Summary
Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir temsil
Abstract
Pankreas sindirim enzimleri ve kan şekeri düzeylerini 1 düzenlenmesi üretimi dahil olmak üzere vücudun hayati fonksiyonları kontrol eder. Geçtiğimiz on yıl içinde birçok çalışma pankreas organogenez anlamak için sağlam bir temel katkıda bulunmuş olsa da, önemli boşluklar erken pankreas oluşumu 2 bilgimizi devam etmektedir. Bu erken olayların tam bir anlayış bu organın gelişimini içgörü sağlayabilir, ama aynı zamanda, diyabet veya pankreas kanseri gibi pankreas hedef tedavi edilemez hastalıklar, girer. Son olarak, bu bilgi diyabet kapsamında hücre-değiştirme tedavileri geliştirmek için bir şablon oluşturur.
Embriyo oluşumu sırasında, pankreas embriyonik gün dorsal ve ventral foregut endodermal fare embriyo 3,4 (E) 9,5 farklı embriyonik çıkıntılar meydana gelmektedir. Hem çıkıntılar sağlam epitel olarak çevredeki mezenşimi içine tersyüz etmektam olgun organı 2,5,6 oluşturmak için dallanma ve farklılaşması, proliferasyonu geçmesi l tomurcukları. Son bulgular insülin üreten β-hücreleri dahil olmak üzere pankreas hücre soylarının, büyüme ve farklılaşma dallanma pankreas epiteli 7,8 içinde uygun doku mimarisi, epitel şekillenmesi ve hücre konumlandırma bağlıdır ileri sürmüşlerdir. Ancak, morfolojilerinden dallanma nasıl oluşur ve pankreasta proliferasyon ve farklılaşma ile koordine edilir ölçüde bilinmemektedir. Bu morfogenetik olaylar son derece dinamik ise bu gelişim süreçleri hakkında güncel bilgi, sabit numunelerinin analizi neredeyse sadece güvendi olması nedeniyle kısmen olduğunu.
Burada, diseksiyon ve gelişmekte olan pankreas (Şekil 1) doğrudan görüntülenmesine izin cam alt yemekleri hakkında kültürleme fare embriyonik pankreas tomurcukları ex vivo için bir yöntem sunulmuştur. Bu külture sistemi ideal Özellikle, canlı hücre görüntüleme, konfokal lazer tarama mikroskopi için tasarlanmış ve. Pankreatik eksplantlar, sadece yabani-tip fare embriyolarından hazırlanmış, fakat, aynı zamanda genetik mühendisliği fare suşu (örneğin, transgenik veya nakavt) için, mutant fenotipleri gerçek zamanlı çalışmalar sağlayan edilebilir. Dahası, bu ex vivo kültür sistemi çoğalması ve büyümesi, uzama, dallanma, tubulogenesis ve farklılaşması ile ilgili nicel veriler elde etmek sağlayan, pankreas gelişimi üzerinde kimyasal bileşiklerin etkilerini incelemek için değerlidir. Sonuç olarak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile kombine bir ex vivo pankreas eksplant kültür yöntemi geliştirilmesi de gelişmekte olan fare embryo içinde meydana gibi morfogenetik ve farklılaşma olayları gözlemlemek için güçlü bir platform sağlar.
Protocol
Burada açıklanan protokol başlangıçta Percival ve Bolluk 9 açıklanan ve konfokal mikroskopi için optimize tekniği adapte edilmiştir.
1. Glass Bottom Kültür Yemekleri Kaplama
Aşağıdaki adımları bir laminar akış başlık steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
- Pankreas eksplantları 20-mm çaplı cam mikro alt (örneğin Mattek Corporation) ile 35 mm Petri kapları içinde kültüre. Eksplant kültür başına ve kültürün tüm süresi için bir cam alt tabak kullanın. Pankreas tomurcukları, ceket fibronektin ile cam alt mikro diseksiyonu ve öncesi izolasyon gününde.
- 50 ug / ml nihai konsantrasyonuna kadar hücre kültürü kaliteli su içinde steril fibronektin seyreltilir ve bütün cam yüzeyi (Şekil 1E) kapsayan Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine, en az miktarda (~ 150 ul) ilave edin. Bulaşıkları yerleştirinizgecelik inkübasyon için 4 ° C'de buzdolabında.
- Diseksiyon gününde, fibronektin aspire hücre kültürü dereceli su ile mikro durulayın ve BME 150 ul (Bazal Orta Eagle) Kalem / Strep (% 1), Glutamin (% 1 ile desteklenmiş orta minimum hacim ekleme ) ve 50 mg / ml gentamisin [Diseksiyon Orta]. Plaka eksplantlar hazır olana kadar laminer akış kaputu kaplı yemekleri bırakın.
Tüm fibronektin kaplı yemekler kullanılırsa, bunlar 4 ° C'de 1 hafta kadar saklanabilir Yemekleri, kuru Dissection Orta ile doldurun ve buzdolabında koyun izin vermeyin.
Fibronektin ek olarak, pankreas eksplantlar başarılı bir şekilde bu gibi laminin 9, Matrigel 10,11 veya 12 mikro-gözenekli membran gibi çeşitli yüzeyler üzerinde kültive edilmiştir. Çünkü dallanma üzerindeki etkileri, biz substrat olarak fibronektin 9 kullanın.
2. D DiseksiyonE11.5 gelen orsal Pankreas Bud - E12.5 Fare Embriyolar
- Embriyonik gün (E) 11.5 veya 12.5 Zamanlı gebe dişi fareler kurban ve embriyolar önceden% 70 Etanol ile temizlenmelidir diseksiyon aletleri kullanılarak toplanmıştır. 50 ug / ml gentamisin ile takviye buz gibi soğuk PBS içeren 10 cm'lik bir levha halinde parçalara rahim yerleştirin.
- Yavaşça desidua çevrili uzak rahim kas ve bireysel embriyolar kaldırmak, soyulma, küçük makas veya Dumont forseps kullanarak bireysel embriyo segmentleri içine yukarıdaki ayrı rahim aydınlatmaya sahip bir stereomikroskopta altında. Embriyolar maruz ve yolk kesesi ve amniyon kaldırmak için 13 standart embriyo diseksiyon teknikleri kullanın. Daha sonra, embriyonun üst vücut (karaciğer yukarıda) ve kuyruk bölgesi çıkarın. Bu iç organlar (Şekil 1B) maruz sağlayacaktır. Buz BME diseksiyon orta içeren 10 cm tabak içine embriyo orta gövde aktarın.
- Şimdigörselleştirmek ve stereomikroskop altında dorsal pankreatik tomurcuk incelemek için aşağıda sadece transillüminasyon kullanın. Yavaşça, forseps ile lateral kesi yaparak embriyonun orta gövde açın. Mide ve dalak bulun. Dorsal pankreatik bud midenin arka bölgesi (Şekil 1C) yanal olarak eklenir. Dumont forseps kullanarak, örneğin mide ve dalak gibi komşu yapıları, gelen dorsal pankreatik bud uzaklıkta teşrih, ama (Şekil 1D) epiteli çevresindeki bazı mezenşimi bırakarak. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak,% 10 fetal buzağı serumu [Kültür Orta] ile takviye soğuk BME diseksiyon orta içeren bir 35 mm Petri kabı içine izole tomurcuk aktarın. Tüm pancreata izole edilene kadar bu adımları tekrarlayın. Farklı genotiplerin pancreata izole edilir, bunları Nunc 4-kuyucuğu kullanarak ayrı tutmak.
3. Pankreas Eksplantlarından arasında Kaplama ve Kültür
Nihai plateksplant kültürleri ing fiziksel hareketini en aza indirmek için doku kültür odası ve / veya doku kültürü kuluçka makinesi yakın olarak gerçekleştirilir.
- Bir laminer akış kaputu steril koşullar altında BME kültür ortamı ~ 150 ul fibronektin kaplı Mattek yemekler 37 önceden ısıtılmış ° C. BME Diseksiyon Orta değiştirin
- Dikkatlice, bir cam Pasteur pipeti kullanarak uzun süreli kültür için kaplamalı Mattek yemekleri (çanak başına bir eksplant) içine pankreas eksplantlar aktarın. Kültür esnasında yayma temin etmek için, eksplantlar çevreleyen hafifçe mezenşim ince bir iğne ile, gerekirse, yırtık olabilir.
- Yavaşça, bir doku kültürü inkübatör kültürleri yerleştirin (37 ° C;% 5 CO 2) eksplantlar cam alt mikro eklemek izin birkaç saat için. Bir kez onlar önceden ısıtılmış 37 SEA kültür ortamı 1.5 ml 2 ml Mattek yemekleri doldurmak °, ekli C. Disseksiyon gün 0. gün olarak ifade edilir.
- ManPankreatik eksplant kültürleri ipulation bir laminar akış başlık içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Deneysel gereksinimleri farklı zamanlama (kimyasal ajanlarla eksplant örneğin inkübasyon) dikte sürece BME kültür ortamı, her gün değiştirilir. Eksplantları bir hafta ila 5 gün için bu durum içinde yetiştirilebilir.
4. Pankreas Eksplantlarından için Tüm montaj İmmünofloresan Boyama Protokolü
Immünofloresan protokolünün tüm adımları (fiksasyon görüntülemeye) bir plastik dipli çanak daha iyi görüntü verir, aynı Mattek çanak yürütülmektedir. Tespit edildikten sonra, pankreas eksplant kültürleri steril koşullar altında tutulması gerekmez.
- BME kültür ortamı aspire ve 2 ml 1X PBS ile bir kere eksplant yıkayın.
- Eksplant fiksasyon için 2 ml buz-soğuk% 4 paraformaldehid (PFA) ile PBS değiştirin ve 20 dakika buz üzerinde çanak yerleştirin. Zaman levha Girdap yavaşçazaman, ama eksplant ayırmak olabilir gibi, sallanan platformlar kaçının.
- PFA çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika her biri için 1X 2 ml PBS ile eksplant üç kez yıkayın.
- 2 ml engelleme çözeltisi ile blok (1X PBS +% 0.1 Triton-X +% 3 eşek Serum) oda sıcaklığında en az 30 dak.
- Çözelti, blokaj birincil antikor ile seyreltilir ve 4 gece boyunca inkübasyon için eksplant bütün yüzeyi kaplayan ° C. Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine direkt olarak seyreltme ~ 150 ul ekle , Fiziksel hareketleri minimize doğrudan soğuk oda (4 ° C) eksplantlar primer antikor eklemek için. Buharlaşmanın önlenmesi için, antikor eklemeden önce, nemli bir odaya Mattek plakaları yerleştirin.
- Ertesi gün antikor çözeltisi kaldırmak ve 2 ml 1X PBS ile üç kez yıkama +% 0.1 Tween-20 ile oda sıcaklığında 30 dakika her biri için (PBT).
- Çözümü engelleme ikincil antikor sulandırınız [üretici tavsiyelerine göre, biz eşeği Alexa Fluor boyalar ikincil önleyici kullanın1:750 seyreltme] ve karanlıkta oda sıcaklığında, 1-2 saat inkübasyon için, bütün yüzeyi kaplayan eksplant Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine, doğrudan doğruya seyreltme ~ 150 ul eklemek de organları. Nükleer counterstaining için, ikincil antikor seyreltme ile birlikte Hoechst içerir. Buharlaşmanın önlenmesi için, antikor eklemeden önce, nemli bir odaya Mattek plakaları yerleştirin.
- 2 ml 1X PBS ile üç kez yıkanır +% 0.1 30 dakika için oda sıcaklığında her bir Tween-20 (PBT).
- Monte etmeden önce, Tween-20 kaldırmak için 1X PBS ile bir kez yıkayın. Mattek plakaların 20 mm kuyucuk içine monte sulu ortam, bir damla (anti-solma ile) ilave edilerek monte edin. Yavaşça, bir cam lamel ile eksplant kapsamaktadır. Hava kabarcıkları kaçının.
- Mattek plakaları Eksplantlarından deney hedeflerine bağlı olarak, standart faz kontrast mikroskobu veya konfokal mikroskopi altında görülebilir. Konfokal mikroskopi analizi için bir Zeiss LSM 700 ters ayarını kullanın. Bizi floroforlar uygun lazerler ayarlamaed. Objektif bir seçim bu olacak görüntü pankreas eksplant istediğiniz alanı. 10X bir su-daldırma objektif görüş alanının tamamını eksplant tutmak için uygundur. A 40X su veya yağ-immersiyon hedefleri daha fazla çözünürlüğe sahip pankreas eksplant belirli bölgelerine odaklanmak için uygundur. Eksplantları optik kesit ve sonra edinilen Z yığınları uygun bir yazılım kullanarak, 3D yeniden olabilir.
5. Pankreas Eksplantlarından Canlı hücre Görüntüleme Protokolü
- Çevre odası kurulumu: bir çevre muhafaza ve küçük bir inkübasyon odası kullanımı mikroskop sahne üzerine oturur [Sıcaklık ve CO 2 kontrolü ile]. Embriyonik pankreas Özgün kültür 37 ° C ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 bir atmosfer kontrollü bir sabit sıcaklık gerektirir. Uygun odaları çeşitli satıcılar mevcuttur (Örneğin, Zeiss, Nikon, Olympus). Isıtıcı kutusunda birleştirin ve üzerine açıngörüntüleme önce t en az 1 saat ekipmanları ısınmak ve% 5 CO 2 içeriğini denge için izin başlar.
- Pankreas eksplant kültür time-lapse görüntüleme için, biz bir Zeiss LSM 700 inverted mikroskop kullanın. Lazerler ve objektif seçimi için noktası 4.10.
- Pankreas eksplant canlı görüntüleme başlamadan önce iyice alt kısmı cam tabak eklemek edelim. [Biz genellikle canlı görüntüleme 1. Gün başlayan gerçekleştirmek].
Bir laminer akış kaputu, aspirat ve optimum besin koşulları ile başlamak taze BME besiyeri ile eksplant orta değiştirin. - Yavaşça mikroskop odasına eksplantlar aktarın ve konfokal mikroskop numune tutucu içine kuluçka odasında Mattek çanak yerleştirin.
- Nesnel hazırlayın (örneğin immersiyon objektif seçimi uygun yağ veya su-orta ekleyin) ve eksplant ilgi bölgeye odaklanır. Çevre bölmesi düzgün şekilde kapatın. Time-lapse sırasında buharlaşma önlemek içinsu yerine su daldırma hedefleri ile edinimi, bu (örneğin Zeiss İmmersol B) piyasada bulunmaktadır viskoz immersiyon sıvıları kullanılması tavsiye edilir.
- Lazer yoğunluğu, Z-yığını toplama parametreleri ve zaman aralığı (Sorun Giderme için de Tartışma bakınız) ayarlayın. Denemeyi başlatın.
- Görüntüleme, ihracat Z yığınları ve tüm zaman noktalarında sonra ve uygun yazılımlar (örneğin ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens) kullanarak onları analiz.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Dorsal pankreas tomurcukları (birlikte çevredeki mezenşimi ile) E11.5 ve E12.5 ve doğrudan cam alt kültür kaplarına (Şekil 1) kaplamalı arasındaki fare embriyoları diseke edildi. Kan damarları epiteli çevreleyen mezenşimi bulunan ve endotelyal işaretleyici Pecam 12 (veriler gösterilmemiştir) için immünboyama ile görülebilmesi. Kültür, pankreas eksplantlar und iki gün sonraönemli bir büyüme erwent ve kimin çekirdekleri pankreas transkripsiyon faktörü pozitif olan dallı epitelyal yapılar, Pdx1 (Şekil 2A-C) kendilerini organize etmeye başladı. Kültürün 3. gününde pankreas eksplant ortalama z kalınlığı 60-80 mikron olduğunu. Eksplant yüzeyi ve hacmi uygun yazılım programları (örn. Huygens) kullanılarak ölçülebilir. Morfoloji ve immünofloresan analizleri pankreas eksplantlar in vivo erken pankreas farklılaşma ve morfogenetik olaylar 5,10,11,14 (Şekil 2) değinmeyecek bu protokolü kullanarak kültürlü olduğunu gösterdi. Kültürünün 4. günde Pankreas eksplantlar tipik "ucu ve gövde" cpa1 gösteren epitelin 8 segregasyon, + Bagajındaki kümeleri olarak organize epitel dalları (Şekil 2C) ve farklılaştırılmış insülin + ve glukagon + hücrelerinin uçları progenitör hücreler (Şekil 2B yapıldı ). Buna ek olarak, pancreatiex vivo kültürlerde c epiteli bazal membran (kırmızı Şekil 2E,) az apikal F-aktin lokalizasyonu (Şekil 2E, yeşil) ve b1-integrin ile, uygun hücre iskeleti organizasyon ve hücre polarite gösterdi.
(; Fare zorlanma Jackson Laboratuvarı mevcuttur mT / mG) (Şekil 3) gerçek zamanlı olarak dallanma pankreas incelemek için, embriyonik pankreas eksplantlar çift renkli flüoresan raportör fare zorlanma membrane-Tomato/membrane-Green 15 izole edildi. Yine kültür içinde yetiştirilir mT / mg pankreas eksplant bir süre hızlandırılmış film kareler Şekil 3 'de gösterilmiştir. Membran yapıları mT floresan protein lokalizasyonu hücre morfolojisi özetliyor ve zamanla hücre yenileme ve göç izlemek sağlayan, ince hücresel süreçleri çözünürlük sağlar.
12 saat time-lapse deneyden sonra mT floresans sinyali uygun ve dete kalırctable, yoğunluğu büyük olasılıkla fotohasar nedeniyle (Şekil 3), azalmış olsa bile. Fotohasar ve fototoksisite önlemek veya azaltmak için teknik çözümler Tartışma bölümünde ele alınmıştır.
Şekil 1. E12.5 fare embryo gelen dorsal pankreas tomurcuğu diseksiyon şematik gösterimi. E12.5 fare embriyo (A) aydınlık görüntü. Embriyo (karaciğer yukarıda) ve kuyruk bölgenin üst vücut orta gövde (B) ayırmak için kaldırılır. Kesikler kırmızı noktalı çizgilerle gösterilir. Mide ve onikiparmak bağırsağı bölgenin pozlama (noktalı kutu ile gösterilir) (C) Ek diseksiyon sonuçları. Dorsal pankreatik bud (kırmızı noktalı bir daire bakın) mide ve dalak primordium'un yanında dibinde olduğunu. Disseke dorsal pankreatik bud (D) BME kültür ortamı içeren bir cam alt yemeğin Mikro (E içine bir Pasteur pipeti ile aktarılır, F). Kısaltmalar: sto (mide), sp (dalak), dp (dorsal pankreatik tomurcuk), ikili (duodenum). Ölçek çubuklar, 1000 um (A, C).
Şekil 2. Pankreas eksplant kültürleri Tüm montaj konfokal immünofloresan analizi. 1. gün ve ex vivo kültür günde 2 pankreatik eksplant (A) aydınlık görüntüler. Kırmızı noktalı çizgi epitelin dallanma başlatılması gösterir. Bütün montaj (B) 3D rekonstrüksiyon gün 3 pankreas kültür Pdx1 için immünboyama. Pankreas eksplant kültür 48 hr tarafından kapsamlı dallanma geçiren Pdx1 + hücrelerinin tübül gösterdi. Bazolateral membran işaretleyici E-kaderin (ECAD), ucu progenitör marker, karboksipeptidaz 1 (Cpa1) ve fosfor-Histon H3 (pHH3) karşı antikorlar ile günde 3 pankreatik eksplant (C) Tüm montaj immün. Etkin mitotik pHH3 + hücrelerin çoğu Cpa1 + hücreleri ile periferik ipuçları colocalize. Kesik lines dal ucu göstermektedir. Endokrin soy belirteçler, insülin (Ins) ve 3. günde glukagon (Gluca) için (D) Tüm montaj immün. Sarı ok İnş kümeler + ve Gluca + hücreleri gösterir. Ankastre (D '), endokrin hücresi kümesinin bir yüksek-büyütme. Pdx1, β1 integrin (β1int) ve F-aktin (Fact) için günde 3 pankreatik eksplant (E) Tüm montaj immün. Pdx1-pozitif epitel hücreleri arasında serpiştirilmiş Mezenkimal hücreler (yıldız). C, D, ve E de gösterilen Görüntü Z-dizi tek konfokal optik kesitlerdir. Ölçek çubuklar, 100 um (A, B), 50 um (CE).
Şekil 3. Ex vivo kültüre pankreas eksplant Temsilcisi canlı hücre görüntüleme. Bir mT / mG fare transgenik embriyo bir pankreas eksplant bir time-lapse film (MS) Çerçeveler. Dakika görüntüleme süre saat cinsinden gösterilmiştir. Eksplant Gün 1 başlayarak görüntülendi. Z-yığın görüntüleri40X yağ immersiyon objektif 15 saat olmak üzere toplam her 12 dk ile elde edildi. Kesik çizgiler epitel ve mezenşimi arasındaki şube ve sınırın ucu belirtin. Ölçek çubuğu, 50 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pankreas kaderi belirtildiğinde sonra, pankreas progenitör hücreler sonunda olgun ve fonksiyonel bir organdır 2,4 oluşturmak için kapsamlı çoğalma, farklılaşma ve morfonogenezi tabi. Şu anda, dallanma nasıl pankreas yer alır ve nasıl progenitör çoğalması ve farklılaşması bağlı büyük ölçüde bilinmemektedir. Pankreas eksplant kültürleri bu süreçlerin ex vivo 5,9,11 aydınlatmak için ideal bir sistem temsil eder. Erken pankreas tomurcukları ex vivo eksplant ile canlı hücre görüntüleme birleştirerek tek bir embriyo pankreas şekillenmesinde gerçekleşecek olayların net bir resim elde edebilirsiniz. Bu video makalede bütün montaj immünofloresan ve canlı görüntüleme için idealdir cam bir destek üzerinde embriyonik pankreas ex vivo kültürleri kurmak için basit bir yaklaşım sunuyor.
C görüntüleme için ex vivo olarak pankreas eksplant kullanımı çok sayıda örnekell morfolojisi, büyüme ve farklılaşma burada sunulmuştur. Önemlisi, bu örnekler embriyonik bu protokolü vivo embriyo pankreas gelişimini 2,3 erken aşamalarında taklit kullanarak kültürlü ex vivo pankreaslarında olduğunu göstermektedir. In vivo (Şekil 2A) beklendiği gibi Örneğin, dallanma, E11.5 pankreas kaplama sonra yaklaşık 24 saat başlatır. Kültürlerde morfolojilerinden ve hücre farklılaşması yakından vivo olarak görülen benzer iken, eksplant genel büyüme karşılaştırılabilir ve gelişen embriyonun görülenlerden çok daha az değildir. Kültür koşulları burada tarif altında, pankreas eksplantlar günde 5 büyüyen durdurmak ve bir hafta (veriler gösterilmemiştir) sonra dejenerasyon uğrarlar. Bu nedenle, rapor ex vivo kültüre sistemi sınırlı ve pankreas organogenez erken boyutlarının incelenmesi daha uygundur.
Biz burada ex vivo kültürlerin inci örnekler sunmakbiz vahşi-tip yanı sıra mT / mG muhabiri fare embriyoları kurulmuştur. Bir flüoresan raportör suşunun kullanımı hücresel ve hücre içi yapılar ve 3 boyutlu bir ortamda kendi dinamiklerinin çalışmanın görselleştirme sağlayan, gerçek zamanlı görüntüleme için vazgeçilmezdir. Örneğin, membran yapıların mT floresan protein lokalizasyonu bize tam hücre morfolojisi ve pankreas eksplantlar zaman içinde parça hücre yenileme ve göç görüntülenmesine olanak tanımaktadır. Canlı hücre görüntüleme deneylerinde en yaygın sorun ve sınırlama biri floresans uyarma aydınlatma tekrarlayan maruziyetin bir sonucu olarak ortaya çıkabilir fotohasar olduğunu. Genel olarak, bir kendi deneysel ayarlarının bağlamında fototoksisite ile görüntü kalitesi denge vardır. Örneğin, bir fotohasar ihtimalini en aza indirmek için görüntüleme sıklığını azaltmak ve Z yığını elde etme optimize etmek için, alternatif olarak ya da ardışık çerçeveler arasındaki zaman farkı yükseltmek için biroptik dilim sayısını azaltarak.
Nihayet, embriyonik pankreas ex vivo kültür taraması kimyasal bileşikler ve pankreas gelişimine etkileri için değerli bir sistemdir. Bileşik ya da faktör kültür ortamı, doğrudan ilave edilebilir ve gelişimsel etkileri kolayca bir mikroskop altında tespit edilebilir. Veri analiz yazılımı kullanarak bile, birisi çoğalması ve büyümesi, uzama, dallanma, tubulogenesis ve farklılaşması ile ilgili nicel veriler elde edebilir. Bu, organ kültürleri oluşturulması ya da (veriler gösterilmemiştir), sırasıyla, lentivirüs transdüksiyon veya morfolino oligonükleotidler yoluyla örneğin, eksplantlar olarak deney kazanç-kayıp ve fonksiyon-hızlı gerçekleştirmek için transgenik veya nakavt dokulara kullanmak da mümkündür. Tüm bu yaklaşımlar mutant fenotipleri ve gelişmekte olan pankreas gen düzenleyici ağların daha iyi anlaşılmasını gerçek zamanlı çalışmalara olanak sağlayacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Araştırma Spagnoli lab. Helmholtz Topluluğu, FP7-IRG-2008-ENDOPANC hibe ve ERC-2009-Başlangıç HEPATOPANCREATIC Grant tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
