Summary
在这里，我们描述了一个小鼠胚胎胰腺分离，培养和操纵方法。这是一个极好的
Abstract
胰腺控制我们的身体重要的功能，包括消化酶和调节血糖水平的生产。虽然在过去的十年中，许多研究都促成了坚实的基础，为了解胰腺器官，重要的差距仍然存在在我们的知识的早期胰腺形成2。将提供一个完整的了解，这些早期事件的洞察这个机构的发展，也成为目标的胰腺疑难杂症，如糖尿病和胰腺癌。最后，这些信息将产生发展的背景下，糖尿病的细胞替代疗法的蓝图。
在胚胎发育过程中，胰腺源于不同的胚胎副产物的背，腹肠胚层在胚胎天（E）9.5在小鼠胚胎3,4。这两种副产物向外翻固体上皮细胞周围的间充质升芽，进行增殖，分支和分化的产生一个完全成熟的器官2,5,6。最近的证据表明，生长和分化的胰腺细胞谱系，包括产生胰岛素的β细胞，依赖于适当的组织架构，上皮重构和细胞定位分支胰腺上皮内7,8。然而，如何分支形态发生与细胞增殖和分化的胰腺中的协调在很大程度上是未知的。这部分是由于这些发育过程的了解，目前几乎完全依赖于固定标本的分析，而形态发生的事件是高度动态的。
在这里，我们提出一个用于解剖的方法和培养小鼠胚胎胰腺芽体外玻璃 底的菜肴，可以直接可视化的胰腺（ 图1）。这个邪教余吕杏茜系统是理想的设计，激光扫描共聚焦显微镜，特别是活细胞成像。胰腺外植体可以不仅从野生型小鼠胚胎制备，但也从遗传工程小鼠品系（ 例如转基因或基因敲除），允许实时的突变表型的研究。此外， 体外培养系统是值得研究的化学化合物对胰腺发育的影响，从而获得定量数据的增殖和生长，延伸，分支，tubulogenesis和分化。总之，的体外胰腺外植体培养法结合高分辨率成像的发展提供了一个强大的平台，观察形态发生和分化的事件发生，因为他们在发育中的小鼠胚胎。
Protocol
已经适应这里描述的协议，从技术最初描述的波斯 富街和松弛9共聚焦显微镜和优化。
1。涂层的玻璃底培养皿
应进行以下步骤，在无菌条件下在层流罩中。
- 胰腺外植体培养在35毫米的培养皿中，用直径为20毫米的玻璃微孔底部公司（ 例如 MatTek Corporation）。使用一个玻璃底菜，每外植体培养的整个期间的文化。在一天前的胰芽，涂在玻璃底部微孔纤维连接蛋白的解剖和隔离。
- 细胞培养级水稀释无菌纤连蛋白在50μg/ ml的最终浓度，并添加最小体积的（约150微升）到20毫米的微孔的MatTek板覆盖整个玻璃表面上（ 图1E）。将菜在4℃冰箱中过夜培养。
- 在当天的清扫，吸出纤维连接蛋白，细胞培养级水冲洗微孔，增加的最小容积150微升BME（基础培养基鹰）培养基青/链霉素（1％），谷氨酰胺（1％ ）和50微克/毫升庆大霉素[解剖中等]。在层流罩板的外植体，直到准备离开涂层的菜肴。
如果不是所有的纤连蛋白涂覆的菜肴被使用，它们可以被存储长达1周在4℃下不要让菜干，夹层中填充它们，并将其放置在冰箱中。
除了 对纤连蛋白，胰腺外植体已经成功培养在各种基材上，例如为9层粘连蛋白，基质胶10,11或微孔膜12。由于其对分枝的效果，我们使用作为底物的纤维连接蛋白9。
2。解剖的Dorsal的胰芽从E11.5 - E12.5小鼠胚胎
- 定时怀孕的雌性小鼠在胚胎天（E），11.5或12.5的牺牲和胚胎收集使用解剖仪器，以前用70％乙醇清洗。将解剖子宫在含有补充有50微克/毫升庆大霉素的冰冷的PBS的10-cm的板。
- 体视显微镜下成单独的胚胎段，用小剪刀或杜蒙钳轻轻剥离远离子宫的肌肉和删除单个胚胎，蜕膜组织所包围，从上面的，独立的子宫照明。使用标准的胚胎解剖技术13，揭露的胚胎和删除卵黄囊和羊膜。接着，取出胚胎（上方的肝脏）和尾部区域的上半身。这将允许内部器官（ 图1B）的曝光。中期体胚胎转移到10厘米的板含有冰冷BME夹层介质。
- 现在从下面只使用透，可视化和背胰芽体视显微镜下解剖。轻轻地，打开中期的胚胎体的横向切口，用血管钳。找到胃和脾。背胰芽横向安装到后方区域的胃（ 图1C）。使用蒙特镊子，解剖走背胰芽从邻近结构，如胃和脾脏，但留下了一些间充质细胞周围的上皮细胞（ 图1D）。使用玻璃巴斯德吸管，转移成一个35毫米的培养皿中含有冷的BME夹层培养基后，用10％胎牛血清的[培养基]孤立芽。重复上述步骤，直到所有胰腺被隔离。如果胰腺不同基因型是孤立的，让他们分开使用Nunc公司4孔板。
3。胰腺外植体的电镀和文化
最终平台ING的外植体进行组织培养室和/或在邻近的组织培养箱培养，以尽量减少的物理运动。
- 在层流罩中无菌条件下，取代的BME夹层中等，纤连蛋白涂覆MatTek菜肴预先温热在37〜150微升的BME培养基℃。
- 小心，胰腺外植体转移到的涂层MatTek菜肴（每道菜的一个外植体）长期培养使用玻璃巴斯德吸管。要确保文化的传播过程中，外植体周围的间充质可以稍微撕裂，如果必要的话，用细针。
- 轻轻地，放置在培养的组织培养箱（37℃，5％CO 2）的几个小时内，让外植体附加到玻璃底微孔。一旦它们所连接，填补MatTek菜肴预先温热的BME培养基中的1.5毫升〜2毫升在37℃下夹层的天被称为第0天。
- 曼ipulation的胰腺外植体培养的是，在层流罩中无菌条件下进行的。 BME培养基改为隔日，，除非实验要求规定不同的时间（ 如培养的外植体，用化学药剂）。的外植体可以在此条件下培养5天至一周。
4。整个安装胰腺外植体免疫荧光染色协议
所有步骤的的免疫荧光协议（固定成像）进行在同一MatTek的一道菜，产生更好的图像比塑料底的菜。固定后，胰腺外植体的培养并不需要保持在无菌条件下。
- 吸BME培养基，2毫升1X PBS清洗一次外植体。
- 外植体固定，取代用2ml冰冷的4％多聚甲醛（PFA）的PBS的培养皿放置在冰上20分钟。轻轻地从时间旋流板时间，但要避免摇摆平台，为外植体分离。
- 移除PFA和用2毫升，每次10分钟，在室温（RT）的1X PBS冲洗外植体三次。
- 块用2毫升封闭溶液（1X PBS + 0.1％的Triton-X + 3％驴血清）为至少30分钟，在RT。
- 一次抗体，在封闭溶液稀释，并〜150微升的稀释液添加到20毫米的微孔的MatTek板覆盖，在4℃下培养过夜的整个外植体表面直接为了减少体力的运动，加入一抗外植体直接在冷室（4°C）。为了防止水分蒸发，增加抗体之前，将MatTek板在潮湿的室内。
- 第二天，除去抗体溶液，并用2毫升的1X PBS洗涤三次+ 0.1％Tween-20的（PBT）的为每个在RT 30分钟。
- 根据制造商的建议稀释的二抗封闭液，我们使用的是驴的Alexa Fluor染料二抗机构在1:750稀释，并添加150微升稀释液直接到20毫米的微孔的MatTek板，覆盖整个外植体表面，在室温下培养1-2小时在黑暗中。对于核counterstaining，包括赫斯特连同第二抗体稀释液。为了防止水分蒸发，增加抗体之前，将MatTek板在潮湿的室内。
- 洗涤三次，用2毫升的1X PBS + 0.1％Tween-20的（PBT）的30分钟，在RT。
- 在安装之前，用1X PBS清洗一次，以消除吐温20。通过添加1滴水溶液安装介质（带防褪色）到20毫米的微孔的MatTek板安装。轻轻地，一个盖玻片覆盖的外植体。避免气泡。
- MatTek板的外植体对可以根据标准相衬显微镜或共聚焦显微镜，观察取决于实验的目标上。共聚焦显微镜分析中，我们使用了蔡司LSM 700倒置的设置。设置适当的激光器的荧光基团我们编辑。选择一个目标，将图像的胰腺外植体所需的区域。阿10X的水浸入的目标是合适的，以保持整个外植体中的视场。 40倍的水或油浸泡的目标是合适的专注于特定区域的胰腺外植体更高的分辨率。的外植体可以是光学切片，然后所取得的Z-堆栈在3D重建，使用适当的软件。
5。胰腺外植体活细胞成像协议
- 环境室设置：[使用环境的外壳和一个小型孵化室温度和CO 2控制]坐落在显微镜载物台的。正确培养的胚胎胰腺需要一个稳定的温度为37℃和湿润的5％CO 2的受控气氛。来自多个供应商提供合适的房间是 （ 例如 ，蔡司，尼康，奥林巴斯）。组装的加热箱中，并把它在一个吨至少1小时开始成像之前，以允许设备预热并平衡至5％的CO 2含量。
- 我们对于时间的推移成像胰腺外植体培养，使用蔡司LSM 700倒置显微镜。激光器和目标选择，见4.10点。
- 让胰腺外植体附着到玻璃底的菜才开始实时成像。我们通常开始的第1天]进行实时成像。
在层流罩中，吸液和替换的外植体的培养基用新鲜的BME培养基从最佳营养条件。 - 轻轻的外植体转移到显微镜室和放置的MatTek的培养皿中孵化室，试样架共聚焦显微镜。
- 准备的目标（ 例如，油或水介质添加根据浸没物镜的选择），并集中在感兴趣的区域中的外植体。正确关闭的环境室。为了防止蒸发在时间的推移中采集与浸水目标，代替水，它是推荐使用粘性的浸没流体是市售的（ 例如蔡司Immersol W）。
- 设置激光强度栈Z-采集的参数和时间间隔（见故障排除还讨论）。开始实验。
- 成像后，出口ž堆栈和所有的时间点，并分析他们使用合适的软件（ 如 ImageJ的，Volocity，Imaris，惠更斯）。
6。代表性的成果
背胰芽（连同周围的间充质细胞）进行了解剖，从小鼠胚胎E11.5和E12.5和直接镀在玻璃底培养皿（ 图1）。血管是存在于周围的上皮细胞的间充质细胞，可以被可视化的内皮标志物PECAM 12（数据未示出）通过免疫染色。经过两天的文化，胰腺外植体UNDerwent显着增长，并开始组织起来，支上皮结构，其细胞核呈阳性的胰腺转录因子，PDX1（ 图2A-C）。平均胰腺外植体在第3天的文化Z-厚度为60-80微米。外植体的表面和体积的测量可以使用适当的软件（ 例如惠更斯）。形态学和免疫荧光分析表明，胰腺外植体培养，使用此协议的概括在体内的胰腺癌早期分化和形态发生的事件5,10,11,14（ 图2）。胰腺外植体天4文化上接受了典型的“尖和主干”偏析上皮8，显示CPA1 +祖细胞在上皮分支（ 图2C）和分化胰岛素+和胰高血糖素+细胞簇后备箱内组织的尖端（ 图2D ）。此外，胰腺炎Ç显示正确的上皮细胞在体外培养细胞骨架组织和细胞极性，心尖部本地化的F-肌动蛋白（ 图2E，绿色）和b1整合在基膜（ 图2E，红色）。
为研究胰腺分支的实时，胚胎胰腺外植体分离的双基色荧光灯记者的小鼠品系membrane-Tomato/membrane-Green 15（吨/毫克;在杰克逊实验室小鼠品系）（ 图3）。随时间推移电影万吨/ MG胰腺外植体在培养基中培养从静止帧， 如图3所示。本地化的MT荧光蛋白膜结构勾勒细胞形态及精细胞的过程，随着时间的推移，能够跟踪细胞重塑和迁移使分辨率。
经过12个小时的时间推移实验MT荧光信号仍然是可行的，DETEctable，即使它的强度降低，最有可能是由于光损伤（ 图3）。在讨论中讨论的技术解决方案，以避免或减少光损伤和光毒性。
图1。从E12.5小鼠胚胎背侧胰芽解剖示意图。 （A）明E12.5小鼠胚胎。胚胎的上半身（上方的肝脏）和尾部区域中除去隔离中期体（B）。切口红色虚线所示。 （C）进一步解剖的曝光结果，胃和十二指肠的区域（由虚线框表示）。背胰芽（见红色虚线圆圈）是在该基地的胃和脾原基。用巴斯德移液管转移到玻璃底培养皿含有BME培养基中的微孔（E解剖背胰芽（D）的的F）。缩写：STO（胃），SP（脾），DP（背胰芽），双核（十二指肠）。比例尺，1000微米（A，C）。
图2。整个安装共聚焦免疫荧光分析胰腺外植体培养。 （A）明图像的胰腺外植体对体外培养的第1天，第2天的。红色虚线显示的上皮分支的开始。 （B）免疫组化三维重建整个安装PDX1在第3天胰腺文化。胰腺外植体显示管PDX1 +细胞48小时的文化进行广泛的分支。 （C）所有安装免疫的第3天胰腺外植体抗体基底膜标记E-cadherin蛋白（ECAD），尖祖标记，羧肽酶1（CPA1）和磷酸化组蛋白H3（pHH3）。大多数的有丝分裂活性pHH3 +细胞共定位在周与CPA1 +细胞的提示。虚线升国际核事件分级小费的分支机构。 （D）整体安装的的免疫内分泌的血统标志物，胰岛素（Ins）和胰高血糖素（Gluca）在第3天。黄色箭头指示集群的INS + Gluca +细胞。插入（D'）中，高倍率的内分泌细胞集群之一。 （E）所有安装的第3天胰腺外植体免疫PDX1，β1整合素（β1int）和F-肌动蛋白（事实）。穿插其中PDX1阳性上皮细胞的间充质细胞（星号）。在C，D和E所示的画像是单一的共焦光学部分的Z系列。比例尺，100微米（A，B），50微米（CE）。
图3。 体外培养的胰腺外植体活细胞成像的代表。 （AD）的帧从一个MT / MG小鼠转基因胚胎胰腺外植体随时间推移电影。成像时示出在“小时：分钟。第1天开始，外植体成像。 Z-堆栈的图像被收购总量的15小时，每12分钟为一个40倍油浸物镜。虚线表示翻倒的分行及上皮细胞和间充质之间的边界。比例尺，50微米。
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Discussion
胰腺癌的命运一旦被指定，进行广泛的胰腺祖细胞的增殖，分化和形态，最终形成一个成熟的，功能性的器官2,4。目前，如何分支发生在胰腺和它是如何连接到祖细胞增殖和分化在很大程度上是未知的。胰腺外植体培养代表阐明这些过程的体外 5,9,11一个理想的系统。与早期胰腺癌芽体外植活细胞成像相结合，可以得到一个清晰的画面在胚胎胰腺形态发生过程中发生的事件。这个的视频文章提出了一种简单的方法建立体外培养的胚胎胰腺上的玻璃的支持，这使得它们非常适合用于整个安装免疫荧光和实时成像。
无数的例子使用的成像C 体外胰腺外植体埃尔形态，生长和分化都在这里。更重要的是，这些例子表明，胚胎体外胰脏培养，使用此协议的体内胚胎胰腺发育2,3模仿的早期阶段。例如，分支发起E11.5胰腺电镀约24小时后，如预期在体内 （图2A）。虽然形态发生和细胞分化中的文化非常相似， 在体内 ，外植体的整体增长是没有可比性的，大大小于看到在胚胎发育。这里描述的培养条件下，胰腺外植体停止生长在一个星期后（数据未示出），在第5天，并进行变性。因此，报告的体外培养系统是有限的，更适合早期胰腺器官方面的调查。
我们在座的体外培养个例子在我们建立了从野生型MT / MG记者小鼠胚胎。实时成像荧光报道应变的使用是不可缺少的，使细胞和亚细胞结构和它们的动力学研究在3D环境中的可视化。例如，本地化的MT荧光蛋白膜结构使我们能够精确可视化细胞形态和跟踪的细胞改造和迁移随着时间的推移在胰腺外植体。其中一个最常见的问题和限制在活细胞成像实验是可能发生的结果反复暴露于激发荧光照明的光损伤。在一般情况下，一个具有平衡的上下文中，其自己的实验设置图像质量的光毒性。比如，以尽量减少光损伤的一种可能性是，以减少频率的成像和增加的时间间隔，连续的帧之间，或者也可以，以优化的Z堆叠收购通过减少光学片的数量。
最后，体外培养的胚胎胰腺是一个有价值的系统筛选化合物和胰腺发育的影响。的化合物或因素可以直接加入到培养基中，并发育的效果，能够容易地在显微镜下进行评估。使用数据分析软件，甚至可以得到有关的增殖和生长，伸长率，支化，tubulogenesis和分化的定量数据。另外，也可以使用转基因或基因敲除的组织建立器官培养或进行更快的增益和损失的功能外植体的实验中，例如，通过慢病毒转导或吗啉代基的寡核苷酸，分别（数据未示出）。所有这些方法都将进行实时的突变体的表型和基因调控网络的进一步了解，在发展中国家胰腺的研究。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
研究 Spagnoli实验室。是由亥姆霍兹联合会，FP7-IRG-2008-ENDOPANC补助金及ERC-2009年开始肝胰腺津贴。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
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