Summary
I detta arbete har vi förklara tillverkning och användning av en mikrofluidisk mixer kan blanda två lösningar i ~ 8 ps. Vi visar också användningen av dessa bländare med spektroskopisk detektering med användning av UV-fluorescens och fluorescensresonansenergiöverföring (FRET).
Abstract
Den process genom vilken ett protein veck i sin naturliga konformation är mycket relevant för biologi och människors hälsa ändå dåligt kända. Ett skäl till detta är att vikning sker över ett brett intervall av tid, från nanosekunder till sekunder eller längre, beroende på proteinet 1. Konventionella slutade flöden blandare har tillåtit mätning av vikbara kinetik start vid ca 1 ms. Vi har nyligen utvecklat en mikroflödessystem mixer som späder denatureringsmedel ~ 100-faldigt i ~ 8 ps 2. Till skillnad från en stoppat flöde bländare, fungerar denna bländare i det laminära flödet under i vilken turbulens inte inträffar. Frånvaron av turbulens ger en exakt numerisk simulering av alla flöden i mixern med utmärkt avtal om att experimentera 3-4.
Laminärt flöde uppnås för Reynoldstal Re ≤ 100. För vattenlösningar, kräver detta geometrier mikron skala. Vi använder en hårt substrat, såsom kisel eller kondenserad silica, för att göra kanaler 5-10 fim bred och 10 pm djup (se figur 1). De minsta dimensionerna, vid ingången till blandningsområdet, är i storleksordningen 1 | im i storlek. Chipet är förseglad med ett tunt glas eller kvarts täckglas för optisk access. Typiska totala linjära flödeshastigheter är ~ 1 m / s, vilket gav Re ~ 10, men proteinet konsumtionen endast ~ 0,5 Nl / s eller 1,8 | il / timme. Proteinkoncentrationen beror på detektionsmetoden: För tryptofanfluorescensen den typiska koncentrationen är 100 ^ (för en Trp / protein) och för FRET den typiska koncentrationen är ca 100 nM.
Vikningsprocessen är initieras genom snabb utspädning av denatureringsmedlet från 6 M till 0,06 M guanidinhydroklorid. Proteinet i hög denatureringsmedel strömmar ned en central kanal och möts på vardera sidan vid blandningsområdet med buffert utan denatureringsmedel förflytta ~ 100 gånger snabbare (se figur 2). Denna geometri ger en snabb strypning av proteinet flödet in i en smaljet ~ 100 nm bred. Spridning av de lätta denatureringsmedel molekylerna är mycket snabb, medan spridningen av de tunga proteinmolekylerna är mycket långsammare, sprida mindre än 1 nm i 1 ms. Skillnaden i diffusionskonstanten av denatureringsmedel och resultaten protein i snabb utspädning av denatureringsmedlet från proteinet ström, vilket minskar den effektiva koncentrationen av denatureringsmedlet runt proteinet. Proteinet strålen strömmar med en konstant hastighet längs observationen kanalen och fluorescens av proteinet under vikning kan observeras med användning av ett avsökande, konfokalt mikroskop 5.
Protocol
1. Tillverkning av Mikroflödessystem Blanda Chips
Figur 3 visar de grundläggande tillverkningssteg.
- Rengör 4 tum (100 mm) smält kiseldioxid wafers med färsk Piranha-lösning (3:1 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) Värm svavelsyra till 130 ° C och häll i peroxid. Notera att ytråheten och planheten hos det sintrade kiselglassubstratet skivorna används spelar en viktig roll för den slutliga bindningssteget. ii) Nedsänk skivorna under minst 30 minuter. iii) Skölj i 5 minuter med vatten och torka. Applicera en polysilikon (poly) beläggning, ~ 1 ^ m tjocka per varje avsedd 10 fim djup av de slutliga mikrofluidiska kanaler, med användning av en lågtrycks kemisk ångavsättning (LPCVD) ugn.
- Rengör skivor och mask använder Piranha protokollet i steg 1,1. Rengör masken på samma sätt, skölj sedan med aceton, metanol och isopropanol och föna omedelbart. Torka skivor på en varm platta vid 150 ° C under cirka 10 minuter (använd en tält aluminiumfolie för att hålla partiklar bort) eller i en 120 ° C ugn under åtminstone 120 minuter (över natten företrädesvis). För att öka fotoresist vidhäftning exponera omedelbart varma skivor som HMDS ånga i 5 minuter. Spin belägga de tunna skivorna med en ~ 900 nm tjockt skikt av AZ5214 fotoresist och mjuka torkning vid 90 ° C, direkt på en värmeplatta under 1 minut eller i en ugn vid 110 ° C under 30 minuter (figur 3, steg 1).
- Rikta masken och göra en hård och vakuum kontakt. Utsättas för UV-ljus under några sekunder (den totala energiförbrukningen: ~ 103 mJ / cm 2) (Figur 3, steg 2). Utvecklas med AZ400K utvecklare, utspädd 4:1 med avjoniserat vatten för ~ 50 sekunder (tills fotoresist fullt utvecklad) medan försiktig omrörning. Skölj med vatten i 2 minuter. Inspektera funktioner med mikroskop (Figur 3, steg 3). Om funktioner är dåligt lösas, skala fotoresist och börja om från 1,2. Hård baka 115 ° C direkt på en värmeplatta för 2minuter.
- Descum skivorna med Asher eller O 2 plasma under 2,5 minuter vid 100 W RF-effekt. Användning av en djup reaktiv jon etsningsanordning (DRIE), etsa polykiselskiktet hela vägen genom att det sintrade kiselglassubstratet nedan. Strippa den återstående fotoresisten med PRS2000 motstå avdrivningsanordningen i 75 ° C under 10 minuter. Skölj och torka. Mät etch djupet för att se det hela vägen genom poly beläggningen (Figur 3, steg 4).
- Användning av en oxid som kan DRIE såsom en ULVAC NLD-6000 etsningsanordning, etsa kvartsglas till en djup av ca 10 | im per mikron tjocklek av poly beläggning (figur 3, steg 5). Detta poly beläggning kommer att bäras bort under etsning, så det kan vara nödvändigt att kontrollera integriteten av beläggningen med jämna mellanrum under etsningsprocessen. Om avsiktligt formlöst regioner av skivytan har blivit avskalat av den skyddande poly beläggningen under etsning, har ytan sannolikt att bli urkärnade och kommer icke längre att vara lämpliga för bindningi de slutliga stegen av tillverkningen. I detta fall är skivan är mest sannolikt inte längre är livskraftiga. Ren med Matrix Asher under 4 minuter, 100 W RF-effektnivåer. Skala av polykisel med en XEF 2 etsningsanordning (figur 3, steg 6). Det kan vara nödvändigt att upprepa steg 1,4 och detta steg några gånger för att avlägsna alla fotoresist och poly beläggningar.
- Snurra belägga skivor med en ny ~ 1 ^ m skikt av fotoresist för att skydda de kanaler under efterföljande hantering. Borra in-och utgång hål i varje chip med en datorstyrd diamant spets borr eller manuellt med en sandbläster (figur 3, steg 7). Om du använder en borr, montera rånet (feature-nedåt) på en uppoffrande glasplatta med Aqua Bond 55, noga med att hålla bönder utan bubblor. Kyl borren med mikro-90 rengöringslösning. Detta håller små bitar av glas från att fastna vid de kanaler som sedan täpper chipet under användning.
- Skölj skivan med avjoniserat vatten med hjälp av en spruta för att injicera water i varje hål. Blötlägg i tvål och vatten under en timme. Ta bort fotoresist och Aqua Obligation med PRS 2000 vid 60 ° C under flera timmar tills ytan är ren. Skölj skivan med avjoniserat vatten och varmt tvålvatten. Skölj varje hål på nytt med en spruta, för att undvika etsade funktioner. Torr platta med kväve och i en vakuumugn inställd på 120 ° C. Kontrollera hål så att de är fria från sand och upprepa rengöringen steg som behövs. Mäta djupet av kanalerna med en optisk eller mekanisk ytprofilerare (figur 3, steg 8).
- Rena wafers och en ekvivalent antal av 170 ^ m tjocka kvartsglas täckglas med 1) Piranha-lösning (1-2 h i enlighet med proceduren i 1,1), 2) RCA 2 (05:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) lösning under 10 minuter vid 75 C, 3) RCA 1 lösning (5:1:1 DI: NH4OH: H 2 0 2) under 22 minuter vid 75C). Skölj med avjoniserat vatten under 5 minuter mellan varje lösning.
- Placera en wafer egenskaper uppåt ovanpåen stapel av 3-4 Renrumsdukar placerade ovanpå en hård plan yta, såsom en liten ruta av glas. Torka den tunna skivan grundligt med kvävgas under minst 5 minuter. Upprepa med lock glas. Plocka upp täckglas vid kanten och invertera så att den polerade sidan är vänd nedåt hålls över skivan och anpassa de platta kanterna. Försiktigt släppa täckglaset på skivan och låt den sätta sig. Knuffa vågrätt bara ställa in justering. Tryck ner med ett finger på mitten av skivan. Man bör se en mellan framför börjar stråla utåt. Vid behov kan ytterligare tryck på andra positioner runt skivan för att föra den främre bindning (figur 3, steg 9).
- Placera de förseglade skivorna i en hög temperatur ugn inställd på ramp från rumstemperatur till 800 ° C under 3 timmar, därefter från 800 till 1100 ° C under ytterligare 1,2 timmar. Håll vid 1100 ° C under 2 timmar, och sedan ramp ned till rumstemperatur under ytterligare 1,5 timmar.
- Dice med ett rån tärningsgaller såg in individual chips (figur 3, steg 10).
- Protokollet beskriver tillverkningen av kanaler i den ganska ovanliga smält kiselsubstrat som är nödvändig för UV-detektion. Men detta protokoll kan även anpassas för ett kiselsubstrat som kräver endast en etsningssteg 2. Ett glas (men inte smält kiseldioxid) täckglas kan bindas till skivan med användning av anodisk bondning.
2. Montering och ladda Chips
- Grenröret för att hålla blandningen chipet och lösningar kan framställas av plast, såsom Lexan eller plexiglas eller aluminium för temperaturreglering (se figur 4). Om användning av aluminium, skall lösningen reservoarerna beläggas med parylen för att förhindra upplösning av aluminium genom saltlösningarna i reservoarerna. Temperaturen hos hela grenröret, lösningar och chipset kan styras med termoelektriska enheter monterade på sidorna och en elektronisk styrenhet.
- Chipet är parad med Manifaldigt genom små o-ringar och en hålls på plats med en kvarhållande ring som tillåter en klar optisk bild av centrum av chipet. De o-ringen spåren bör vara grundare än standard för att säkerställa god parning utan att alltför mycket tryck på chip, borde det vill säga en 002 o-ring vara 0,025 "djupt. När chipet är monterad, lägga till lösningar till centrum och sidan reservoarer Var noga med att släppa några bubblor fångade i botten av brunnarna.
- Eftersom de mängder som används i denna bländare är så små, kan flödet kontrolleras med lufttryck anbringas ovanför lösningen brunnarna. Visar tryckgrenröret parade till toppen av chipet samlingsröret genom O-ringar Figur 4. Trycket grenröret är ansluten till datorstyrda tryckgivare som kan upprätthålla trycket från ~ 2-80 PSI. Chipet är utformad så att lika tryck på mitten och sidokanalerna producera en ~ 100-faldig förhållandet i de linjära flödeshastigheter. Vid 20 psi, är den linjära flödeshastigheten i utloppskanalen ~ 1 m/ Sek.
- Placera fördelare på ett inverterat mikroskop och undersöka blanda regionen med okularet eller kamera utgång. En glödlampa ficklampan placeras ovanpå grenröret kommer att ge tillräckligt med ljus. Använd ett färgämne eller hög brytningsindex lösning (dvs. 6 M guanidinhydroklorid) i centerkanalen för att visa på strålen.
- Vid samma tryck på mitten och sidokanalerna kommer strålen vara svårt att se med blotta ögat så börja med sidan kanalen trycket vid 0 PSI och långsamt öka till samma tryck. Om en sidokanal är igensatt, kommer strålen att tryckas mot en av väggarna hos utloppskanalen. Om en synlig clog visas, kan den lossna genom att applicera tryck eller vakuum till utgången kanal med en spruta.
- Om proteinet eller annat organiskt material täpper chipet kan det rengöras genom blötläggning i Pirhana lösning över natten.
3. Datainsamling
Figur 5 visar den grundläggande optiska instrumentet layouten.
- Ta en kollimerad laserstråle in i ett forsknings-grade mikroskop med hjälp av en dikroisk spegel antingen innanför eller strax utanför mikroskopet. Rikta in lasern så att fokus kan ses i okularet eller kameran något i närheten av blandningen regionen.
- Fluorescens från proteinet i biandaren uppsamlas av målet och skickas via den dikroiska spegeln, fokuseras av en lins till ett litet hål och avbildas på en fotonräknare. Skanna chipet med hjälp av en piezoelektrisk scanner i x-och y för att avbilda blandningsområdet (typiskt steg storleken är 2 m). Välj en position på jet och skanning i X och Z för att hitta fokus i mitten av kanalen vertikalt. Skärpedjupet för mikroskop är mycket mindre än kanalens djup och flödeshastigheten är likformig i kanalen utom inom 1 pm av väggarna. Därför den temporala upplösningen av den observerade fluorescensen bestämmes huvudsakligen av storleken av det konfokala plats.
- Skanna horisontellt i utgången kanalen (typiskt steg sIze är 0,2 m in över strålen, 2 m längs strålen) i 100 nm steg längs strålen, observera att ~ 1 ms per position (se figur 6). Flytta mikroskopställningen med 80-90 m längs strålen att fånga senare tider.
- Alternativt kan ljus som detekteras av en spektrograf och CCD efter den dikroiska spegeln med hjälp av en lins för att fokusera ljuset på ingångsslitsen. Eftersom datainsamlingen är långsammare än för fotonräknare (1 sekund per position), är typiskt strålen avbildas första med fotonräknare och sedan längs strålen mäts med spektrografen (se figur 7).
- Data från fotonräknare analyseras genom att summera 3-5 pixlar runt strålen vid varje position för att skapa en tomt av intensitet kontra avstånd. Tiden räknas från avstånd med en beräknad hastighet baserat på de tillämpade tryck (se figur 8).
- Data från spektrografen kan analyseras ett par olika sätt. För FRET, Channels betecknade som "givare" och "acceptor" kan var och en summeras och närheten förhållandet E = I A / (jag D + I D) beräknas (se diagram 9). Alternativt kan samma värde sönderdelningen genomföras för att titta på oberoende spektrala komponenter som funktion av tiden, såsom förändring i tryptofan emissionsspektrum som ett protein veck.
- Avståndet i utloppskanalen kan omvandlas till tiden med hjälp av konstant flödeshastighet bestäms från det anbringade trycket till sidokanalerna. Inom de första 2 m av utgångskanal accelererar flödet av proteinet jet ~ 100x och de tider i regionen måste beräknas med finita element analys av strömlinjeformar (som producerar de tider plottas i Figur 8). Denna acceleration ger en förskjutning av ~ 1-2 is efter hastigheten blir konstant och kan oftast ignoreras för att mäta kinetiken mycket långsammare än blandning.
4. Representativa resultat
Figur 6 visar en konturplot för intensiteten i blandningsområdet mäts av fotonräknare. Bakgrunden i utgångskanalen utsidan av strålen bör vara nära den brusgolvet hos detektorn och är typiskt inte subtraherad. En högre bakgrund kan indikera dålig inriktning eller att proteinet är fast vid väggarna i kanalen. En stråle som ser krokig eller krokiga, speciellt nära blandning regionen indikerar en dålig etch av munstyckena.
Figur 7 visar den tids-upplösta spektra från proteinet acyl-coenzym A-bindande protein (ACBP) märkt med Alexa 488 och Alexa 647. Dessa data har bakgrunden subtraherats för att ta bort den mörka laddning och laser signal. Bakgrunden Signalen togs med centerkanalen trycket inställt på 0 PSI.
Blandningen tid kan mätas genom att mäta en snabb reaktion som är mycket snabbare än att blanda t.ex. Trp fluorescensdämpning By Kl eller kollaps av enkelsträngat DNA, märkt med FRET färgämnen, genom tillsats av NaCl. Eftersom munstycket är mindre än den optiska upplösningen av mikroskopet, finns det en stor intensitet droppe i blandningsområdet som strålen former. Detta instrument respons kan avlägsnas genom att en kontrollmätning i vilket ingen lösning förhållandena ändras. Figur 8 visar förhållandet mellan blandningskammaren (i 400 mM Kl) och icke-blandningsexperiment för N-acetyl-tryptofan amid fluorescens. Linjen visar den förutspådda koncentrationen av KI från COMSOL simuleringar. Blandningstiden, mätt som den tid för koncentrationen att minska 80%, är 8 | is.
Eftersom data samlas in i 100 nm steg längs 500 m långa exit kanal måste data klistras tillsammans från flera vyer. Det är ibland små förskjutningar i signalen mellan dessa vyer, sannolikt på grund av små förändringar i fokus när chipet förflyttas av mikroskop scenen. Genom att flytta steget 80 eller 90um per vy, kan dessa förskjutningar elimineras genom att undersöka överlappande uppgifter. Vanligtvis samlas in med minst två flöden och data kombineras för att bekräfta eventuella signal förändringar beror på verkliga spektroskopiska förändringar i proteinet, snarare än optiska eller flöde effekter. Figur 9 visar FRET förändringar i proteinet ACBP efter utspädning av denatureringsmedel från 6 m till 0,06 M. Dessa uppgifter behöver inte en kontroll experiment eftersom FRET redan är ett förhållande och instrumentet svaret redan tagits bort. Den snabba hopp i närheten av T = 0 representerar en snabb förändring i FRET-signalen i den blandningstiden.
Figur 1. Layout av blandningsområdet mätt genom elektronmikroskopi.
Figur 2. Schematisk av hydrodynamisk blandning för att studera protein-veckning. Proteinet,upplöst i hög denatureringsmedel att utvecklas den rinner ner centerkanalen mot blandningen region där den möter buffert flödar ~ 100 gånger snabbare. Laminärt flöde tvingar proteinet strömmen i en smal stråle som denatureringsmedel molekyler snabbt kan diffundera. Som strålen strömmar nedför utgångskanal kan proteinet observeras med hög spatial och tidsupplösningen med användning av en konfokalt mikroskop.
Figur 3. Kvarts tillverkning. 1) Processen startar med en högpolerad 500 | im tjock smält kiselsubstrat (a) med ett skikt av polykisel (poly) avsattes på de övre och undre ytorna (b) och spinn-belagd med ett skikt av fotoresist (c). 2) En fotomask (e) bringas int o hård kontakt med skivan och fotoresisten exponeras för UV-ljus (d). 3) Skivan placerades i en framkallningsbad och mönstret visat i fotoresisten. 4) Skivan placerades i en DRIE-och egenskaperna är etsade i den övre poly beläggningen. Fotoresisten avlägsnas sedan. 5) Den poly fungerar sedan som en mask när skivan placeras i en oxid-etsningsanordning särdragen etsas från 10 till 40 | im in i smält kiselsubstrat. 6) Den poly beläggningen avlägsnas sedan i en XEF 2 etsningsanordning. 7) Skivan är bunden till en galvanisk glasplatta med en värmeaktiverad tätningsmedel (g), särdrag och ner och en diamant borrkrona (f) slipning borrar genomgående hål från baksidan. 8) En yta profiler (h) sedan direkt mäter etsade funktionen djup. 9) en 170 pm tjock smält kiseldioxid täckglas wafern är direkt bunden på den övre ytan av skivan. 10) Skivan tärnas i enskilda mikroflödessystem chips.
3976/3976fig4.jpg "/>
Figur 4. Biandaren grenröret. Mikrofluidanordningen-chipet är fäst till lösningen grenrör med en maskinbearbetad aluminium planskivan och fyra O-ringar i enlighet med de ~ 200 | il reservoarer. Ett stort hål maskinbearbetas genom centrum av samlingsröret direkt ovanför blandningsområdet av anbringas mikrofluidisk-chip, vilket tillåter överskott UV-ljus för att undkomma utan bakåtspridning, inhibera någon auto-fluorescensen från grenröret sig och tillåter direkt belysning av chipet med ögat eller kamera för justering. De luftgrenrör tätningar vardera av behållarna så att lufttrycket i varje kan kontrolleras via en yttre tryck kontrollboxen.
Figur 5. Schematisk av optisk konfokalt mikroskop.
Figur 6. Konturkurva för tryptofanfluorescens i mikrofluidanordningen biandaren. Blandningsområdet är belägen vid ~ 90 | im på y-axeln.
Figur 7. Tid beroende fluorescerande spektra samlas i blandaren. De gröna och röda rektanglarna visar de våglängder som betecknas som givar-och acceptor kanaler, respektive.
Figur 8. Blandningstid mätt genom fluorescensdämpning av tryptofan genom kaliumjodid (punkter och höger axel) och beräknas genom finit elementanalys (linje och vänstra axeln).
Figur 9. FRET förändringar mäts under vikningen av proteinet ACBP. Den snabba ökningen i närheten t = 0 representerar en skur fasen inom den blandningstid och den långsammare ökning representerar en successiv ackumulaning av strukturen som proteinet veck. De data som togs vid två olika flödeshastigheter och överlagras, vilket leder till olika densiteter av mätningar vid olika tidpunkter.
Discussion
Snabb blandning har varit ett utvecklingsmål för området av protein folding i många år eftersom det har länge varit känt att molekylära processer biomolekyler ske under tidsperioder som sträcker sig från pikosekunder till sekunder. Konventionella slutade flöden blandare har döda tider 1-5 ms som främst begränsas av turbulens. Turbulenta kontinuerliga flöde blandare med blandning tider 30-300 is har utvecklats under de senaste 15 åren av ett litet antal grupper, men i allmänhet kräver höga flöden för att uppnå dessa blandning gånger och därför använder en hel del prov 6-8.
Detta protokoll beskriver användningen av mikrofabricerade blandning flis för att åstadkomma snabb utspädning i laminärt flöde. Det finns flera fördelar med att arbeta inom detta system, men en primär en är möjligheten att simulera hela blandningsprocessen med hög precision som gör att man kan modifiera blandningsprocessen respons. T-blandare som utvecklats av andra grupper med enkel geometries har visat blandningstider av 100-200 is som främst begränsades av storleken på kanalerna 9-10. Genom att skala storleken hos kanalerna till 10 | im Knight reduceras blandningstiden till ~ 10 ^ s 11. Yao och Bakajin visade att små förändringar i geometri kan leda till betydande förbättringar i blandningstiden 4. Visade emellertid att arbete att acceleration av blandning kan också leda till långsammare faser också. Designen som används i detta arbete 12-13 är en kompromiss mellan de två bästa design i referens 4 för att minimera den långsammare exponentiella förfallet i denatureringsmedel koncentration och även göra funktionen mer reproducerbar i DRIE etsning.
Det har varit en del stridigheter inom ultrasnabb blanda över definitionen av blandningstiden. Det är viktigt att inse skillnaden mellan "blandning tid" och "död tid". Dödtiden är definierad i en turbulent bländare som den tid under vilken en measurement kan inte göras och kan i själva verket vara signifikant längre än den faktiska blandningstiden. Det bestäms typiskt genom att ett flertal mätningar av en pseudo-första ordningens bimolekylära reaktion (såsom släckning av tryptofanfluorescensen genom N bromosuccinate) vid olika koncentrationer. De observerade exponentiella sönderfaller monteras att konvergera till ett enda värde antas vara t = 0 s och tiden mellan den punkten och den första mätpunkten är dödtid. För bländare med laminärt flöde, kan mätningar göras under blandningsprocessen så det finns ingen dödtid, endast en blandningstid. Blandningstiden är helt enkelt den tid för att kombinera två lösningarna tills tillräcklig likformighet uppnås. Vi har tidigare definierats blandningstiden vara en 90/10, den tid under koncentrationen av denatureringsmedlet minska från 90% till 10% av den oblandade värde. Emellertid är formen på blandningskammaren kurvan inte är perfekt symmetrisk med den bakre delen av sönderfall som har en liten exponentiell komponent. Vidare har proteinveckning enkraftigt icke-linjära beroende denatureringsmedel koncentration så att vikning kan ofta påbörjas även om denaturant endast minskas med två gånger. Därför har vi mer nyligen definierat blandningstiden som den tid för att reducera denatureringsmedlet koncentration av 80%. Visst andra definitioner kan användas beroende på kraven för experimentet.
Användningen av denna mixer för att studera protein folding har konsekvent visat överraskande resultat. Vikning av cytokrom c och apomyoglobin har länge studerats har flera vikbara steg och tidiga resultat med kontinuerligt flöde blandare visade kollaps ske på ~ 100 ps tid 10,14-15. Våra mätningar med denna bländare visade det sig vara minst 2 steg på denna tidsskala en mycket snabb, sannolikt icke-specifik, kollaps (mätt genom Trp fluorescens spektralförskjutning) inom blandningstid av biandaren följt av en långsammare fas (såsom mätt som utsläckning av totala Trp emission) som sannolikt kommer att fIRST bildning av nativa strukturen 5. Vi har också observerat en 50 | is process i B1-domänen av protein L, välta den konventionella tolkningen att detta protein är en 2-tillståndet mapp 13.
En fördel med denna snabba mixer är att det kan sondera vikningen av de snabbaste vikbara proteiner som normalt endast har mätbara med nanosekund T-jump instrument. T-jump kräver vanligtvis observation av beredning / utbredning avslappning nära smälttemperaturen av proteinet och därför aldrig följer vikningen av hela befolkningen. Med denna mixer har vi tittat på vikningen av γ-repressor (λ 6-86) med både Trp för totala utsläpp och spektrala shift och har funnit bevis för att proteinet har inget hinder för att vika under starka fällbara förhållanden som inte var tillgängliga för tidigare T -hoppa mätningar 12. Slutligen har vi mätt vikningen av villin headpiece HP-35, en av THan snabbaste mappar mäts ännu och fann att det fällbara mätt efter blandning är ~ 5 gånger långsammare än mätt med T-jump på samma villkor 16. Detta antyder att vika kinetik beror på startvillkoren, välta ett stort antagande inom området.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av National Science Foundation FIBR (NSF EF-0.623.664) och IDBR (NSF DBI-0.754.570). Detta arbete har delvis stöd av medel från National Science Foundation FIBR Grant 0623664 administreras av Centrum för Biophotonics, en NSF Science and Technology Center, som förvaltas av University of California, Davis, under samarbetsavtal PHY 0.120.999. Forskningen av Lisa Lapidus, Ph.D. stöds delvis av en karriär Award vid vetenskapligt gränssnitt från Burroughs Welcome fonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A. Ruggedness in the folding landscape of protein L. Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
