Ikke-kontakt, Label-fri overvågning af celler og ekstracellulær matrix ved hjælp af Raman spektroskopi

Summary

Raman-spektroskopi er en egnet teknik til berøringsfri, etiketten uden analyse af levende celler, væv fremstillede konstruktioner og native væv. Kilde-specifikke spektrale fingeraftryk kan genereres og analyseres ved hjælp af multivariabel analyse.

Abstract

Ikke-destruktiv, ikke-kontakt og etiket-fri teknologier til overvågning celle-og vævskulturer er behov for inden for biomedicinsk forskning. ^1-5 imidlertid for tiden tilgængelige rutinemæssige fremgangsmåder kræver bearbejdningstrin og ændre prøve integritet. Raman-spektroskopi er en hurtig fremgangsmåde, der muliggør måling af biologiske prøver uden behov for yderligere bearbejdningstrin. . Denne laser-baseret teknologi detekterer uelastisk spredning af monokromatisk lys ⁶ Da hvert kemikalie vibration er tildelt en specifik Raman-bånd (bølgetal i ^cm-1), idet hver biologisk prøve indeholder et typisk spektral mønster på grund af deres iboende biokemisk sammensætning ^{7. - 9} Inden Raman spektre, topintensiteterne korrelerer med mængden af de nuværende molekylære bindinger. ^1. Ligheder og forskelle i de spektrale datasæt kan påvises ved at anvende en multivariat analyse (fx principal komponent analyse (PCA)). ¹⁰

Her udfører vi Raman spektroskopi af levende celler og indfødte væv. Cellerne er enten podet på glasbund skåle eller holdes i suspension under normale cellekultur betingelser (37 ° C, 5% CO ₂₎ før måling. Native væv dissekeres og lagres i phosphatpufret saltvand (PBS) ved 4 ° C før måling. Afhængig af vores eksperimentelle opsætning, så vi enten fokuseret på cellekernen eller ekstracellulær matrix (ECM) proteiner såsom elastin og kollagen. For alle undersøgelser, er mindst 30 celler eller 30 tilfældige steder af interesse inden for ECM målt. Databehandling trin inkluderet baggrundssubtraktion og normalisering.

Protocol

1. Fremstillinq af den biologiske prøve

1. Fremstillinq af levende celler
   1. Fremstillinq af adhærente celler
      1. Frø in vitro-dyrkede eller friskt isolerede celler i et glasbund skål (Greiner BioOne / Tyskland) og inkubere dem ved 37 ° C og _5% CO2, indtil cellebinding er afsluttet.
      2. Fjerne dyrkningsmediet og vaskes forsigtigt tre gange med PBS før målingen. Holde cellerne dækket med enten PBS eller celledyrkningsmedium hele måleprocedure.
   2. Fremstillinq af celler i suspension
      1. Løsnes in vitro-dyrkede celler ifølge almindelige protokoller (f.eks trypsin-EDTA, celle skrabning), centrifugeres cellerne, og genopslæmmes den opnåede cellepellet med PBS og celledyrkningsmedium.
      2. Overfør 100 ul af cellesuspensionen (koncentration: max 100.000 celler / ml) i et glas bund skål.
2. Fremstilling af NATIve væv
   1. Efter høst af væv, overføre dem til sterile, iskoldt PBS og opbevares længere end 12 timer ved 4 ° C eller på is før måling. Tidligere forsøg har vist, at en forlænget opbevaringstid (kold iskæmi tid> 12 timer ved 4 ° C) resulterede i spektrale ændringer som følge af naturlige nedbrydningsprocesser.
   2. Målingerne udføres med vævet dækket med PBS eller medium for at undgå beskadigelse af ECM-proteiner og celler på grund af væv tørring.

2. Raman-spektrometer

Vores tilpasset Ramanspektrometer kombinerer en standard fluorescensmikroskop (Olympus IX 71) med en Ramanspektrometer, der tillader direkte sammenligning af lys-marken og fluorescens billeder med Raman spektre. Det grundlæggende sæt op består af en 784 nm diodelaser (Toptica Photonics AG / Tyskland), et notch-filter til adskillelse af Raman-lysspredning fra excitationslys, et mikroskop ennd en spektrograf (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) med en ladningskoblet indretning (CCD-kamera) optimeret til påvisning af spektral information (F-vis fra bløde Imaging Systems / Tyskland).

3. Kontrol af Laser Function

1. Start softwaren Andor Solis (Andor / Det Forenede Kongerige) og indstil temperaturen af ​​CCD-kamera til -60 ° C for at minimere støj forårsaget af termisk inducerede strømme i kameraet.
2. Placere en siliciumskive på mikroskopbordet til kalibreringsproceduren.
3. Tænd laseren på og sætte strøm til 85 mW.
4. Brug den software Cell B (Olympus / Tyskland) til at fokusere laseren på wafer, indtil XY vises.
5. Måle siliciumskive med en enkelt integrationstid på 1 sekund ved anvendelse af en 60x luft mål.
6. Ændre enhed x-aksen fra pixel for at Raman-forskydning ^(cm-1) i Andor Solis software.
7. Variere laser fokus silicium top ved 520 ^cm-1 idet opsamlede spektrum for at finde den størst mulige styrke for denne Raman-bånd. Den mindste mængde tæller skal være højere end 11.000 at have en vellykket kalibrering.

4. Raman spektroskopiske målinger

Alle målinger udføres ved stuetemperatur.

1. Grundlæggende indstillinger
   1. Anvende en 60x nedsænkning i vand mål (Olympus / Tyskland) med en numerisk apertur på 1,2 til opsamling af spektret af prøverne.
   2. Skift køb indstillingerne til 10 integrationer / 10 sekunder til i alt 100 sekunder pr målinger.
2. Måling af adhærente celler
   1. Tage glasbund skålen med cellerne og placere den på mikroskopbordet.
   2. For at opnå et bedre signal og sikre reproducerbarhed, koncentreres laseren på cellekernen, drejes mikroskop lyset slukket og begynde at indsamle spektret.
   3. Måle en reference spektrum af baggrunden emeget 10 spektre ved at bevæge Laser Focus siden af ​​cellen. Det er vigtigt at overveje, at når der skiftes fokus en ny baggrund skal indsamles for hvert indsatsområde dybde.
3. Måling af celler i suspension
   1. Overfør 100 ul af cellesuspensionen i glasset bunden skålen og placere den på mikroskopbordet.
   2. Fokusere laseren på midten af ​​cellen, drejes mikroskop lyset slukket og begynde at indsamle spektret.
   3. Måle en reference spektrum af baggrunden for hver 10 spektre ved at bevæge Laser Focus siden af ​​cellen. Når du skifter fokus, skal en ny baggrund skal indsamles for det nye fokus dybde.
4. Måling af indfødte væv
   1. Tag prøven og læg det i et glas bund fad. Området af interesse (ROI) bør være orienteret vendende mod bunden af ​​skålen.
   2. Fyld skålen med tilstrækkelig PBS til at dække prøven.
   3. Placere et dækglas over prøven for at undgå movement af prøven under målingerne.
   4. Indstil laser fokus i strukturen af ​​interesse (dybde opløsning er laser-og væv-afhængig), og begynde at indsamle spektrene.
   5. Samle en reference spektrum af baggrunden for hver 10 spektre ved at bevæge Laser Focus ud af hele vævsområdet. Når du skifter fokus, skal en ny baggrund skal indsamles for det nye fokus dybde.
5. Måling af immunofluorescens (IF)-mærkede kryosnit
   1. § friske, snap-frosne vævsprøver ved hjælp af en standard cryotom og montere dem på silica-coatede dækglasset.
   2. Farvning af kryosnit efter en rutine protokol for IF, der kun anvender en kort fiksering trin (max. 10 minutter med 4% paraformaldehyd) og ved hjælp af passende antistoffer til påvisning af proteinet af interesse.
   3. Udføre Raman målinger fokuserer på det område, hvor fluorescens forekommer.
6. Elastin nedbrydning eksperimenter
   1. PlaCE ventricularis af dissekerede porcine aortaklapflige (elastin-rige, blod tilstrømningen-sidelag af hjerteklap folder) står på bunden af ​​glasset bunden skål.
   2. Måle native væv som en "ikke-inkuberet kontrol" ved 30 tilfældige steder i hele vævsoverfladen fokuserer på den fibrillære struktur.
   3. Opdele prøven i 3 sektioner og placere dem i separate 2,5 ml Eppendorf-rør fyldt med 2 ml af en elastase-opløsning (5 U / ml, Worthington / Tyskland).
   4. Inkubér væv til enten 15 eller 30 minutter ved 37 ° C.
   5. Efter inkubation i enten 15 eller 30 minutter fjerne væv fra Eppendorf-rør og vaskes grundigt med PBS med henblik på helt at standse den enzymatiske reaktion.
   6. Mål hver prøve med 30 tilfældige punkter, der fokuserer på de fibrillære strukturer.

5. Databehandling og analyse

1. Raman-spektre behandling
   Forbehandlingen afgenereres spektre blev udført under anvendelse OPUS software (Bruker Optik GmbH / Tyskland).
   1. For at reducere interfererende signaler fra glasset og mediet samt at undgå variationer som følge af ændringer i fokus under målingerne, trækkes den tilsvarende baggrunden spektret fra den opsamlede spektre.
   2. Reducer spektre til bølgetal regionen mellem 400-1800 cm ^-1, hvilket giver den højeste mængde information.
   3. Hvis det er nødvendigt, at normalisere spektre for den maksimale top. Normaliseringsfaktorer påpeger de intensitetsfluktuationer og systematiske fejl, forenkle påvisning af strukturelle ændringer i prøven spektre.
   4. Udfør en baseline korrektion for at øge sammenligneligheden mellem forskellige eksperimenter.
2. Raman-spektre analyse
   Den Raman spektre blev analyseret ved hjælp af PCA med The Unscrambler (CAMO / Norge) software. Denne multivariat analyse registrerer forskelle og ligheder inden for de spektrale datasæt. Hver spektrum er afbildet som en enkelt punkt i et flerdimensionalt rum baseret på de indsamlede tællinger for hver Raman-forskydning. Hvert princip komponent (PC) beskriver en vis mængde af den samlede oplysningerne i de oprindelige data. Den første computer er en, der indeholder den største kilde til variation. Hvert af de følgende PC indeholder, med henblik på, mindre information end den foregående. Hver variabel har en score og en belastning på hver pc. Ved at plotte pc'er (= point), kan vigtige prøve korrelationer blive udsat for. De belastninger beskriver bidraget fra hver analyseret variabel til partnerskabs-og samarbejdsaftalen.
   1. Mærk hver gruppe af målinger ved at skabe række områder for hver prøve gruppe.
   2. Brug følgende grundlæggende indstillinger for PCA: krydsvalidering, den NIPALS algoritme, ingen rotation og starte analysen. Disse indstillinger er spektre afhængige.
   3. Udfør PCA.

6. Repræsentative resultater

Raman spECTRA genereres fra adhærente celler ofte viser et lavt signal-til-støjforhold og en lav samlet signalintensitet (fig. 1). ¹¹ grund af, at laseren fokus skal indstilles i nærheden af glasset bunden indflydelsen af interfererende glas signal er temmelig høj, hvilket maskering af selve prøven signal. Derfor vil prøven signalet minimeres eller endda elimineres under en efterfølgende baggrundssubtraktion. Derfor foretrækker vi at bruge celler i suspension for vores Raman spektroskopisk analyse, da de muliggør påvisning af mere detaljerede spektral information. Imidlertid spektrene af adhærente og suspensionen celler udviser de samme hovedtoppe kun er forskellige i deres intensitet.

Til karakterisering af forskellige celletyper i en suspension, der ikke forbehandling nødvendig. Den gennemsnitlige Raman-spektra og standardafvigelser af humane fibroblaster, mesenchymale stamceller (MSC'er), chondrocytter og keratinocytter målt i suspension erafbildet i Figur 2. Alle Raman-spektre har en lignende struktur, med toppe stammer fra typiske biomolekyler såsom proteiner, nukleinsyrer og lipider (se tabel 1). ^12. For disse celletyper, spektrale område mellem 600 og 1800 ^cm-1 indeholder mest relevante spektral information, som som tydelige forskelle er påviselige mellem de forskellige celletyper (fig. 2A). Eksemplarisk, vi fremhævede en spektral region (1280-1350 cm ^-1) viser tydelige strukturelle forskelle, som er assignes til molekylære vibrationer af kollagen og lipider. I modsætning hertil er morfologiske undersøgelser ikke egnet til identifikation og skelnen af de fleste celler (fig. 2B-I). Mens forskellen mellem chondrocytter og hudceller kan observeres (fig. 2D, H eller B, F og E, I), fibroblaster og MSC'er er vanskelige at separere ved hjælp af udelukkende lys-felt micrsocopier (Fig. 2B, F versus C, G). ¹³

Raman-spektroskopisk analyse af nativt væv, især af ECM-proteiner, kræver, at en ROI kan visualiseres ved lyse-felt billeddannelse for at være i stand til at fokusere på de respektive struktur. For tildelingen af ​​et protein til en bestemt fingeraftryk spektrum, vi genereret Raman spektre af kommercielt tilgængelige rene proteiner og immunhistologisk farvede kryosnit. Her har vi identificeret fingeraftrykket spektrene af elastiske fibre i native væv sammenligner lyofiliseret elastin og immunofluorescens-farvede kryosektioner anvender et antistof mod elastin. Men eftersom elastin har en høj autofluorescens, hvilket afspejles i Raman-spektre, dataanalyse er udfordrende (fig. 3A). At reducere den systematiske fejl som følge af sample-specifikke egenskaber, såsom autofluorescens, en passende behandling af datasættene er afgørende. I vores data enalyses, anvendte vi normalisering til at eliminere den væsentligt højere signalintensiteten af den rene elastin protein, og således, at vi var i stand til at frembringe sammenlignelige Raman-spektre (fig. 3B). Elastin er en af de mest stabile ECM-proteiner i kroppen og er derfor meget vanskeligt at nedbrydes. ¹⁴ I vores eksperimentelle opsætning vi induceret elastin nedbrydning i raske porcine aortaklapflige ved at udføre en enzymatisk fordøjelse. Anvendelse af multivariabel analyse PSA, identificerede vi signifikante forskelle mellem den Raman-spektre af enzymatisk behandlede prøver og native kontroller (Fig. 3C). Disse spektrale forskelle blev observeret i påfyldningsstillingen spektrum ved 861, 1003 og 1664 ^cm-1. Forventede strukturelle ændringer i elastin-holdige fibre på grund af længere eksponeringstider for elastase er blevet vist ved Hart farvning (fig. 4), som blev også afspejlet i flere forskellige udskiftelige score klynger (fig. 3C).

Figur 1. Middel Raman-spektre af aftagne og adhærerende fibroblaster.

Figur 2 (a) Middel Raman-spektre og standardafvigelser af fire forskellige primære isolerede celletyper (fibroblaster, MSC, chondrocytter og keratinocytter). Rammen fremhæver det spektrale område på 1280 - 1350 ^cm-1 med strukturelle forskelle. (BE) Lys-field billeder aftagne (B) fibroblaster, (C) MSC'er (D) chondrocytter og (E) keratinocytter. Målestokken er lig 20 um. (FI) Lys-field billeder af adhærente (F) fibroblaster, (G) MSC'er (H) chondrocytter og (I) keratinocytter. Målestokken er lig 200 um.

Figur 3 (a) Raman-spektre uden normalisering af lyophiliZed elastin (blå linie), immunofluorescens (IF)-mærkede kryosnit (orange linie) og elastiske fibre (rød linje), målt inden for indfødte aortaklapflige. Det høje signal intensitet lyofiliseret elastin forårsages af autofluorescens. (B) Raman-spektre efter normalisering for at eliminere systemfejl. (C) scorer og belastninger af sammenligningen mellem ikke-behandlet kontrol (rød) og enzymatisk nedbrudt (blå og grøn) elastiske fibre i native væv.

Figur 4. HART's-farvede porcine aortaklapflige. Elastiske fibre er visualiseret i sort. (A) og (B) viser ubehandlet kontrol og (C) og (D) viser vævsprøver, som blev udsat for elastin-nedbrydende enzym elastase i 30 minutter.

Bølgetal i cm-1	Opgave 12
717-719	CN	Fosfolipider
785-788	DNA / RNA baser, OPO rygraden	DNA / RNA
1003 - 1005	Phenylalanin	Protein
1220-1280	Amid III	Protein
1445-1447	CH2	Protein / lipid
1655-1680	Amid IC = C	Protein Lipid

Tabel 1. Raman-bånd, der er detekteret inden spektre af alle celletyper (fibroblaster, MSC, chondrocytter og keratinocytter).

Discussion

Raman-spektroskopi er en egnet værktøj til analyse af biologiske prøver, såsom in vitro-dyrkede celler og ECM-proteiner såvel som celler i native væv. ^11,15,16 Her har vi demonstreret, at denne ikke-kontakt etiket-fri teknik tillader diskrimination af forskellige celletyper og påvisning af ECM protein nedbrydning udelukkende baseret på den iboende biomolekylære sammensætningen af ​​disse biologiske prøver.

Den største fordel ved Raman spektroskopi er evnen til ikke-invasivt kvantificere biokemiske fingeraftryk af en prøve af den resulterende Raman-spektre. I modsætning til infrarød spektroskopi, hvilket giver lignende information kan Raman-spektre opsamles fra vandige prøver, som Raman spredning af vand er svag. Desuden er Raman spektroskopi udelukkende baseret på påvisning af tilbagespredning af monokromatisk lys, og derfor er ingen prøve behandling, som kræves før måling. Disse egenskaber gør Ramand spektroskopi et lovende alternativ til potentiel in vivo billeddannelse anvendelser. I denne forbindelse, er sammenhængende anti-Stokes Raman spektroskopi (CARS) en meget interessant teknik, da det gør det hurtigere og mere følsomme erhvervelse af data baseret på de samme vibrationelle signaler anvendes i vores eksperimenter. ^15,16 Andre alternative metoder, herunder multiphoton-induceret autofluorescens og anden harmoniske generation billeddannelse er tidligere blevet vist at være egnede til monitorering af biologiske prøver uden eller med minimal invasiv. ¹⁷ imidlertid er disse afbildningsmodaliteter forbundet med meget høje omkostninger og er begrænset til autofluorescens-genererende molekyler. Desuden er Raman spektrometer let at kombinere med konventionelle optiske mikroskoper. Disse egenskaber gør Raman spektroskopi et værdifuldt værktøj til at studere biologiske prøver i fysiologiske miljøer.

En af de nuværende begrænsninger i vores Raman spektroskopi oprettet erDen relativt lille Laser Focus (250 nm fuld bredde halvt maksimum (FWHM) lateral og 700 nm FWHM aksial), der er skabt af en høj numerisk apertur mål (NA = 1,2). Selv om en høj numerisk apertur tillader at dække en god mængde af det udsendte Raman lys giver i et højt signal-støjforhold, høj NA frembringer kun en lille samling fokus i prøven, som typisk er meget mindre end en celle. For at sammenligne Raman-spektre af forskellige celler, tapning af en repræsentativ spektrum er væsentligt, hvilket er vanskeligt at opnå med en lille fokusområde. For at løse dette problem, vi arbejder på en proces for at automatisere signalet indsamlingen på forskellige punkter i cellen (= Raman spektroskopiske kortlægning), hvilket resulterer i en spektral gennemsnit og giver til et repræsentativt spektrum. Derudover vil denne teknik giver et overblik over fordelingen af ​​specifikke Raman-bånd, for eksempel af proteinet fordeling i en celle.

Biological prøver er meget komplekse og består af en heterogen blanding af biomolekyler, der bidrager til samlet Raman-spektre. Derfor spektrale mønster er meget kompleks, og overvågning af en enkelt type af et molekyle i et Raman-spektrum er vanskelig at opnå med overlapning af de forskellige molekyle signaler. Desuden kan iboende fluorescens af prøven maskere værdifuld information svagere Raman signaler. Interessant nok i nogle af vores tidligere undersøgelser, identificerede vi autofluorescens i Raman spektre som den vigtigste differentierende faktor mellem celletyper (MSC og fibroblaster) ved hjælp af en relevant analyse værktøj. ¹³ Vi har også konstateret, at ændringer i den overordnede Raman signalintensitet kan tjene som en indikator for tilstanden af kollagen og kollagen fibre i ECM af aortaklapflige. ⁹ Men når man analyserer tilstanden af elastin i disse væv, var vi ikke i stand til at registrere tilsvarende resultater. Som nævnt i det resultats sektion vi kun var i stand til at detektere ændringer i specifikke Raman-bånd i elastase-behandlede prøver sammenlignet med de native kontroller. Vi kunne ikke se et fald i den samlede Raman signal i de enzymatisk-behandlede prøver som forventet. Disse observationer resulterede i en score plot, der ikke klart viser en klynge formation som vist i den tidligere undersøgelse. ⁹ I modsætning hertil blev indflydelsen af den enzymatiske behandling kan påvises inden for PCA resultater. Vi antager, at forskellene mellem de to ECM-proteiner, elastin og collagen, er baseret på morfologiske forskelle og forskellige enzymatiske nedbrydningsprodukter processer: i aortaklappen folder er collagen-rige zone (fibrosa) et kontinuert lag, der bliver løsnet på grund af enzymatisk behandling, hvorved elastin indeholdende zone (ventricularis) har en netværkskonfiguration der vises fragmenteret efter udsættelse for elastase (fig. 4). Enkelte punktmålinger var derfor ikke hensigtsspiste for at opdage sådanne små bristninger i elastin netværket. Her ville en Raman kortlægning af vævet hjælpe med at identificere nedbrud.

En yderligere udfordring i Raman spektroskopi af biologiske prøver, er at reducere måletidspunkter. En løsning er at forøge lasereffekt, der er egnet, så længe de biologiske prøver ikke er påvirket af foto-beskadigelse. Alle vores nuværende eksperimenter er proof-of-principle undersøgelser, der fokuserer på grundforskning, men vores overordnede mål er at gennemføre Raman spektroskopi til kliniske anvendelser, herunder regenerativ medicin (f.eks kvalitetskontrol af væv-manipuleret), præ-transplantation graft overvågning og kræftdiagnostik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
elastase	Worthington Biochemical	LS006363
anti-elastin antibody	Sigma-Aldrich	HPA018111	1:75; citrate buffer
PBS	Lonza Inc.	17-512F
glass bottom dishes	Greiner Bio-One	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker Corporation