Summary
Dans ce travail nous expliquer la fabrication et l'utilisation d'un mélangeur microfluidique capable de mélanger deux solutions dans ~ 8 ms. Nous démontrons également l'utilisation de ces mélangeurs avec détection spectroscopique utilisant la fluorescence UV et de fluorescence de transfert d'énergie par résonance (FRET).
Abstract
Le processus par lequel une protéine se replie dans sa conformation native est très pertinente pour la biologie et la santé humaine mais encore mal compris. Une raison à cela est que le pliage a lieu sur une large gamme d'échelles temporelles, de la nanoseconde à quelques secondes ou plus, en fonction de la protéine 1. Classiques stopped-flow mélangeurs ont permis de mesurer la cinétique de pliage à partir d'environ 1 ms. Nous avons récemment développé un mélangeur microfluidique qui dilue dénaturant ~ 100 fois dans ~ 8 ms 2. La différence d'un mélangeur de flux arrêté, ce mélangeur fonctionne dans le régime d'écoulement laminaire dans lequel la turbulence ne se produit pas. L'absence de turbulence permet la simulation numérique précise de tous les flux au sein de la table de mixage avec un excellent accord pour expérimenter 3-4.
À flux laminaire est atteint pour des nombres de Reynolds Re ≤ 100. Pour les solutions aqueuses, ce qui nécessite des géométries échelle du micron. Nous utilisons un substrat dur, tel que le silicium ou fusionnés siliconeca, pour faire um canaux 5-10 de large et 10 um de profondeur (voir figure 1). Les plus petites dimensions, à l'entrée de la zone de mélange, sont de l'ordre de 1 pm à la taille. La puce est scellé avec une lamelle de verre mince ou en silice fondue pour l'accès optique. Typiques au total des débits linéaires sont ~ 1 m / s, Re cédant ~ 10, mais la consommation de protéines est seulement ~ 0,5 nL / s ou 1,8 pi / h. La concentration en protéines dépend de la méthode de détection: Pour fluorescence du tryptophane la concentration typique est de 100 um (pour 1 Trp / protéine) et pour FRET de la concentration typique est de ~ 100 nM.
Le processus de pliage est initiée par dilution rapide de dénaturant de 6 M à 0,06 M de chlorhydrate de guanidine. La protéine en dénaturant haute coule un canal central et est remplie de chaque côté à la zone de mélange par le tampon, sans dénaturant le déplacement ~ 100 fois plus rapide (voir Figure 2). Cette géométrie provoque la constriction rapide de l'écoulement des protéines dans une étroitejet ~ 100 nm de large. Diffusion des molécules légères dénaturant est très rapide, tandis que la diffusion des molécules de protéines lourds est beaucoup plus lente, la diffusion inférieure à 1 um à 1 ms. La différence de constante de diffusion de l'agent de dénaturation des protéines et des résultats de dilution rapide de l'agent de dénaturation des protéines à partir du flux, la réduction de la concentration efficace de l'agent de dénaturation autour de la protéine. Le jet protéine s'écoule à une vitesse constante dans le canal d'observation et de la fluorescence de la protéine pendant le pliage peut être observé à l'aide d'un microscope à balayage confocal 5.
Protocol
1. Fabrication de Chips de mélange microfluidique
La figure 3 montre les étapes de fabrication de base.
- Nettoyez 4 pouces (100 mm) des plaquettes de silice fondue avec une solution Piranha frais (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) la chaleur de l'acide sulfurique à 130 ° C, puis versez dans le peroxyde. Notez que la rugosité de surface et la planéité des plaquettes de silice fondue utilisé jouent un rôle important pour l'étape de collage final. ii) immerger les plaquettes pendant au moins 30 minutes. iii) Rincer pendant 5 minutes avec de l'eau et à sec. Appliquer une polysilicium (poly) revêtement, ~ 1 um d'épaisseur par tous les profondeur de 10 um destiné des canaux microfluidiques, finales en utilisant un produit chimique à basse pression dépôt en phase vapeur (LPCVD) du four.
- Nettoyer les plaquettes et le masque en utilisant le protocole Piranha à l'étape 1.1. Nettoyez le masque de la même manière, puis rincer avec de l'acétone, le méthanol et l'isopropanol et sécher immédiatement. Déshydrater les plaquettes sur une plaque chauffante à 150 ° C pendant environ 10 minutes (utilisez une feuille d'aluminium tente de garder les particules loin) ou dans un four à 120 ° C pendant au moins 120 minutes (une nuit de préférence). Pour augmenter l'adhérence de résine photosensible, immédiatement exposer les plaquettes chaudes à la vapeur d'HMDS pendant 5 minutes. Spin manteaux des plaquettes avec une couche ~ nm d'épaisseur de 900 AZ5214 résine photosensible et cuire au four doux à 90 ° C directement sur une plaque de cuisson pendant 1 minute ou dans un four à 110 ° C pendant 30 min (Figure 3, étape 1).
- Aligner le masque et de faire un contact dur et vide. Exposer à la lumière UV pendant quelques secondes (l'énergie totale: ~ 103 mJ / cm 2) (figure 3, étape 2). Développer avec AZ400K développeur, dilué 4:1 avec de l'eau DI pour ~ 50 secondes (jusqu'à résine photosensible est entièrement développé), tandis que en agitant doucement. Rincer à l'eau pendant 2 minutes. Inspectez caractéristiques avec microscope (Figure 3, étape 3). Si les fonctions sont mal résolus, dépouiller la résine photosensible et recommencez à partir de 1.2. Dur cuire à 115 ° C directement sur une plaque chauffante pour 2minutes.
- Plaquettes Descum avec Asher ou plasma O 2 pendant 2,5 minutes à 100 W de puissance RF. L'utilisation d'un profond ionique réactive graveur (MEIR), gravure de la couche de silicium polycristallin tout au long de la silice fondue ci-dessous. Bande le photorésist restant avec PRS2000 résister décapant à 75 ° C pendant 10 minutes. Rincez et séchez. Mesurer la profondeur de gravure afin de s'assurer qu'elle est tout le chemin à travers le revêtement de poly (Figure 3, étape 4).
- Utilisation d'un oxyde de MEIR apte tel qu'un ULVAC LND-6000 graveur, gravure de la silice fondue jusqu'à une profondeur de ~ 10 um par micron d'épaisseur du revêtement de poly (figure 3, étape 5). Ce revêtement poly sera porté loin lors de la gravure, de sorte qu'il peut être nécessaire pour vérifier l'intégrité du revêtement périodiquement pendant le processus de gravure. Si les régions sans traits intentionnellement de la surface de la plaquette sont devenus à nu de la couche protectrice de poly lors de la gravure, la surface a très probablement devenir dénoyautées et ne sera plus adaptée pour le collagedans les étapes finales de la production. Dans ce cas, la plaquette est plus probable n'est plus viable. Nettoyez-le avec l'Aser matrice pendant 4 minutes, 100 W de puissance RF. Dénuder le polysilicium avec un graveur XeF 2 (Figure 3, étape 6). Il peut être nécessaire de répéter l'étape 1.4 et cette étape plusieurs fois pour enlever tous les revêtements de résine photosensible et poly.
- Spin plaquettes manteau avec une nouvelle couche de ~ 1 um de résine photosensible pour protéger les voies lors des manipulations ultérieures. Percez des trous d'entrée et de sortie dans chaque puce en utilisant un ordinateur contrôlé foret diamanté ou manuellement avec une sableuse (Figure 3, étape 7). Si vous utilisez une perceuse, monter la plaquette (fonction vers le bas) sur une plaque de verre en utilisant Aqua sacrificielle Bond 55, en prenant soin de garder la colle exempte de bulles. Refroidir le foret avec une solution de nettoyage micro-90. Cela permet de maintenir de petits morceaux de verre de coller à des canaux qui a ensuite obstruer la puce lors de l'utilisation.
- Rincer la plaquette avec de l'eau DI à l'aide d'une seringue pour injecter water dans chaque trou. Faire tremper dans de l'eau savonneuse pendant une heure. Retirer de résine photosensible et Bond Aqua avec PRS 2000 à 60 ° C pendant plusieurs heures jusqu'à ce que la surface est propre. Rincer avec de l'eau DI plaquette et de l'eau chaude savonneuse. Rincer à nouveau chaque trou avec une seringue, en évitant les caractéristiques gravées. Plaquette à sec avec de l'azote et dans une étuve à vide réglé à 120 ° C. Inspectez les trous afin de s'assurer qu'ils sont exempts de grain et répéter les étapes de nettoyage si nécessaire. Mesurer la profondeur des canaux avec soit une profileur surface optique ou mécanique (figure 3, étape 8).
- Plaquettes propres et un nombre équivalent de 170 um d'épaisseur soudés verres de couverture de silice avec 1) une solution Piranha (1-2 heures selon la procédure au point 1.1), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) solution pendant 10 minutes à 75 ° C, 3) RCA solution à 1 (5:01:01 DI: NH 4 OH: H 2 0 2) pendant 22 minutes à 75C). Rincer à l'eau DI pendant 5 minutes entre chaque solution.
- Placer les tranches caractéristiques d'un côté sur le dessus deune pile de lingettes pour salles blanches 3-4 placés sur le dessus d'une surface plane et dure, comme un volet petite plaque de verre. Sécher soigneusement avec la plaquette de l'azote gazeux pendant au moins 5 minutes. Répéter l'opération avec couvercle en verre. Pick up couvercle en verre par le bord et inverser de telle sorte que le côté poli est face vers le bas a tenu sur la plaquette et d'aligner les bords plats. Soigneusement tomber le couvercle en verre sur la tranche et lui permettre de décanter. Déplacer horizontalement uniquement pour régler l'alignement. Poussez vers le bas avec un doigt sur le centre de la plaquette. Il faut voir un front de liaison commencent à rayonner vers l'extérieur. Si nécessaire, appliquer une pression supplémentaire à d'autres postes autour de la tranche pour faire avancer le front de liaison (Figure 3, étape 9).
- Placez les tranches de scellés dans un four à haute température réglée sur la rampe de température de la pièce à 800 ° C pendant 3 heures, puis de 800 à 1100 ° C au-dessus encore 1,2 heures. Tenez à 1100 ° C pendant 2 heures, puis descente de la rampe à température ambiante pendant 1,5 heure.
- Dice avec un découpage en tranche vu iertaines puces (Figure 3, étape 10).
- Le protocole décrit la fabrication de chaînes dans le substrat de silice fondue assez inhabituel qui est nécessaire pour la détection UV. Mais ce protocole peut également être adapté pour un substrat de silicium qui ne nécessite qu'une seule étape de gravure 2. Un verre (mais pas de la silice fondue) en verre de couverture peut être lié à la plaquette en utilisant une liaison anodique.
2. Le montage et le chargement Chips
- Le collecteur de tenir la puce de mélange et des solutions peuvent être en plastique, tels que Lexan ou en plexiglas ou en aluminium pour le contrôle de la température (voir figure 4). Si utilisant de l'aluminium, les réservoirs de solution doit être revêtue d'parylène pour empêcher la dissolution de l'aluminium par les solutions de sels dans les réservoirs. La température du collecteur d'ensemble, et des solutions à puce peut être commandé avec des dispositifs thermoélectriques monté sur les côtés et un contrôleur électronique.
- La puce est associé à la manipli par petite joints toriques et une tenue en place par une bague de retenue qui permet une vue dégagée optique du centre de la puce. Les rainures toriques devrait être moins profonde que la norme pour assurer l'accouplement bonne sans appliquer trop de pression à la puce, c'est à dire, un 002 o-ring doit être de 0,025 "de profondeur. Une fois la puce est montée, ajouter des solutions dans les réservoirs du centre et du côté , en prenant soin pour libérer les bulles piégées au fond des puits.
- Parce que les quantités utilisées dans ce mélangeur sont si petites, le débit peut être contrôlée par la pression d'air appliquée au-dessus des puits de solution. Figure 4 représente le collecteur de pression accouplée à la partie supérieure du collecteur puce par les joints toriques. La pression du collecteur est relié à des capteurs de pression contrôlés par l'ordinateur qui peuvent maintenir les pressions de ~ 2-80 PSI. La puce a été conçue de telle sorte que des pressions égales sur les canaux du centre et produire un côté ~ 100 fois rapport des débits linéaires. À 20 PSI, le débit linéaire dans le canal de sortie est d'environ 1 m/ S.
- Placez le distributeur sur un microscope inversé et d'examiner le mélange région avec l'oculaire ou sortie de la caméra. Une lampe de poche à incandescence placée au-dessus du collecteur se fournir suffisamment de lumière. Utilisation d'un indice élevé de colorant ou une solution de réfraction (c.-à-6 M de chlorhydrate de guanidine) dans le canal central pour afficher du jet.
- A une pression égale sur les canaux du centre et de côté, le jet sera difficile de voir à l'oeil afin de commencer avec la pression à canal latéral à 0 PSI et augmenter lentement à une pression égale. Si un canal latéral est obstrué, le jet est poussé contre une des parois du canal de sortie. Si un sabot visible apparaît, il peut être délogé par une pression ou un aspirateur pour le canal de sortie avec une seringue.
- Si la protéine ou d'un autre matériau organique obstrue la puce, il peut être nettoyé par immersion dans une solution Pirhana nuit.
3. Collecte des données
La figure 5 montre la disposition instrument optique de base.
- Amener un faisceau laser collimaté dans un microscope de recherche de qualité en utilisant un miroir dichroïque à l'intérieur ou juste à l'extérieur du microscope. Aligner le laser de sorte que la mise au point peut être vu dans l'oculaire ou une caméra un peu près de la zone de mélange.
- La fluorescence de la protéine dans le mélangeur est recueilli par l'objectif et envoyé à travers le miroir dichroïque, focalisé par une lentille à sténopé et une imagé sur un compteur de photons. Numériser la puce en utilisant un scanner piézoélectrique en x et y de l'image de la région de mélange (étape taille typique est de 2 um). Choisir une position sur le jet et de balayage en x et z pour trouver le point au centre du canal vertical. La profondeur de champ du microscope est très inférieure à la profondeur du canal et le débit est uniforme dans le canal sauf dans 1 um des parois. Par conséquent, la résolution temporelle de la fluorescence observée est principalement déterminée par la taille de la tache confocale.
- Numérisation horizontalement dans le canal de sortie (typique étape size est de 0,2 um à travers le jet, 2 pm le long du jet) en incréments de 100 um le long du jet, d'observation du ~ 1 ms par position (voir figure 6). Déplacer la platine du microscope par 80-90 um le long du jet d'immortaliser un moment plus tard.
- En variante, la lumière peut être détectée par un spectrographe et CCD après le miroir dichroïque utilisant une lentille pour focaliser la lumière sur la fente d'entrée. Depuis la collecte des données est plus lente que pour le compteur de photons (1 seconde par poste), généralement le jet est imagée d'abord avec le compteur de photons, puis des points le long du jet sont mesurées avec le spectrographe (voir Figure 7).
- Les données du compteur de photons est analysé en additionnant 3-5 pixels autour du jet à chaque position pour créer une parcelle de l'intensité par rapport à la distance. Le temps est calculé à partir de la distance en utilisant une vitesse calculée en fonction des pressions appliquées (voir figure 8).
- Les données provenant du spectrographe peut être analysée de deux façons. Pour le FRET, channels désignés comme «donneur» et «accepteur» peuvent être additionnés et le rapport de proximité E = I A / (I + D I D) calculée (voir la figure 9). Alternativement, la décomposition seule valeur peut être effectuée à regarder indépendants composantes spectrales en fonction du temps, tels que le changement dans le spectre d'émission du tryptophane en tant que protéine se replie.
- La distance dans le canal de sortie peut être converti à l'heure en utilisant le débit constant déterminé à partir de la pression appliquée aux canaux secondaires. Dans les 2 premiers um de la voie de sortie, le débit du jet protéine accélère ~ 100x et les temps de cette région doit être calculé avec analyse par éléments finis des lignes de courant (produire des moments représentés à la figure 8). Cette accélération produit un décalage de ~ 1-2 ms après la vitesse devient constante et peut habituellement être ignorée dans la mesure cinétique beaucoup plus lente que le mélange.
4. Les résultats représentatifs
La figure 6 montre un tracé de contours de l'intensité dans la région de mélange mesurée par le compteur de photons. L'arrière-plan dans le canal de sortie en dehors du jet doit être proche du niveau de bruit du détecteur et n'est généralement pas soustrait. Un fond plus élevé peut indiquer un mauvais alignement ou que la protéine est collé aux parois du canal. Un jet qui ressemble plié ou tordu, surtout près de la zone de mélange, indique une gravure médiocre des buses.
La figure 7 montre la résolution dans le temps des spectres de la protéine acyl-coenzyme A-binding protein (ACBP) marqué avec l'Alexa 488 et Alexa 647. Ces données ont été soustraites de fond pour enlever la charge sombre et signal laser. Le signal de fond a été prise avec la pression du canal central fixé à 0 PSI.
Le temps de mélange peut être mesurée par la mesure d'une réaction rapide qui est beaucoup plus rapide que de mélanger comme Trp extinction de la fluorescence by KI ou l'effondrement de l'ADN simple brin, marqué avec FRET colorants, par l'addition de NaCl. Parce que le jet est plus petite que la résolution optique du microscope, il ya une chute d'intensité grande dans la région de mélange des formes à jet. Cette réponse de l'instrument peut être retiré par une mesure de contrôle dans lequel aucun changement solution conditions. La figure 8 montre le rapport de mélange (en 400 mM KI) et non-mélange des expériences de la N-acétyl fluorescence amide tryptophane. La ligne indique la concentration prévue de KI à partir de simulations COMSOL. Le temps de mélange, comme mesuré comme le temps de la concentration de diminuer 80%, est de 8 ms.
Comme les données sont collectées par incréments de 100 um le long du canal de sortie 500 um de long, les données doivent être collées ensemble à partir de plusieurs vues. Il ya des décalages de temps en temps des petits dans le signal entre ces points de vue, probablement à cause de petits changements dans la mise au point que la puce est proposé par la platine du microscope. En déplaçant la scène 80 ou 90um par vue, ces décalages peuvent être éliminés en examinant les données qui se chevauchent. Généralement les données sont recueillies avec au moins deux débits et les données sont combinées pour confirmer les modifications de signal sont dues à de véritables changements spectroscopiques de la protéine, plutôt que des effets optiques ou de débit. La figure 9 montre le FRET changements dans la protéine de ACBP après dilution de dénaturant de 6 M à 0,06 M. Ces données ne nécessite pas une expérience de contrôle depuis le FRET est déjà un rapport et la réponse de l'instrument est déjà supprimé. Le saut rapide à proximité de T = 0 correspond à une variation rapide de FRET de signal dans le temps de mélange.
Figure 1. Disposition de région de mélange mesurée par microscopie électronique.
Figure 2. Schéma de mélanger hydrodynamique pour étudier le repliement des protéines. La protéine,dissous dans dénaturant haute pour la déplier, coule le canal du centre vers la zone de mélange où il rencontre un tampon qui coule ~ 100 fois plus rapide. À flux laminaire le flux de force protéine dans un jet étroit à partir de laquelle les molécules dénaturant peut diffuser rapidement. Comme le jet coule dans le canal de sortie, la protéine peut être observée avec une résolution spatiale et temporelle élevée en utilisant un microscope confocal.
Figure 3. De fabrication en silice fondue. 1) Procédé commence par une très polie 500 um de silice fondue substrat épais (a) avec une couche de polysilicium (poly) déposée sur les surfaces supérieure et inférieure (b) et de spin-revêtue d'une couche de photorésist (c). 2) un photomasque (e) est amené int o contact dure avec la tranche et le photorésist est exposé à une lumière UV (d). 3) Le plaquette est placé dans un bain révélateur et le motif est révélé dans la résine photosensible. 4) la plaquette est placé dans une MEIR et les caractéristiques sont gravés dans le revêtement supérieur poly. Le photorésist est ensuite retiré. 5) le poly agit alors en tant que masque lorsque la tranche est placée dans un graveur oxyde et les caractéristiques sont gravées de 10 à 40 um dans le substrat en silice fondue. 6) Le revêtement poly est ensuite retiré dans un XeF 2 graveur. 7) La plaquette est lié à une plaque de verre sacrificiel avec un matériau d'étanchéité activé par la chaleur (g), côté caractéristiques vers le bas, et un trépan de forage de diamant (f) par abrasion forets trous traversants de la face arrière. 8) Un profileur de surface (h), puis de mesurer directement les profondeurs métrages gravées. 9) A 170 um plaquette condensé lamelle de silice est directement collé sur la surface supérieure de la plaquette. 10) La plaquette est découpée en différentes puces microfluidiques.
3976/3976fig4.jpg "/>
Figure 4. Le collecteur mélangeur. Le microfluidique-puce est fixée à la tubulure solution avec une plaque frontale d'aluminium usiné et quatre joints toriques dans les réservoirs de ~ 200 pL. Un grand trou est usinée par le centre de la tubulure directement au-dessus de la région de mélange de l'apposé microfluidique-puce, permettant à la lumière UV en excès de s'échapper sans rétrodiffusion, inhiber toute autofluorescence du collecteur d'elle-même et permettant un éclairage direct de la puce par l'oeil ou un appareil photo pour l'alignement. Les joints de collecteur d'air chacun des réservoirs de telle sorte que la pression d'air dans chaque peuvent être commandés par l'intermédiaire d'une boîte de commande de pression externe.
Figure 5. Schéma d'un microscope optique confocal.
Figure 6. Tracé de contours de tryptophanela fluorescence dans le mélangeur microfluidique. La région de mélange est situé à ~ 90 um sur l'axe des y.
Figure 7. Temps spectres dépend fluorescente recueillies dans le mélangeur. Les rectangles verts et rouges indiquent les longueurs d'onde désignés comme canaux donneur et accepteur, respectivement.
Figure 8. Le temps de mélange mesurée par extinction de la fluorescence du tryptophane par l'iodure de potassium (points et axe de droite) et calculé par analyse par éléments finis (en ligne et axe de gauche).
Figure 9. FRET changements mesurés pendant le pliage de la protéine ACBP. L'augmentation rapide de près de t = 0 représente une phase d'éclatement dans le délai de mélange et le ralentissement de la hausse représente une accumulation progressivetion de structure telle que les plis de protéines. Les données ont été prises à deux débits différents et l'on couvrit, conduisant à des densités différentes de mesures à différents moments.
Discussion
Mélange rapide a été un objectif de développement pour le champ du repliement des protéines pour de nombreuses années, car il est reconnu depuis longtemps que les processus moléculaires de biomolécules se produire sur des échelles de temps allant de picosecondes à quelques secondes. Classiques stopped-flow mélangeurs ont des temps morts de 1-5 ms, ce qui est principalement limitée par les turbulences. Turbulent mélangeurs à flux continu avec un temps de mélange de 30-300 ms ont été développés au cours des 15 dernières années par un petit nombre de groupes mais exigent généralement des débits élevés pour atteindre ces temps de mélange et donc d'utiliser un grand nombre de l'échantillon 6-8.
Ce protocole décrit l'utilisation de puces microfluidiques mélange pour obtenir une dilution rapide dans le régime d'écoulement laminaire. Il ya de multiples avantages à travailler au sein de ce régime, mais un primaire est la possibilité de simuler l'ensemble du processus de mélange avec une grande précision qui permet de modifier la réponse de mélange. T-mélangeurs développés par d'autres groupes avec de simples geometries ont démontré un temps de mélange de 100-200 ms qui ont été principalement limités par la taille des canaux 9-10. Mettant à l'échelle de la taille des canaux à 10 um chevalier de réduire le temps de mélange d'environ 10 ms 11. Yao et Bakajin a montré que de petits changements dans la géométrie pourrait conduire à des améliorations significatives dans le temps de mélange 4. Toutefois, ce travail a montré que l'accélération du mélange peut aussi conduire à un ralentissement des phases ainsi. La conception utilisée dans ce travail 12-13 est un compromis entre les deux meilleures designs de référence de 4 à minimiser le plus lent de décroissance exponentielle de la concentration en dénaturant et aussi pour rendre la fonction plus reproductible dans gravure DRIE.
Il a eu une certaine controverse dans le domaine de la ultrarapide mélange sur la définition du temps de mélange. Il est important de reconnaître la différence entre "temps de mélange» et «temps mort». Le temps mort est définie dans un mélangeur turbulente que le temps pendant lequel une MESUREt ne peut être faite et peut en fait être beaucoup plus long que le temps réel de mélange. Il est généralement déterminée en faisant plusieurs mesures d'une réaction pseudo-premier ordre bimoléculaire (tels que trempe de fluorescence du tryptophane par N bromosuccinate) à différentes concentrations. Des caries observées exponentielles sont montés à converger à une valeur unique supposé être t = 0 s et le temps entre ce point et le premier point de mesure est le temps mort. Pour les mélangeurs à flux laminaire, des mesures peuvent être prises durant le processus de mélange de sorte qu'il n'ya pas de temps mort, seulement un temps de mélange. Le temps de mélange est tout simplement le temps de combiner deux solutions jusqu'à ce que l'uniformité suffisant est atteint. Nous avons défini précédemment le temps de mélange d'un temps de 90/10, le temps de la concentration de dénaturant pour diminuer de 90% à 10% de la valeur sans mélange. Toutefois, la forme de la courbe de mélange n'est pas parfaitement symétrique avec la queue de la désintégration ayant un petit composant exponentielle. En outre, le repliement des protéines a unefortement non-linéaire de dépendance sur la concentration de dénaturant de telle sorte que pliage peut souvent commencer même si le dénaturant est seulement réduit par deux fois. C'est pourquoi nous avons plus récemment défini le temps de mélange que le temps de réduire la concentration de dénaturant de 80%. Certes, d'autres définitions peuvent être utilisées en fonction des exigences de l'expérience.
L'utilisation de cette table de mixage pour étudier le repliement des protéines a toujours révélé des résultats surprenants. Pliage de cytochrome c et apomyoglobine ont longtemps été étudiée pour avoir de multiples étapes de pliage et les premiers résultats avec des mélangeurs à flux continu ont montré l'effondrement de se produire sur l'échelle de temps ~ 100 ms 10,14-15. Nos mesures ont montré avec cette table de mixage qu'il y ait au moins 2 étapes sur cette échelle de temps, un très rapide, probablement non spécifique, l'effondrement (tel que mesuré par fluorescence Trp décalage spectral) dans le temps de mélange du mélangeur suivie par une phase plus lente (comme mesurée par la trempe du total des émissions de Trp) qui est probablement le fla formation de la structure native IRST 5. Nous avons également observé un processus 50 ms dans le domaine B1 de la protéine L, renversant l'interprétation conventionnelle que cette protéine est un dossier 2-Etat 13.
Un avantage de cette table de mixage rapide, c'est qu'il permet de sonder le repliement de protéines les plus rapides pliantes qui ont habituellement seulement été mesurable par ordre de la nanoseconde T-saut instruments. T-saut nécessite généralement l'observation de pliage / dépliage détente à proximité de la température de fusion de la protéine et donc ne suit jamais le pliage de la population dans son ensemble. Avec cette table de mixage, nous avons examiné le pliage de la γ-répresseur (λ 6-86) à la fois les émissions totales Trp et décalage spectral et ont trouvé des preuves que la protéine n'a pas de barrière à plier sous de fortes conditions de pliage qui n'étaient pas accessibles à T précédentes -sauter des mesures 12. Enfin, nous avons mesuré le repliement de la coiffe villine HP-35, l'un des til le plus rapide des dossiers encore mesuré et a constaté que le taux de pliage mesuré après le mélange est de ~ 5 fois plus lent que mesurée par T-bond dans les mêmes conditions 16. Ceci suggère que la cinétique de pliage dépend des conditions de départ, le renversement d'une hypothèse majeure dans le domaine.
Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par la National Science Fibr Foundation (NSF EF-0623664) et IDBR (NSF DBI-0754570). Ce travail a été partiellement financé par des fonds de la National Science Foundation Grant Fibr 0623664 administré par le Centre pour la biophotonique, une science NSF et de la technologie Center, géré par l'Université de Californie, Davis, en vertu de l'accord de coopération PHY 0120999. La recherche de Lisa Lapidus, Ph.D. est soutenu en partie par une bourse de carrière à l'interface scientifique du Fonds Burroughs Welcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A. Ruggedness in the folding landscape of protein L. Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
