Ikke-kontakt, Label-fri Overvåking av celler og ekstracellulær matriks med Raman spektroskopi

Summary

Raman spektroskopi er en egnet teknikk for ikke-kontakt, label-fri analyse av levende celler, vev-teknikk konstruerer og innfødte vev. Kildespesifikk spektrale fingeravtrykk kan genereres og analyseres ved hjelp av multivariat analyse.

Abstract

Ikke-destruktiv, ikke-kontakt og label-fri teknologi for å overvåke celle og vevskulturer er nødvendig innen biomedisinsk forskning. ^1-5 Men foreløpig tilgjengelige rutinemetoder krever foredlingsledd og endre prøven integritet. Raman spektroskopi er en rask metode som muliggjør måling av biologiske prøver uten behov for ytterligere foredlingsledd. . Denne laser-basert teknologi oppdager uelastisk spredning av monokromatisk lys ⁶ Som enhver kjemisk vibrasjon er tildelt en bestemt Raman band (wavenumber i cm ^-1), har hver biologisk prøve en typisk spektral mønster på grunn av sin iboende biokjemiske sammensetningen ^{7. - 9} Innenfor Raman spektra, peak intensitet korrelerer med mengden av dagens molekylære obligasjoner. ¹ Likheter og forskjeller i de spektrale datasettene kan oppdages ved å ansette en multivariat analyse (f.eks prinsipal komponent analyse (PCA)). ^ti

Her utfører vi Raman spektroskopi av levende celler og vev innfødte. Cellene er enten sådd på glassbunn retter eller holdt i suspensjon under normale cellekulturer forhold (37 ° C, 5% CO ₂₎ før måling. Native vev blir dissekert og lagres i fosfatbufret saltvann (PBS) ved 4 ° C før målinger. Avhengig av vår eksperimentelle oppsett, vi så enten fokusert på cellekjernen eller ekstracellulær matrix (ECM) proteiner som elastin og kollagen. For alle studier, er et minimum av 30 celler eller 30 tilfeldige severdigheter innenfor ECM målt. Databehandling steg med bakgrunn subtraksjon og normalisering.

Protocol

1. Klargjøring av biologisk prøve

1. Utarbeidelse av levende celler
   1. Utarbeidelse av heftende celler
      1. Seed in vitro-dyrkede eller fersk isolerte celler i et glass bunn parabol (Greiner BioOne / Tyskland) og inkuber dem ved 37 ° C og 5% CO ₂ til celle vedlegget er fullført.
      2. Fjern kultur medium og Vask forsiktig tre ganger med PBS før måling. Hold celler dekket med enten PBS eller cellekultur medium hele målingen prosedyren.
   2. Utarbeidelse av celler i suspensjon
      1. Løsne in vitro-dyrkede celler i henhold til vanlige protokoller (f.eks trypsin-EDTA, celle skraping), sentrifuger cellene og re-suspendere oppnådd cellepelleten i PBS eller cellekultur medium.
      2. Overføring 100 mL av cellen suspensjon (konsentrasjon: Maks 100.000 celler / ml) til en glassbunn rett.
2. Utarbeidelse av native vev
   1. Etter høsting vev, overføre dem til sterilt, iskald PBS og holde dem ikke lenger enn 12 timer ved 4 ° C eller på is før måling. Tidligere forsøk har vist at en lengre lagringstid (kald iskemi tid> 12 timer ved 4 ° C) resulterte i spektrale endringer som følge av naturlige nedbrytingsprosesser.
   2. Målingene må utføres med vev dekket i PBS eller medium for å unngå skade av ECM proteiner og celler på grunn av vev tørking.

2. Raman Spectrometer

Vår tilpasset Raman spektrometer kombinerer en standard fluorescens mikroskop (Olympus IX 71) med en Raman spektrometer som tillater direkte sammenligning av lys-feltet og fluorescens bilder med Raman spektra. Den grunnleggende sett består av et 784 nm diodelaser (Toptica fotonikk AG / Tyskland), et hakk filter for separasjon av Raman-spredte lyset fra eksitasjon lys, et mikroskop ennd en spektrograf (Kaiser Optical Systems Inc., Ann Arbor / USA) med en kostnad kombinert enhet (CCD kamera) optimalisert for påvisning av spektral informasjon (F-vis fra Soft Imaging Systems / Tyskland).

3. Kontroll av Laser funksjon

1. Start programvaren Andor Solis (Andor / Storbritannia) og sette temperaturen på CCD kamera til -60 ° C for å minimere støy forårsaket av termisk induserte strømmer i kameraet.
2. Plasser en silisium wafer på mikroskopet scenen for kalibreringsprosedyren.
3. Slå laseren på og sette kraft til 85 mW.
4. Bruk programvaren Cell B (Olympus / Tyskland) å fokusere laseren på wafer til XY vises.
5. Mål silisium wafer med en enkel integrasjon tid på 1 sek ved hjelp av en 60x luft objektiv.
6. Endre enhet av x-aksen fra pixel nummer til Raman shift (cm ^-1) i Andor Solis programvaren.
7. Varier laser fokus på silisium topp ved 520 cm ^-1 iinnsamlet spektrum for å finne størst mulig intensitet for dette Raman bandet. Det minimum av teller må være høyere enn 11 000 å ha en vellykket kalibrering.

4. Raman spektroskopi

Alle målinger er utført ved romtemperatur.

1. Grunnleggende innstillinger
   1. Bruk en 60x vann nedsenking objektiv (Olympus / Tyskland) med en numerisk apertur på 1,2 for å samle spekteret av prøvene.
   2. Endre oppkjøp innstillingene til 10 integrasjoner / 10 sekunder for totalt 100 sekunder per målinger.
2. Måling av heftende celler
   1. Ta glassbunn fatet med cellene og plassere den på mikroskopet scenen.
   2. For å oppnå en bedre signal og sikre reproduserbarhet, fokusere laseren på cellekjernen, slår mikroskop lyset av og begynne å samle spekteret.
   3. Mål en referanse spekter av bakgrunnen emeget 10 spektra ved å flytte laser fokus ved cellen. Det er viktig å tenke på at når du endrer fokus en ny bakgrunn må samles for hver fokus dybde.
3. Måling av celler i suspensjon
   1. Overføring 100 mL av cellesuspensjon i glasset bunnen fatet og plasser det i mikroskop scenen.
   2. Fokus laseren på midten av cellen, slå mikroskop lyset av og begynne å samle spekteret.
   3. Mål en referanse spekter av bakgrunnen hver 10 spektra ved å flytte laser fokus ved cellen. Når du endrer fokus, må en ny bakgrunn samles for det nye fokuset dybde.
4. Måling av innfødte vev
   1. Ta prøven og plassere den i et glass bunn parabolen. Regionen av interesse (ROI) bør være orientert mot bunnen av fatet.
   2. Fyll formen med nok PBS å dekke prøven.
   3. Plasser en cover glass over prøven for å unngå movement av prøven under målingene.
   4. Sett laser fokus i strukturen av interesse (dybde oppløsning er laser-og vev-avhengige) og begynner å samle spektrene.
   5. Samle en referanse spekter av bakgrunnen hver 10 spektra ved å flytte laser fokusere ut av hele vev området. Når du endrer fokus, må en ny bakgrunn samles for det nye fokuset dybde.
5. Måling av immunfluorescens (IF)-merkede cryosections
   1. § friske, snap-frosne vevsprøver ved hjelp av en standard cryotom og montere dem på silika-belagte dekke briller.
   2. Flekk de cryosections etter en rutine protokoll for IF, sysselsetter bare en kort fiksering trinn (maks. 10 minutter med 4% paraformaldehyde) og ved hjelp av egnede antistoffer for påvisning av protein av interesse.
   3. Utfør Raman målinger som fokuserer på området der fluorescens oppstår.
6. Elastin fornedrelse eksperimenter
   1. PlaCE ventricularis av de dissekerte svin aortaklaffen brosjyrer (elastin-rik, blod tilsiget-side laget av hjerteklaffen pakningsvedlegget) vendt til bunnen av glasset bunnen fatet.
   2. Mål innfødte vev som en "non-inkubert kontroll" på 30 tilfeldige punkter over hele vevsoverflaten fokus i fibrillar strukturer.
   3. Fordel prøven i 3 seksjoner og plassere dem i egne 2,5 ml Eppendorf-rør fylt med 2 ml av en elastase løsning (5 U / ml, Worthington / Tyskland).
   4. Inkuber vev for enten 15 eller 30 minutter ved 37 ° C.
   5. Etter inkubering for enten 15 eller 30 minutter, fjerne vev fra Eppendorf rør og vask forsiktig med PBS for å fullstendig stoppe den enzymatiske reaksjonen.
   6. Mål hver prøve ved 30 tilfeldige punkter, med fokus på de fibrillar strukturer.

5. Data Processing og analyse

1. Raman spektrene behandling
   Forbehandling avgenererte spektre ble utført med OPUS programvare (Bruker Optik GmbH / Tyskland).
   1. For å redusere forstyrrende signaler fra glasset og mediet samt å unngå variasjoner som skyldes endringer i fokus under målingene, trekker tilsvarende bakgrunn spekteret fra det innsamlede spektra.
   2. Reduser spektrene til wavenumber regionen mellom 400-1800 cm ^-1, som tilbyr den høyeste mengden av informasjon.
   3. Hvis nødvendig, normalisere spektrene til maksimal topp. Normalisering faktorer ut intensiteten svingninger og systematiske feil, forenkle påvisning av strukturelle endringer i utvalget spektra.
   4. Utfør en baseline korreksjon å øke sammenlignbarheten mellom ulike eksperimenter.
2. Raman spektrene analyse
   Den Raman spektra ble analysert ved hjelp av PCA med The Unscrambler (CAMO / Norge) programvare. Dette multivariat analyse oppdager forskjeller og likheter i de spektrale datasett. Hvert spektrum er plottet som en enkelt punkt i et flerdimensjonalt rom basert på de innsamlede teller hver Raman skift. Hvert prinsipp komponent (PC) beskriver en viss mengde av den totale informasjonen i de opprinnelige dataene. Den første PC er den som inneholder den høyeste kilden til variasjon. Hver følgende PC inneholder, i rekkefølge, mindre informasjon enn den forrige. Hver variabel har en score og en belastning på hver PC. Ved å plotte PCer (= score), kan viktige eksempler korrelasjoner bli utsatt. De belastninger beskriver bidraget fra hver analyserte variabel til PCA.
   1. Label hver gruppe av målinger ved å opprette rad serier for hver prøve gruppe.
   2. Bruk følgende grunnleggende innstillinger for PCA: kryssvalidering, det NIPALS algoritmen, ingen rotasjon og starte analysen. Disse innstillingene er spektra avhengige.
   3. Utfør PCA.

6. Representative Resultater

Raman spectra generert fra heftende cellene ofte avslører en lav signal-til-støy-forhold og en lav samlet signal intensitet (Fig. 1). ^elleve grunn av det faktum at laser fokus må settes nær glassbunn, påvirkning av den forstyrrende glass signal er ganske høy, slik maskering av selve prøven signal. Følgelig kan prøven signalet bli minimalisert eller elimineres i løpet av en påfølgende bakgrunn subtraksjon. Derfor foretrekker vi å bruke celler i suspensjon for våre Raman spektroskopisk analyse, som de tillater deteksjon av mer detaljert spektral informasjon. Men spektra av heftende og fjæring celler stille de samme viktigste toppene ulik bare i deres intensitet.

For karakterisering av ulike celletyper i en suspensjon, er ingen forbehandling nødvendig. Middelverdien Raman spektra og standardavvik av menneskelige fibroblaster, stamceller (MSCS), chondrocytes og keratinocytter målt i suspensjonenavbildet i figur 2. Alle Raman spektrene er like strukturert, med topper som stammer fra typiske biomolekyler som proteiner, nukleinsyrer og lipider (se tabell 1). ^12. For disse celletypene, den spektrale området mellom 600 og 1800 cm ^-1 inneholder mest relevant spektral informasjon, ved som klare forskjeller kan påvises mellom de ulike celletyper (Fig. 2A). Eksemplarisk, fremhevet vi en spektral-regionen (1280-1350 cm ^-1) viser tydelige strukturelle forskjeller, som er overdras til molekylære vibrasjoner av kollagen og lipider. I kontrast morfologiske analyser er ikke egnet for identifisering og forskjellsbehandling av de fleste celler (Fig. 2B-I). Mens forskjellen mellom chondrocytes og hudceller er observerbart (Fig. 2D, H versus B, F og E, I), fibroblaster og MSCS er vanskelig å skille bruker utelukkende lys-feltet micrsocpier (Fig. 2B, F versus C, G). ¹³

Raman spektroskopi analyse av innfødte vev, særlig av ECM proteiner, krever at en ROI kan bli visualisert ved lys-felt bildebehandling for å kunne fokusere på de respektive struktur. For tildeling av et protein til en bestemt fingeravtrykk spektrum, genererte vi Raman spektra av kommersielt tilgjengelige rene proteiner og immunohistologically beiset cryosections. Her identifiserte vi fingeravtrykket spektra av elastiske fibre i innfødte vev sammenligne lyofilisert elastin og immunfluorescens Fargede cryosections ansette en antistoff mot elastin. Men siden elastin har en høy autofluorescens, noe som gjenspeiles i Raman spektra, er det dataanalyse utfordrende (Fig. 3A). For å redusere systematiske feil som skyldes sample-spesifikke egenskaper som autofluorescens, en hensiktsmessig behandling av datasettene er avgjørende. I våre data enalyses, brukte vi normalisering å eliminere den betydelig høyere signal intensitet av den rene elastin protein, og dermed klarte vi å generere sammenlignbare Raman spektrene (Fig. 3B). Elastin er et av de mest stabile ECM proteiner i kroppen og er derfor svært vanskelig å bli dårligere. ^14. I vår eksperimentell satt opp, induserte vi elastin degradering i friske svin aortaklaffen løpesedler ved å utføre en enzymatisk fordøyelse. Anvendelse av multivariat analyse PCA, identifiserte vi signifikante forskjeller mellom Raman spektra av enzymatisk behandlet prøvene og innfødte kontroller (Fig. 3C). Disse spektrale forskjeller ble observert i lasteslangen spekteret på 861, 1003 og 1664 cm ^-1. Forventet strukturelle endringer i elastin-holdige fibrer grunn lengre eksponeringstider til elastase ble vist av Harts farging (Fig. 4), som også ble reflektert i flere distinkte separable poengsum klynger (Fig. 3C).

Figur 1. Mean Raman spektra av frittliggende og tilhenger fibroblaster.

Figur 2. (A) Mean Raman spektra og standardavvik av fire forskjellige primære isolerte celletyper (fibroblaster, MSCS, chondrocytes og keratinocytter). Rammen fremhever spektrale regionen 1280 - 1350 cm ^-1 med strukturelle forskjeller. (BE) Bright-feltet bilder av frittliggende (B) fibroblaster, (C) MSCS, (D) chondrocytes og (E) keratinocytter. Scale bar tilsvarer 20 mikrometer. (FI) Bright-feltet bilder av heftende (F) fibroblaster, (G) MSCS, (H) chondrocytes og (i) keratinocytter. Scale bar tilsvarer 200 mikrometer.

Figur 3. (A) Raman spektra uten normalisering av lyophiliZed elastin (blå linje), immunfluorescens (IF)-merkede cryosections (oransje linje) og elastiske fibre (rød linje) målt innenfor innfødte aortaklaffen brosjyrer. Den høye signal intensitet lyofilisert elastin er forårsaket av autofluorescens. (B) Raman spektra etter normalisering for å eliminere systemiske feil. (C) Poeng og belastninger av sammenligningen mellom ikke-behandlede kontroll (rød) og enzymatisk-degradert (blå og grønn) elastiske fibre i den opprinnelige vev.

Figur 4. HART's Fargede svin aortaklaffen brosjyrer. Elastiske fibre er visualisert i svart. (A) og (B) viser ubehandlet kontroll og (C) og (D) skildrer vevsprøver som ble eksponert for elastin-nedverdigende enzymet elastase for 30 minutt.

Wavenumber i cm -1	Overdragelse 12
717-719	CN	Fosfolipider
785-788	DNA / RNA baser, OPO backbone	DNA / RNA
1003 - 1005	Fenylalanin	Protein
1220-1280	Amide III	Protein
1445-1447	CH 2	Protein / Lipid
1655-1680	Amide IC = C	Protein Lipid

Tabell 1. Raman band som oppdages innen spektra av alle celletyper (fibroblaster, MSCS, chondrocytes og keratinocytter).

Discussion

Raman spektroskopi er et egnet verktøy for å analysere biologiske prøver, for eksempel in vitro-dyrkede celler og ECM proteiner samt celler i løpet av innfødte vev. ^11,15,16 Her viste vi at dette ikke-kontakt, lar label-fri teknikk i diskriminering av ulike celletyper og påvisning av ECM protein degradering utelukkende basert på den iboende biomolekylære sammensetningen av disse biologiske prøver.

Den store fordelen med Raman spektroskopi er evnen til ikke-invasiv kvantifisere den biokjemiske fingeravtrykk av en prøve ved sin resulterende Raman spektra. I motsetning til infrarød spektroskopi, som gir tilsvarende opplysninger, kan Raman spektra hentes fra vandige prøver, som Raman scatter fra vann er svak. I tillegg er Raman-spektroskopi utelukkende basert på påvisning av tilbakespredning av monokromatisk lys, derfor er ikke prøvebehandling nødvendig før måling. Disse egenskapene gjør RaMannen spektroskopi et lovende alternativ for potensielle in vivo bildebehandlingsprogrammer. I denne hilsen, er sammenhengende anti-Stokes Raman spektroskopi (CARS) en meget interessant teknikk fordi det gir raskere og mer sensitive kjøp av data basert på de samme vibrasjonelle signalene benyttes i våre eksperimenter. ^15,16 Andre alternative metoder, inkludert multiphoton-indusert autofluorescens og andre harmonisk generasjon bildebehandling tidligere har blitt vist seg å være egnet for overvåking av biologiske prøver ikke-eller minimal invasiv. ¹⁷ Imidlertid er disse bildediagnostikk assosiert med svært høye kostnader og er begrenset til autofluorescens genererer molekyler. I tillegg er Raman spektrometer lett å kombinere med konvensjonelle optiske mikroskoper. Disse egenskapene gjør Raman spektroskopi et verdifullt verktøy for å studere biologiske prøver i fysiologiske miljøer.

En av dagens begrensninger i vår Raman spektroskopi satt opp erden relativt lille laser fokus (250 nm full bredde halv maksimum (FWHM) lateral og 700 nm FWHM aksial) som er skapt av en høy numerisk apertur objektiv (NA = 1,2). Selv om en høy numerisk apertur tillater å dekke en god mengde av utsendt Raman lys som gir et høyt signal-til-støy-forhold, produserer høy NA bare en liten samling fokus i utvalget som er typisk mye mindre enn en celle. For å sammenligne Raman spektra av ulike celler, er samlingen av en representant spektrum vesentlig, noe som er vanskelig å få med et lite fokusområde. For å løse dette problemet, jobber vi med en prosess for å automatisere signalet samling på ulike punkter i cellen (= Raman spektroskopi kartlegging), som resulterer i en spektral snitt og gi etter for et representativt spekter. I tillegg vil denne teknikken gi en oversikt over fordelingen av spesifikke Raman band, for eksempel av proteinet distribusjon innenfor en celle.

Biological prøver er svært komplekst og består av en heterogen blanding av biomolekyler som bidrar til samlet Raman spektrene. Derfor er det spektrale mønsteret svært komplekst og overvåking av en enkelt type av et molekyl i en Raman spektrum er vanskelig å oppnå med overlapping av ulike molekyl signaler. I tillegg kan iboende fluorescens i prøven maskere verdifull informasjon om svakere Raman signaler. Interessant, i noen av våre tidligere studier, identifiserte vi autofluorescens i Raman spektrene som den viktigste skille faktor mellom celletyper (MSCS og fibroblaster) ved hjelp av en passende analyseverktøy. ¹³ Vi identifiserte også at endringer i den totale Raman signal intensitet kan tjene som en indikator for tilstanden i kollagen og kollagenfibre innenfor ECM av aortaklaffen brosjyrer. ⁹ Men når analysere tilstanden elastin i disse vev, var vi ikke i stand til å oppdage lignende resultater. Som nevnt i resultatets del, var vi bare i stand til å oppdage endringer i spesifikke Raman band i elastase-behandlede prøver i forhold til de innfødte kontrollene. Vi så ikke en nedgang av den totale Raman signal i enzymatisk behandlet prøvene som forventet. Disse observasjonene førte en score plott som ikke avslører noen klar klynge formasjon som i forrige undersøkelse. ⁹ I kontrast, ble påvirket av den enzymatiske behandlingen oppdages innenfor PCA resultatene. Vi antar at disse avvikene mellom de to ECM proteiner, elastin og kollagen, er basert på morfologiske forskjeller og ulike enzymatisk nedbrytning prosesser: i aortaklaffen pakningsvedlegget, er kollagen-rik sone (fibrosa) en sammenhengende lag som blir løsnet på grunn av enzymatisk behandling, der elastin inneholder sone (ventricularis) har en nettverkskonfigurasjon som vises fragmentert etter eksponering for elastase (Fig. 4). Enkelt sted målinger var derfor ikke hensiktsmessigspiste å oppdage slike små brudd i elastin nettverket. Her vil en Raman kartlegging av vev bidra til å identifisere nettverket sammenbrudd.

En ytterligere utfordring i Raman spektroskopi av biologiske prøver er å redusere måleresultatene ganger. En løsning er å øke laser makt, noe som er egnet så lenge de biologiske prøvene ikke påvirkes av foto-skade. Alle våre nåværende eksperimenter er proof-of-prinsippet studier som fokuserer på grunnleggende forskning, men er vårt overordnede mål å gjennomføre Raman spektroskopi for kliniske applikasjoner, inkludert regenerativ medisin (f.eks kvalitetskontroll av vev-konstruerte produkter), pre-transplantasjon pode overvåking og kreftdiagnostikk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
elastase	Worthington Biochemical	LS006363
anti-elastin antibody	Sigma-Aldrich	HPA018111	1:75; citrate buffer
PBS	Lonza Inc.	17-512F
glass bottom dishes	Greiner Bio-One	627860
The Unscrambler	CAMO
Opus	Bruker Corporation