Mikrofluidenheder Blandere til at studere proteinfoldning

Summary

I dette arbejde har vi forklare fremstilling og anvendelse af en mikrofluid blander stand til at blande to opløsninger i ~ 8 mikrosekunder. Vi viser også anvendelsen af ​​disse blandere med spektroskopisk detektion med UV-fluorescens og fluorescensresonansenergioverførsel (FRET).

Abstract

Den proces, hvorved et protein folder i sin native konformation er yderst relevant for biologi og menneskers sundhed alligevel dårligt forstået. En årsag til dette er, at foldning finder sted over et bredt område af tidsmæssige fra nanosekunder til sekunder eller længere, afhængig af protein ^1. Konventionelle stopped-flow-mixere har tilladt måling af sammenklappelige kinetik starter ved omkring 1 ms. Vi har for nylig udviklet en mikrofluid mixer, der udvander denatureringsmiddel ~ 100-fold i ~ 8 mikrosekunder ^2. I modsætning til en stopped-flow-blander, fungerer denne mixer i laminar strømning, hvor turbulens ikke forekommer. Fraværet af turbulens giver præcis numerisk simulering af alle strømme i mixeren med glimrende aftale at eksperimentere ^3-4.

Laminar strømning opnås for Reynolds tal Re ≤ 100. For vandige opløsninger, kræver denne micron skala geometrier. Vi anvender et hårdt underlag, såsom silicium eller kondenseret silica, at kanalerne 5-10 um bred og 10 um dyb (se figur 1). De mindste dimensioner, ved indgangen til blandezonen, er i størrelsesordenen 1 um i størrelse. Chippen er forseglet med en tynd glas eller kvartsglas dækglas til optisk adgang. Typiske totale lineære strømningshastigheder er ~ 1 m / s, hvilket gav Re ~ 10, men proteinet, er kun ~ 0,5 nl / s eller 1,8 uL / time. Proteinkoncentrationen afhænger af detekteringsfremgangsmåden: For tryptofan fluorescens den typiske koncentration er 100 uM (for en Trp / protein) og FRET den typiske koncentration ~ 100 nM.

Foldeprocessen er indledt ved hurtig fortynding af denatureringsmiddel fra 6 M til 0,06 M guanidinhydrochlorid. Proteinet i høj denatureringsmiddel strømmer ned en central kanal og dækkes på begge sider ved blandezonen ved puffer uden denaturerende bevæge ~ 100 gange hurtigere (se figur 2). Denne geometri forårsager hurtig konstriktion af proteinet strømning ind i en smaljet ~ 100 nm bredt. Diffusion af lys denatureringsmiddel molekyler er meget hurtig, mens diffusion af de tunge proteinmolekyler er meget langsommere, spredende mindre end 1 um i 1 ms. Forskellen i diffusionskonstanten af ​​denatureringsmiddel og protein resulterer i hurtig fortynding af denatureringsmidlet fra proteinet strøm, hvorved den effektive koncentration af denaturant omkring proteinet. Proteinet jet strømmer ved en konstant hastighed ned observation kanal og fluorescens af proteinet under foldning, kan observeres ved hjælp af en konfokalt mikroskop ^5.

Protocol

1. Fabrikation af Mikrofluidenheder Mixing Chips

Figur 3 viser de grundlæggende fabrikationstrin.

1. Rens 4 inch (100 mm) sammensmeltet silica vafler med frisk Piranha-opløsning (3:1 H ₂ SO _4: H2O _2): i) opvarmes svovlsyre til 130 ° C, derefter hældes i peroxid. Bemærk, at overfladeruheden og planhed af kvartsglas waferne anvendes spille en vigtig rolle for den endelige binding trin. ii) neddykkes waferne i mindst 30 minutter. iii) Skyl i 5 minutter med vand og tør. Anvende en polysilicium (poly) belægning, ~ 1 um tyk pr hver bestemt 10 um dybde af de endelige mikrofluidkanaler, under anvendelse af et lavt tryk kemisk dampafsætning (LPCVD) ovn.
2. Rengør vafler og maske ved hjælp af Piranha-protokollen i trin 1,1. Rengør masken på samme måde, og derefter skylles med acetone, methanol og isopropanol og blæs tør med det samme. Dehydrere skiverne på en varm plade ved 150 ° C i ~ 10 minutter anvende en aluminiumfolie telt at holde partikler væk) eller i en 120 ° C ovn i mindst 120 minutter (natten fortrinsvis). For at øge fotoresistbelagte vedhæftning, straks udsætte de varme vafler til HMDS damp i 5 minutter. Spin overtrække oblater med en ~ 900 nm tykt lag af AZ5214 fotoresist og bløde bages ved 90 ° C direkte på en varmeplade i 1 minut eller i en ovn ved 110 ° C i 30 minutter (fig. 3, trin 1).
3. Juster masken og gøre en hård og vakuum kontakt. Udsættes for UV-lys i flere sekunder (total energi: ~ 103 mJ / cm ²⁾ (fig. 3, trin 2). Udvikle med AZ400K udvikler, fortyndet 4:1 med DI vand ~ 50 sekunder (indtil photoresist er fuldt udviklet), mens forsigtig omrøring. Skylles med vand i 2 minutter. Undersøg funktioner med mikroskop (Figur 3, trin 3). Hvis funktioner dårligt er løst, strippe fotoresisten og starte igen fra 1,2. Hårde bake 115 ° C direkte på en varmeplade til 2minut.
4. Descum vafler med Asher _eller O2 plasma i 2,5 minutter ved 100 W rf-energien. Ved hjælp af en dyb reaktiv ion etcher (Drie), ætse polysiliciumlag hele vejen igennem til smeltet silica nedenfor. Strippe den resterende fotoresist med PRS2000 modstå stripper ved 75 ° C i 10 minutter. Skyl og tør. Mål etch dybde for at sikre, det er hele vejen igennem poly belægningen (figur 3, trin 4).
5. Ved hjælp af en oxid kan Drie såsom en ULVAC NLD-6000 etcher, etch smeltet silica med en dybde på ~ 10 um pr mikron tykkelse poly overtræk (fig. 3, trin 5). Dette poly overtræk vil blive slidt væk under ætsning, og det kan være nødvendigt at kontrollere integriteten af ​​belægningen periodisk under ætsningsprocessen. Hvis forsætligt konturløse regioner wafer overfladen er blevet strippet for de beskyttende poly coatingen under ætsning, er overfladen sandsynligvis blive sat op og ikke længere vil være egnet til bindingi de sidste trin af produktionen. I dette tilfælde skiven er mest sandsynligt ikke længere levedygtige. Rengør med Matrix Asher i 4 minutter, 100 W RF power. Afisoler polysilicium med en XeF ₂ etcher (Figur 3, trin 6). Kan det være nødvendigt at gentage trin 1.4 og dette trin et par gange for at fjerne alle fotoresisten og poly overtræk.
6. Spinde overtrække vafler med en ny ~ 1 um lag af fotoresist til at beskytte de kanaler under den efterfølgende håndtering. Bore indgangs-og udgangshuller i hver chip under anvendelse af en computerstyret diamantslibesten bore eller manuelt med en sandblæser (fig. 3, trin 7). Hvis du bruger en boremaskine, montere wafer (feature-side nedad) på en opofrende glasplade med Aqua Bond 55, idet man holde Bonder fri for bobler. Køl boremaskinen med micro-90 rengøringsmiddel. Dette holder små stykker af glas i at klæbe til de kanaler, som derefter tilstoppe chippen under brug.
7. Skylle pladen med DI-vand ved hjælp af en sprøjte til injektion water i hvert hul. Soak i sæbevand i en time. Fjerne fotoresist og Aqua binding med PRS 2000 ved 60 ° C i flere timer, indtil overfladen er rent. Skyl wafer med DI vand og varmt sæbevand. Skylles hvert hul igen med en sprøjte, undgår ætsede funktioner. Tørt wafer med nitrogen, og i en vakuumovn indstillet til 120 ° C. Efterse huller til at sikre, at de er fri for sand og gentag rengøring trin som nødvendigt. Måle dybden af kanalerne med enten en optisk eller mekanisk overflade profiler (fig. 3, trin 8).
8. Rene wafers og et tilsvarende antal på 170 um tykke sammensmeltet silica dækglasset med 1) Piranha-opløsning (1-2 timer i overensstemmelse med fremgangsmåden i 1,1), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: _H2O 0 ₂ )-opløsning i 10 minutter ved 75 ° C, 3) RCA en opløsning (05:01:01 DI: _{NH4OH: H2O} 0 ₂₎ i 22 minutter ved 75C). Skylning med deioniseret vand i 5 minutter mellem hver opløsning.
9. Placere en wafer træk opad ovenen stabel af 3-4 renrum servietter placeret på toppen af ​​en hård flad overflade, såsom en lille glasrude. Tørres wafer grundigt med nitrogengas i mindst 5 minutter. Gentag med låg glas. Saml dækglas ved kanten og vend således at den polerede side er nedad holdes over skiven og justere flade kanter. Forsigtigt slippe dækglas på wafer, og gør det muligt at bosætte sig. Skubbe vandret kun at justere justering. Tryk ned med en finger på midten af ​​skiven. Man skal se en glaslodning begynde at stråle. Om nødvendigt anvendes yderligere tryk på andre positioner omkring skiven til at fremme bindingen forreste (fig. 3, trin 9).
10. Anbring de forseglede vafler i en høj temperatur ovn indstillet til rampe fra stuetemperatur til 800 ° C i løbet af 3 timer, derefter fra 800 til 1100 ° C i løbet af yderligere 1,2 timer. Fastholdelse ved 1100 ° C i 2 timer og derefter rampe ned til stuetemperatur i løbet af yderligere 1,5 timer.
11. Terninger med en wafer terningopskæringen så ind individual chips (fig. 3, trin 10).
12. Protokollen beskriver fremstillingen af ​​kanaler i forholdsvis usædvanlige kvartsglas substrat, der er nødvendig for UV-detektion. Men denne protokol kan også tilpasses til et siliciumsubstrat, som kun kræver en ætsetrin ^2. Et glas (men ikke fusioneret silica) dækglas kan bindes til pladen ved hjælp af anodisk binding.

2. Montering og Loading Chips

1. Manifolden til at holde blandingen chippen og opløsninger kan være fremstillet af plast, såsom Lexan eller plexiglas eller aluminium til temperaturstyring (se figur 4). Hvis der anvendes aluminium, skal opløsningen reservoirerne belægges med parylen til at forhindre opløsning af aluminium ved de saltopløsninger i reservoirerne. Temperaturen af ​​hele manifolden, opløsninger og chip kan styres med termoelektriske indretninger monteret på siderne og en elektronisk styreenhed.
2. Chippen er parret til Manifold ved små O-ringene og et holdes på plads med en holdering, der tillader en klar optisk afbildning af midten af ​​chippen. De O-ringsriller være fladere end standard for at sikre god parring uden at for meget tryk på chippen, bør dvs en 002 o-ring være 0,025 "dyb. Når chippen er monteret, tilsættes løsninger på de midterste og sidevægge reservoirer , idet man frigive eventuelle bobler fanget i bunden af ​​brøndene.
3. Fordi de mængder, der anvendes i denne mixer er så små, kan strømmen styres med lufttryk påføres over opløsningen brøndene. Figur 4 viser trykket manifolden parret til toppen af chippen manifolden ved O-ringe. Trykket manifold er sluttet til computer-kontrollerede tryktransducere, der kan opretholde presset fra ~ 2-80 PSI. Chippen er udformet således, at lige store tryk på den midterste og sidekanaler frembringe en ~ 100-gange større i de lineære strømningshastigheder. Ved 20 psi, er den lineære strømningshastighed i udgangskanalen ~ 1 m/ Sek.
4. Placer manifolden på et omvendt mikroskop og undersøger blande region med okular eller kamera output. En glødelampe lommelygten anbragt oven på manifolden vil tilvejebringe tilstrækkelig lys. Anvendes et farvestof eller højt brydningsindeks opløsning (dvs. 6 M guanidin-hydrochlorid) i den midterste kanal at se på strålen.
5. På samme tryk på den midterste og side-kanaler, vil strålen være svært at se med det blotte øje, så starte med siden kanalen tryk på 0 PSI og langsomt stige til samme tryk. Hvis en sidekanal er tilstoppet, vil strålen blive skubbet mod en af ​​væggene i udgangskanalen. Hvis en synlig tilstopning forekommer, kan det være frigjort ved at påføre tryk eller vakuum til udgangskanalen med en sprøjte.
6. Hvis proteinet eller et andet organisk materiale tilstopper chip, kan det renses ved iblødsætning i Pirhana opløsning natten over.

3. Dataindsamling

Figur 5 viser det grundlæggende optiske instrument layout.

1. Bring en kollimeret laserstråle i en forsknings-kvalitet mikroskop ved hjælp af et dikroisk spejl enten inden eller lige uden mikroskop. Bringe laseren, således at der kan fokuseres ses i okular eller kameraet noget nær blandeområde.
2. Fluorescens fra proteinet i blanderen opsamles ved målet og sendes gennem det dichroiske spejl, fokuseres af en linse til et lille hul, og afbildes på en fotontæller. Scanne chip under anvendelse af en piezoelektrisk scanner i x og y for at billedet blandeområdet (typisk trinstørrelse på 2 um). Vælg en position på jet og scan i x og z til at finde fokus i midten af ​​kanalen lodret. Skarphedsdybde af mikroskopet er meget mindre end kanaldybde og strømningshastigheden er ensartet i kanalen bortset inden for 1 um væggene. Derfor den tidsmæssige opløsning af den observerede fluorescens bestemmes primært af størrelsen af ​​det konfokale stedet.
3. Scanne vandret i udgangskanalen (typisk trin size er 0,2 um i over strålen, 2 um langs strålen) i 100 um trin langs strålen og observere ~ 1 ms pr position (se figur 6). Flyt mikroskopbordet med 80-90 um langs jet til at fange senere tider.
4. Alternativt kan let påvises ved en spektrograf, og CCD efter det frekvensfølsomme spejl med en linse til at fokusere lyset på indgangsslidsen. Eftersom indsamling er langsommere end for fotontæller (1 sekund pr position), typisk strålen afbildes først med fotontæller og punkter langs strålens måles med spektrografen (se figur 7).
5. Data fra fotontæller analyseres ved at summere 3-5 pixels omkring strålen ved hver position til at skabe et plot af intensitet vs afstand. Regnes fra afstand ved hjælp af en beregnet hastighed baseret på de anvendte tryk (se figur 8).
6. Data fra spektrografen kan analyseres et par måder. For FRET, ChanneLS er udpeget som "donor" og "acceptor" kan hver summeres og nærhed forholdet E = I _A / (I _D + I _D) beregnes (se figur 9). Alternativt kan en enkelt værdi nedbrydning udføres for at undersøge uafhængige spektrale komponenter vs tid, såsom ændring i tryptophan emissionsspektret som et protein folder.
7. Afstanden i udgangskanalen kan omdannes til tid ved hjælp af en konstant strømningshastighed bestemmes ud fra det påførte tryk til sidekanalerne. Inden for de første 2 um af udgangskanalen, accelererer strømningshastigheden af proteinet strålen ~ 100x og tiderne i denne region skal beregnes finite element-analyse af strømliner (fremstilling af gange afbildet i figur 8). Denne acceleration giver en forskydning på ~ 1-2 mikrosekunder efter hastigheden bliver konstant, og kan normalt ignoreres i måling kinetik meget langsommere end blanding.

4. Repræsentative resultater

Figur 6 viser et konturplot i intensitet i blandeområdet målt ved fotontæller. Baggrunden i udgangskanalen ydersiden af ​​strålen bør være tæt på støjbunden af ​​detektoren og er typisk ikke fratrukket. En højere baggrund kan indikerer dårlig justering eller proteinet klæbe til væggene af kanalen. En stråle, der ser bøjet eller krum, især nær blandeområde, indikerer en dårlig ætsning af dyserne.

Figur 7 viser tidsopløst spektre fra proteinet acyl-coenzym A-bindende protein (ACBP) mærket med Alexa 488 og Alexa 647. Disse data er baggrunden fratrukket at fjerne den mørke ladning og laser signal. Baggrunden signal blev taget med den midterste kanal trykket sat til 0 PSI.

Blandetiden kan måles ved at måle en hurtig reaktion, som er meget hurtigere end blanding, såsom Trp fluorescensundertrykkelse by KI eller kollaps af enkeltstrenget DNA, mærket med FRET farvestoffer, ved tilsætning af NaCI. Da strålen er mindre end den optiske opløsning af mikroskopet er der en stor intensitet fald i blandeområdet som jet former. Dette instrument reaktion kan fjernes ved at foretage en kontrolmåling hvor ingen opløsning ændrede betingelser. Figur 8 viser forholdet mellem blanding (i 400 mM KI) og ikke-blandingsforsøg af N-acetyl tryptophan amid fluorescens. Linien viser den forventede koncentration af KI fra COMSOL simuleringer. Blandetiden, målt som tiden for koncentrationen falde 80%, er 8 mikrosekunder.

Da data er indsamlet i 100 gm intervaller langs 500 um lange exit kanal, skal data indsættes sammen fra flere visninger. Der er lejlighedsvis små forskydninger i signal mellem disse visninger, sandsynligvis på grund af små ændringer i fokus som chippen bevæges af mikroskopbordet. Ved at bevæge det trin 80 eller 90um-per-view, kan disse forskydninger elimineres ved at undersøge overlappende data. Typisk data indsamles med mindst to strømningshastigheder og dataene er kombineret for at bekræfte de signalændringer skyldes reelle spektroskopiske ændringer i proteinet i stedet for optiske eller strømning virkninger. Figur 9 viser FRET ændringer i proteinet ACBP efter fortynding af denatureringsmiddel fra 6 M til 0,06 M. Disse data har ikke brug for en kontrol eksperiment, da FRET er allerede et forhold, og instrumentet reaktion er allerede fjernet. Den hurtige spring i nærheden af ​​T = 0 repræsenterer en hurtig ændring i FRET signal inden for den blanding tid.

Figur 1. Indretning af blandeområde målt ved elektronmikroskopi.

Figur 2. Skematisk af hydrodynamisk blanding for at studere proteinfoldning. Proteinet,opløst i høj denatureringsmiddel at udfolde det strømmer ned i midten kanalen mod blandeområdet, hvor den møder puffer strømmer ~ 100 gange hurtigere. Laminar strømning tvinger proteinet strøm til en smal stråle, som denatureringsmiddel molekyler hurtigt kan diffundere. Som strålen strømmer ned udgangskanalen, kan proteinet iagttages med høj rumlig og tidsmæssig opløsning med et konfokalt mikroskop.

Figur 3. Sintret silica fabrikation. 1) Fremgangsmåden starter med en højpoleret 500 um tykt kvartsglas substrat (a) med et lag af polysilicium (poly) aflejret på de øverste og nederste overflader (b) og spin-overtrækkes med et lag af fotoresist (c). 2) En fotomaske (e) bringes int o hård kontakt med skiven, og fotoresist'en udsættes for UV-lys (d). 3) wafer er anbragt i en fremkalder bad og mønstret vist i fotoresisten. 4) wafer er anbragt i en Drie og de funktioner, der er ætset ind i toppen poly coating. Fotoresisten fjernes derefter. 5) poly derefter fungerer som en maske, når skiven er anbragt i en oxid etcher og de funktioner, der ætses fra 10 til 40 um i smeltet silica substratet. 6) poly belægning fjernes derefter i en XeF ₂ etcher. 7) wafer er bundet til en offer glasplade med en varmeaktiveret tætningsmiddel (g), træk nedad, og en diamant borehoved (f) abrasively borer gennem huller fra bagsiden. 8) En overflade profiler (h) og derefter direkte måler de ætsede funktionen dybder. 9) en 170 um tyk kvartsglas dækglas waferen er direkte bundet på den øvre overflade af skiven. 10) waferen skæres i individuelle mikrofluid chips.

3976/3976fig4.jpg "/>
Figur 4. Blanderen manifold. Mikrofluid-chip er fastgjort til opløsningen manifold med en maskinbearbejdet aluminium faceplate og fire O-ringene under ~ 200 ul reservoirer. En stor hul bliver bearbejdet gennem midten af ​​manifolden direkte over blandezonen af ​​anbringes microfluidic-chip, så overskydende UV-lys for at undslippe uden tilbagespredning, inhibere enhver autofluorescens fra manifolden selv og muliggør direkte belysning af chippen øjemål eller kamera for justering. De luftforgreningen forsegler hver af beholderne, således at lufttrykket i hvert kan styres via en ydre tryk styreboks.

Figur 5. Skematisk af optisk konfokalt mikroskop.

Figur 6. Konturplot af tryptophanfluorescens i mikrofluid blanderen. Blandeområdet er placeret ved ~ 90 um på y-aksen.

Figur 7. Tidsafhængig fluorescerende spektre indsamles i blanderen. De grønne og røde rektangler viser bølgelængder betegnet som donor-og acceptor-kanaler, henholdsvis.

Figur 8. Blandes tid målt ved fluorescens quenching af tryptophan af kaliumiodid (point og højre akse) og beregnes ved finite element-analyse (linie og venstre akse).

Figur 9. FRET ændringer måles under foldningen af proteinet ACBP. Den hurtige stigning i nærheden t = 0 repræsenterer en burst fase inden blanding tid og langsommere stigning betegner en gradvis ophobningtion af struktur som protein folder. Dataene blev taget to forskellige strømningshastigheder og overlejret, hvilket fører til forskellige tætheder af målinger på forskellige tidspunkter.

Discussion

Hurtig blanding har været en udvikling mål for området proteinfoldning i mange år, fordi det har længe været erkendt, at molekylære processer biomolekyler forekommer i tidsskalaer området fra picosekunder til sekund. Konventionelle stopped-flow blandere har dødtider på 1-5 ms, hvilket er primært begrænset af turbulens. Urolige kontinuerlig flow armaturer med at blande tider med 30-300 mikrosekunder er blevet udviklet over de sidste 15 år af et lille antal grupper, men generelt kræver høje strømningshastigheder for at opnå disse blanding gange og dermed bruge en masse prøve ^6-8.

Denne protokol beskrives anvendelsen af ​​mikrofluide blanding chips at opnå hurtig fortynding i laminar strømning. Der er flere fordele ved at arbejde inden for dette regime, men et primært er evnen til at simulere hele blandingsprocessen med høj præcision som gør det muligt at modificere blandingen respons. T-blandere er udviklet af andre grupper med simpel geometrietries har vist blandetider på 100-200 mikrosekunder, der primært er begrænset af størrelsen af kanalerne ^9-10. Ved at skalere størrelsen af kanalerne 10 um Knight reducerede blanding tid til ~ 10 mikrosekunder ^11. Yao og Bakajin viste, at små ændringer i geometrien kan føre til betydelige forbedringer i blandetiden ^4. Imidlertid, at arbejde viste, at acceleration blanding kan også føre til langsommere faser så godt. Designet anvendes i dette arbejde ^12-13 er et kompromis mellem de to bedste design i reference ⁴ for at minimere den langsommere eksponentielle henfald i denatureringsmiddel koncentration og også at gøre funktionen mere reproducerbar i Drie ætsning.

Der har været nogle kontroverser i forbindelse med ultrarapid blande over definition af blanding tiden. Det er vigtigt at erkende forskellen mellem "blande tid" og "død tid". Dødtiden er defineret i en turbulent blander som den tid i hvilken en measurement ikke kan foretages, og i virkeligheden kan være betydeligt længere end den faktiske blandingstiden. Det bestemmes typisk ved at foretage flere målinger af en pseudo-første ordens bimolekylære reaktion (såsom quenching af tryptofan fluorescens af N bromosuccinate) ved forskellige koncentrationer. De observerede eksponentielle henfald er monteret til at konvergere til en enkelt værdi antages at være t = 0 s og tiden mellem dette punkt og det første målte punkt er dødtiden. For laminare strømningsbetingelser blandere, kan målinger foretages under blandeprocessen, så der er ingen dødtid, kun en blandetid. Blandetiden er simpelthen den tid til at kombinere to opløsninger indtil tilstrækkelig ensartethed er opnået. Vi har tidligere defineret blandetiden er en 90/10, tiden for koncentrationen af ​​denaturant at falde fra 90% til 10% af ublandet værdi. Imidlertid er formen af ​​blandingen kurven ikke er helt symmetrisk med halen af ​​henfald, der har en lille eksponentiel komponent. Endvidere proteinfoldning har enstærkt ikke-lineær afhængighed denatureringsmiddel koncentration, således at foldningen ofte kan begynde selvom denatureringsmidlet reduceres kun med to gange. Derfor har vi for nylig defineret blanding som den tid, reducere denatureringsmidlet koncentrationen med 80%. Bestemt andre definitioner kan anvendes afhængigt af kravene til eksperimentet.

Anvendelsen af ​​denne mixer til at studere proteinfoldning faste afslørede overraskende resultater. Foldning af cytochrom c og apomyoglobin har længe været undersøgt for at have flere folde trin og tidlige resultater med kontinuerlige flow mixere viste kollaps til at foregå på ~ 100 mikrosekunder tidshorisont ^10,14-15. Vores mål med denne mixer viste, at der er mindst 2 trin på dette tidsrum, en meget hurtig, vil ikke-specifik, kollaps (som målt ved Trp fluorescens spektral forskydning) inden blanding tid blanderen efterfulgt af en langsommere fase (som målt ved bratkøling af total Trp emission), som er sandsynligvis fFØRSTE dannelse af native struktur ^5. Vi har også observeret en 50 mikrosekunder proces i B1-domænet af protein L, vælter den konventionelle fortolkning, at dette protein er en 2-tilstand folder ^13.

En fordel ved denne hurtige mixer er, at det kan sonden foldningen af ​​de hurtigste folde proteiner, der normalt kun blevet målelig ved nanosekund T-spring instrumenter. T-spring kræver typisk observeres foldning / udfoldning relaksation nær smeltetemperaturen af ​​proteinet og derfor aldrig følger foldningen af ​​hele befolkningen. Med denne mixer har vi set på foldningen af γ-repressor (λ ^6-86) med både Trp samlede emission og spektrale skift, og har fundet bevis for, at protein har ingen hindring for at folde under stærkt folde forhold, der ikke var adgang til tidligere T -springe målinger ^12. Endelig har vi målt foldningen af ​​villin hovedstykke HP-35, et tHan hurtigste mapper dog målt og fundet at foldningen hastigheden måles efter blanding ~ 5 gange langsommere end målt ved T-spring under de samme betingelser ^16. Dette antyder, at foldning kinetik afhænger startbetingelser, væltning en væsentlig forudsætning for området.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AZ P4110 Photoresist	AZ Electronic Materials
AZ 400 K Developer	AZ Electronic Materials
Baker PRS 2000 photoresist stripper	Avantor Performance Materials
AquaBond	AquaBond Technologies	AquaBond 55
500 μm cover wafer	SENSOR Prep Services		: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides
170 μm cover wafer	SENSOR Prep Services	7980 2G Wafers	: 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides
Deep reactive ion etcher for oxides	ULVAC	ULVAC NL-6000
Argon Ion Laser	Cambridge Laser Laboratories	Lexel 95-SHG	λ=258 nm
Argon Ion Laser	Melles Griot		λ=488 nm
Microscope	Olympus Corporation	IX-51
Microscope Objective	Thorlabs Inc.	OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA	λ= 258 nm
Microscope Objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW 1.2 NA	λ=488 nm
Nanopositioner	Mad City Labs	Nano-LP100
Motorized Translation Stage	Semprex Corp	KL-Series 12-6436
GaAsP Photon Counter	Hamamatsu Corp.	H7421-40
Monochrometer	Horiba Instruments Inc	MicroHR
CCD camera	Andor	iDus 420A-BU
Guanidine hydrochloride (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505