(Doneshot、バリアン)パルスシーケンスを用いて行った。 90度パルスUND混合時間はそれに応じて適応させた。 (トリメチルシリル)プロピオン酸-2、2,3,3 - -化学シフトは、3の化学シフトを用いて参照された[D 4]酸ナトリウム塩(TMSP)。
  5. HDOの自己拡散の測定値を校正するために使用されていましたそれは298 KでのD 2 OにおけるHDOの自己拡散は19.0×10-9 m 2であることが文献から知られている-1で 。基準として、D 2のHDOの自己拡散OはVARIAN 2 HzのD 2 O標準サンプルで測定され、その標準値に校正されています。凝集体の流体力学的半径R Hを計算するために使用されるモデルは、球状粒子の拡散のためのStokes-Einsteinの関係である。

5。代表的な結果

BTA-M(III)-DTPAにおける1 H-DOSY NMRおよび小角X線散乱測定:クエン酸緩衝液で球状のオブジェクト

周辺のGd(III)錯体のイオンの文字は、コア細長い棒状凝集体を重合するように設計されている円盤状のモノマーの一次元成長のフラストレーションを導入しています。魅力的な反発的相互作用のバランスはサイズと凝集体( スキーム2)の形状を制御します。

スキーム2
スキーム2。

大きさと溶液中の粒子の形状を決定するための強力な手法は、放射光小角X線散乱(SAXS)である。 BTA-GD(III)-DTPAは、クエン酸緩衝液に溶解し、SAXSプロファイルが記録され、地域0.01 <Q <0.1Å-1に装着された。低Qでゼロに近づく傾斜領域(Q <0.06Å-1)は、球状のオブジェクト( 図1)の存在を示唆し、集計の形状異方性の欠如を示しています。異なる濃度で測定したデータは、3.2 nmの計算された半径Rにつながる均一な単分散の球状のフォームファクタを使用して、装着しました。単量体のディスコティックBTA-GD(III)-DTPAの計算幾何学的半径は1に近いアスペクト比を持つ凝集体の存在を示唆している3.0 nmである。

図1
図1。0.5〜1.0 mMの(上側)にクエン酸緩衝液にBTA-GD(III)-DTPAのためにSAXSプロファイル(100mMのは、pH 6)。 BTA-YのDOSY NMR(III)-DTPAの50 mM 1.0 mMの(下)のd 6-コハク酸緩衝液。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください

自己組織化オブジェクトの球面形状とナノサイズのさらなる証拠を提供するために、我々は、1 Hを行った拡散順序付けられたNMR分光法(1 H-DOSY NMR)( 図1)。 DOSY-NMRは、流体力学的半径(R H)を計算することができ、そこから集合体の拡散係数の測定を可能にします。のGd(III)が非常に常磁性と1 Hの信号であるため、それによって大幅に拡大されるでしょう、我々は反磁性のY(III)のためのGd(III)を変更しました。重水素化コハク酸バッファー中で集約された磁性円盤状両親媒性物質の拡散係数(50mMの、pHが6、C = 1 mM)を0.69x10-10 M 2 S -1であると決定された。 Stokes-Einsteinの関係を通じて、我々は、球状のサイズの個別のオブジェクト( 表1)2.9 nmの流体力学的半径R Hを計算します 。このサイズは、BTA-GD(III)-DTPAのためにSAXSデータから得られた値とよく一致している。

BTA-M(III)-DTPA
[mm]の
D T
[10 -10 M 2 S -1]
R H
[nm]の
R bは
[nm]の
1 0.69 2.9 3.2

DOSYから、SAXS から b

BTA-M(III)-DTPAのためにSAXSとDOSY測定値の表1の結果。

BTA-GD(III)-DTPAでクライオ-TEM:球面のオブジェクトから細長いナノロッドへ

一次元スタックの長さ以上の成功した制御のためのさらなる証拠は、クライオTEM顕微鏡写真から得られた。水溶液のガラス化による低温TEMは、自己集合体の構造の形態を保持し、従来のTEM試料作製に関連する影響を与えます乾燥が回避されます。 図2(左)BTA-GD(III)-DTPAが期待される球形を生成することを示していますSAXSとDOSY測定から結果を確認する1 mMの濃度で6 nmに近い直径を持つオブジェクト。これらの知見によると、我々は樹状高分子の分子と同等の10と考えることができる自己離散オブジェクトを取得することができました。

図2
図2 BTA-GdのクライオTEM像(III)-DTPAクエン酸緩衝液で298 K(100 mMのは、pH 6)でガラス化(左)と1mMの、スケールバーは50nmを表しています。(右)1 298クエン酸緩衝液中のK(100 mMのは、pH 6)でガラス化mMと5 Mの全体的なNaCl濃度では、スケールバーは50nmを表しています。

これまでのところ我々は低イオン強度の緩衝溶液中で働いています。周辺の静電反発力がBTA-GD(III)-DTPAは、フラストレート一次元成長の原点であるにM(III)-DTPA錯体をご利用いただけただし、我々は期待している、バッファリングされた環境のイオン強度を増加させる高度に水和対不活性午前1時01分塩を使用して、静電相互作用を減らす必要があり、それゆえ自己さまざまなタイプのオブジェクトが形成されるべきである。 5 M NaClを含有するクエン酸緩衝液中に、この効果は確かに( 図2右 )が観察された。高アスペクト比の超分子ポリマー棒状の形成が明らかに高いイオン強度でのクライオ-TEM顕微鏡写真で観察されています。静電遮蔽は、この知見のために最も可能性の高い説明である。 SPHEからの形状の変更6 nmと数百メートルまでの長さの直径を有する細長い棒に、直径約6 nmのrical集計。

BTA-GD(III)-DTPAのCD測定:イオン強度を増加させることにより自己組織化協同組合のスイッチング

円偏光二色性(CD)分光法は、左利きと右円偏光の吸収の差を測定します。時ヘリカルオブジェクトは、優先ヘリカルセンスを持って左と右回り円偏光が故にCD-効果を生じさせ、別のエクステントに吸収されます。分子間水素結合が集合内の連続した​​BTA-GD(III)-DTPAとの間に形成されているので、らせん状に並んだとL-フェニルアラニン部分に立体中心は、他の上で1つヘリカルセンスを支持しており、我々は明確なCDを期待してBTA-GD(III)-DTPAベースの集計11,12からのスペクトル。さらに、温度​​依存のCD分光法は強力ですBTA-GD(III)-DTPA重合の自己組織化機構を評価し、形成される凝集体13の安定性に関する結論を導き出すことができるためのツール。

例として、BTA-Gdの室温でのCDスペクトル(III)-DTPAの増加塩濃度(1.0 M NaClを0〜M NaCl)で(100 mMクエン酸バッファー中で8×10 -3 mMまたは4×10 -3 mM)を与えられている図3Aインチ有意に低い濃度は、CD測定のために適用されますが、明確なコットン効果があってもマイクロモル濃度で、無傷の凝集体の存在を示しています。スタックとdiscoticsの良いパッキングの周縁部での減少相互作用のための良い指標である塩濃度を増大させる時にCDスペクトルの形状が変化する。さらに、同じソリューション(363から283 K、λ= 269または278 nmで測定)のCDの冷却曲線は、形状の明確な違い( 図3B)を示します 。 AP親T 電子アグリゲーションは、CD-効果でより急激な増加によって特徴付けより高い塩濃度、ますます協力機構で、より高い温度にシフトをを開始する温度は、明らかになります。 0 M NaClで冷却曲線が最もisodesmic自己組織化プロセスによって記述されているのに対し、1.0 M NaClで冷却曲線では、協力的な自己組織化プロセス14の典型的なものです。前者の場合には、すべての関連付けの定数は、後者の場合には自己組織化は、少なくとも2つの別個の段階で行われている間に等しいと見なされます。最初のステップでは、 "核"は精力的に非常に不利ですが形成する必要があります。重要な重合温度以下に冷却した後、高分子量の超分子ポリマーに伸長し、指数関数的成長は、次のとおりです。協力的なモデルを使用して、BTA-GDの自己組織化(III)-DTPA 0と1 M NaClの熱力学パラメータを定量化することは明らかにKの減少を明らかにする<サブ>無次元活性化定数は8です。 Kの値を低くクライオ-TEMで観察された非常に細長い超分子ポリマーの形成に表現される自己組織化プロセスにおける協同性の高度を示しています。

BTA-GD(III)-DTPA C NaClを K
8×10 -3 mMの 0 M 5 10 -2
4×10 -3 mMの 1 M -4 1 10

表2 Kで表さ協同度BTA-Gdの温度依存性の自己組織化(III)-DTPA NaCl濃度(C NaCl)の関数としてインチ

図3
図3。BTA-G100mMのクエン酸緩衝液のd(III)-DTPA(低イオン強度、高イオン強度で4×10 -3 mMのC = 8×10 -3 mM)のイオン強度の関数として293 Kで記録] CDスペクトルは、c のNaCl = 0 M - 1.0 M、モル楕円率のΔεは次のように計算されます。Δε= CD-効果/(CXL)ここで、cはモルL〜(-1)におけるBTAの濃度であり、lは cm単位の光路長です。 ; - 1.0 M、Φ1 M NaCl溶液の場合は0 M NaClおよび278 nmのλで測定したB]対応CDの冷却曲線は= 269 nmのNaClの濃度c のNaCl = 0 Mの関数としての凝集Φnの程度として表現さnは、最大のCD-効果によって測定され、CD-効果で割って計算されます。

Discussion

のGd(III)-DTPA錯体を含有するこの寄与で説明した自己組織化円盤状両親媒性物質は、チューナブル排泄時間で高コントラストを組み合わせて新たな磁気共鳴イメージング(MRI)剤として現在調査中です。したがって、15、各社の詳細については、自己さまざまな条件での動作とその安定性を組み立てることは極めて重要である。分光の組み合わせ(CDおよびNMR)、散乱(SAXS)と顕微鏡(クライオTEM)技術が形成される構造の可視化とその熱力学的パラメータの定量化を可能にします。研究システムの優先的なヘリカルセンスは左と右回り円偏光の吸収の差を可能にするような技術の組み合わせは限り自己組織化分子の一般的に適用可能である。

Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

作者は感謝してDOSY-NMRの支援についてはマルコNieuwenhuizenを認める。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BTA-Gd(III)-DTPA Made in-house
BTA-Y(III)-DTPA Made in-house
CD spectroscopy Jasco Jasco J-815 spectropolarimeter
NMR Varian Varian Unity Inova 500 spectrometer 5-mm ID-PFG probe of Varian
cryo-TEM FEI cryoTITAN TEM
SAXS Dutch-Belgian beamline (BM26B) at the European Synchotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble, France

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References

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水中での超分子ポリマーのサイズ、形状と安定性を制御する
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Besenius, P., de Feijter, I., Sommerdijk, N. A. J. M., Bomans, P. H. H., Palmans, A. R. A. Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water. J. Vis. Exp. (66), e3975, doi:10.3791/3975 (2012).More

Besenius, P., de Feijter, I., Sommerdijk, N. A. J. M., Bomans, P. H. H., Palmans, A. R. A. Controlling the Size, Shape and Stability of Supramolecular Polymers in Water. J. Vis. Exp. (66), e3975, doi:10.3791/3975 (2012).

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