نظام ل Published: August 27, 2012 doi: 10.3791/3979

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kristin M. Petzold¹, Francesca M. Spagnoli¹

¹Molecular and Cellular Basis of Embryonic Development, Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine

Summary

هنا، نحن تصف طريقة للثقافة والعزلة والتلاعب في البنكرياس الماوس الجنينية. هذا يمثل ممتاز

Abstract

البنكرياس تسيطر الوظائف الحيوية من الجسم، بما في ذلك إنتاج الإنزيمات الهضمية وتنظيم مستويات السكر في الدم ^1. رغم أنه في العقد الماضي العديد من الدراسات قد ساهمت في أساس متين لفهم توالد الأعضاء البنكرياس، ثغرات هامة لا تزال قائمة في معرفتنا تشكيل البنكرياس في وقت مبكر ^2. وهناك فهم كامل لهذه الأحداث في وقت مبكر توفير نظرة ثاقبة على تطوير هذا الجهاز، ولكن أيضا في الأمراض المستعصية التي تستهدف البنكرياس، مثل مرض السكري أو سرطان البنكرياس. وأخيرا، فإن هذه المعلومات تولد مخططا لتطوير علاجات استبدال الخلايا في سياق مرض السكري.

خلال مرحلة التطور الجنيني، والبنكرياس تنبع من الامتداد الجنينية متميزة من الأديم الباطن المعى الأمامي الظهري البطني في اليوم والجنينية (E) 9.5 في جنين فأر ^3،4. كلا الامتداد evaginate في اللحمة المتوسطة المحيطة بها ظهائر الصلبةبراعم لتر، التي تخضع الانتشار، المتفرعة والتمايز لإنشاء هيئة ناضجة تماما ^2،5،6. وقد اقترح مؤخرا أن الأدلة نمو وتمايز الخلايا البنكرياسية الأنساب، بما في ذلك الخلايا المنتجة للانسولين β، ويعتمد على إعادة عرض مناسب، والأنسجة الطلائية العمارة وتحديد المواقع داخل الخلية ظهارة البنكرياس المتفرعة ^7،8. ولكن، كيف يحدث المتفرعة التشكل والانتشار وبالتنسيق مع التمايز في البنكرياس غير معروفة إلى حد كبير. هذا هو في جزء منه يرجع ذلك إلى حقيقة أن المعرفة الحالية حول هذه العمليات التنموية اعتمدت بشكل حصري تقريبا على تحليل العينات الثابتة، في حين الأحداث تخلقية حيوية للغاية.

هنا، ونحن التقرير وسيلة لتشريح وزراعة الماوس الجنينية السابقين فيفو براعم البنكرياس على أطباق أسفل الزجاج، والتي تسمح رؤية مباشرة من البنكرياس النامية (الشكل 1). هذا عبادةوضعت بشكل مثالي لدى عودتهم نظام ليزر متحد البؤر المجهري المسح، ولا سيما التصوير الخلية الحية. يمكن إعداد إإكسبلنتس البنكرياس ليس فقط من أجنة الفئران البرية من نوع، ولكن أيضا من سلالات الفئران المعدلة وراثيا (جينيا أو مثل خروج المغلوب)، مما يسمح في الوقت الحقيقي من الدراسات الظواهر متحولة. وعلاوة على ذلك، هذه الثقافة الحية النظام السابق قيمة لدراسة آثار المركبات الكيميائية على التنمية البنكرياس، مما يتيح الحصول على بيانات كمية عن الانتشار والنمو، واستطالة، المتفرعة، tubulogenesis والتمايز. في الختام، وضع البنكرياس المجراة سابقا أسلوب الثقافة يزدرع جنبا إلى جنب مع التصوير عالية الدقة توفر منصة قوية لمراقبة تخلقية والتمايز الأحداث حال وقوعها داخل جنين فأر النامية.

Protocol

وقد تم تكييف البروتوكول الموصوفة هنا من تقنية صفها أصلا في بيرسيفال وسلاك ⁹ و الأمثل للفحص المجهري متحد البؤر.

1. طلاء الزجاج من الأطباق الاستزراع القاعي

وينبغي إجراء الخطوات الآتية تحت ظروف معقمة في الصفحي هود التدفق.

1. يتم استزراع إإكسبلنتس البنكرياس في أطباق بتري 35-20-ملم مع مم القطر الزجاج microwell أسفل (على سبيل المثال شركة ماتيك). استخدام صحن واحد أسفل الزجاج في الثقافة يزدرع وطيلة مدة من الثقافة. في اليوم قبل تشريح والعزلة من براعم البنكرياس، معطف microwells أسفل الزجاج مع فبرونيكتين.
2. تمييع فبرونيكتين معقمة في المياه ثقافة الجودة خلية إلى ميكروغرام 50 / مل تركيز النهائي وإضافة حجم الحد الأدنى من هو (~ 150 ميكرولتر) إلى 20 مم microwell لوحات ماتيك تغطي سطح الزجاج كله (الشكل 1E). ضع الأطباقفي الثلاجة 4 C ° لالحضانة بين عشية وضحاها.
3. في اليوم من تشريح، ونضح فبرونيكتين، شطف بالماء microwell ثقافة الجودة الخلية وإضافة حجم الحد الأدنى من 150 ميكرولتر من BME (بصل متوسطة النسر) متوسطة تستكمل مع القلم / بكتيريا (1٪)، الجلوتامين (1٪ ) و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين [متوسطة تشريح]. ترك الأطباق المغلفة في الصفحي هود تدفق حتى جاهزة للوحة وإإكسبلنتس.

إذا لم يتم استخدام جميع الأطباق فبرونيكتين المغلفة، ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع C. ° 4 لا تدع الأطباق تجف، ملئها متوسطة تشريح ووضعها في الثلاجة.

بالإضافة إلى فبرونيكتين، تم إإكسبلنتس البنكرياس مثقف بنجاح على ركائز مختلفة، مثل laminin ^{9، 10،11} matrigel أو الأغشية الصغيرة التي ^12. لما له من آثار على المتفرعة، ونحن نستخدم فبرونيكتين ⁹ كما الركيزة.

2. تشريح Dorsal براعم البنكرياس من E11.5 - أجنة الفئران E12.5

1. وضحى توقيت-إناث الفئران الحوامل في يوم الجنينية (E) 11.5 أو 12.5 ويتم جمع الأجنة باستخدام أدوات تنظيف تشريح سابقا مع الايثانول 70٪. وضع الرحم تشريح في 10 سم، تحتوي على لوحات الجليد الباردة PBS تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين.
2. تحت stereomicroscope مع الإضاءة من فوق، الرحم إلى أجزاء منفصلة الجنين الفردية باستخدام مقص ملقط صغير أو دومون، بلطف قشر العضلات بعيدا الرحم وإزالة الأجنة الفردية، والتي تحيط بها الساقط. استخدام التقنيات القياسية تشريح الجنين ¹³ إلى فضح الأجنة وإزالة الكيس المحي والسلى. بعد ذلك، قم بإزالة الجزء العلوي من الجسم للجنين (فوق الكبد) ومنطقة الذيل. وهذا سوف يسمح التعرض للأجهزة الداخلية (1B الشكل). نقل الجسم من منتصف الأجنة إلى 10 سم، تحتوي على لوحات الجليد الباردة المتوسطة تشريح BME.
3. الآناستخدام تضوء فقط من أسفل إلى تصور وتشريح البنكرياس الظهرية المهد تحت stereomicroscope. بلطف، افتح منتصف جسم الجنين عن طريق إجراء شق الوحشي مع ملقط. تحديد موقع المعدة والطحال. يتم إرفاق برعم البنكرياس الظهرية أفقيا إلى المنطقة الخلفية من المعدة (الشكل 1C). باستخدام ملقط دومون، تشريح بعيدا المهد البنكرياس الظهرية من الهياكل المجاورة، مثل المعدة والطحال، ولكن ترك بعض اللحمة المتوسطة حول ظهارة (1D الشكل). باستخدام ماصة باستور الزجاج، ونقل المهد معزولة في طبق بتري تحتوي على 35-مم الباردة المتوسطة تشريح BME تستكمل مع مصل العجل 10٪ الجنين [مستنبت]. كرر هذه الخطوات حتى يتم عزل كل بنكرياسات. إذا يتم عزل بنكرياسات الأنماط الجينية المختلفة، والاحتفاظ بها منفصلة باستخدام نونك 4-وحات جيدة.

3. الطلاء وثقافة إإكسبلنتس البنكرياس

بلات النهائيويتم جي من إإكسبلنتس في غرفة زراعة الأنسجة و / أو على مقربة من الأنسجة حاضنة الثقافة للحد من الحركة المادية للثقافات.

1. تحت ظروف معقمة في الصفحي هود تدفق استبدال متوسطة تشريح BME في الأطباق ماتيك فبرونيكتين المغلفة مع ميكرولتر من 150 ~ ثقافة المتوسط ​​BME قبل تحسنت في 37 ° C.
2. بعناية، نقل إإكسبلنتس البنكرياس إلى أطباق ماتيك المغلفة (واحد لكل طبق يزدرع) على المدى الطويل ثقافة استخدام ماصة باستور الزجاج. لضمان نشر الثقافة خلال، يمكن اللحمة المتوسطة المحيطة إإكسبلنتس وقع قليلا، إذا لزم الأمر، مع إبرة رفيعة.
3. بلطف، ضع الثقافات في نسيج الثقافة الحاضنة (37 ° C، 5٪ CO ₂₎ لساعات قليلة للسماح للإإكسبلنتس نعلق على microwells أسفل الزجاج. مرة واحدة أنها تابعة، تملأ أطباق ماتيك مع 1.5 مل إلى 2 مل من مستنبت BME قبل تحسنت في 37 ° C. ويشار يوم تشريح لواليوم 0.
4. رجلويتم ipulation من الثقافات يزدرع البنكرياس تحت ظروف معقمة في الصفحي هود التدفق. يتم تغيير ثقافة المتوسط ​​BME كل يوم، ما لم متطلبات التجريبية تملي توقيت مختلفة (على سبيل المثال من الحضانة إإكسبلنتس مع العوامل الكيميائية). يمكن زرعها في إإكسبلنتس في هذه الحالة لمدة 5 أيام حتى أسبوع واحد.

4. كامل جبل بروتوكول تلوين المناعي للإإكسبلنتس البنكرياس

يتم تنفيذ جميع الخطوات للبروتوكول المناعي (من التثبيت إلى التصوير) في نفس الطبق ماتيك والتي ينتج عنها أفضل الصور من البلاستيك ذات قاع الطبق. بعد تثبيت والثقافات يزدرع البنكرياس لا تحتاج إلى أن تبقى تحت ظروف معقمة.

1. BME نضح المتوسطة الثقافة وغسل يزدرع مرة واحدة مع 2 مل PBS 1X.
2. لتثبيت يزدرع استبدال PBS مع 2 بارافورمالدهيد الجليد الباردة مل 4٪ (PFA) ووضع الطبق على الجليد لمدة 20 دقيقة. دوامة لوحة بلطف من وقت لالوقت، ولكن تجنب منصات هزاز، كما قد فصل يزدرع.
3. إزالة PFA وغسل يزدرع ثلاث مرات مع 2 مل من 1X PBS لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة كل (RT).
4. كتلة الحل مع 2 مل حظر (1X PBS + 0.1٪ تريتون X-+ 3٪ المصل حمار) لمدة لا تقل 30 دقيقة في RT.
5. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في منع الحل وإضافة ~ 150 ميكرولتر من التخفيف مباشرة في microwell 20-مم من لوحات ماتيك تغطي السطح كله ليزدرع الحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لتقليل الحركات الجسدية، إضافة إلى الأجسام المضادة الأولية إإكسبلنتس مباشرة في غرفة باردة (4 ° C). لمنع التبخر، قبل إضافة الجسم المضاد، ضع لوحات ماتيك في غرفة رطبة.
6. في اليوم التالي إزالة الأجسام المضادة والحل غسل ثلاث مرات مع 2 مل PBS 1X + 0.1٪ توين-20 (PBT) لمدة 30 دقيقة كل في RT.
7. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل [وفقا لتوصيات الشركة المصنعة، ونحن نستخدم الحمير اليكسا فلور الأصباغ المضادة الثانويةالهيئات في التخفيف 1:750] وإضافة ~ 150 ميكرولتر من التخفيف مباشرة في microwell 20-مم من لوحات ماتيك، الذي يغطي سطح يزدرع كله، لحضانة 1-2 في ساعة RT في الظلام. لcounterstaining النووية، وتشمل هويشت مع تخفيف الأجسام المضادة الثانوية. لمنع التبخر، قبل إضافة الجسم المضاد، ضع لوحات ماتيك في غرفة رطبة.
8. يغسل ثلاث مرات مع 2 مل PBS 1X + 0.1٪ توين-20 (PBT) لمدة 30 دقيقة كل في RT.
9. قبل التركيب، وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X لإزالة توين-20. تحميل عن طريق إضافة قطرة واحدة من مائي المتوسطة تركيب (مع مكافحة يتلاشى) في microwell 20-مم من لوحات ماتيك. بلطف، مع تغطية يزدرع ساترة الزجاج. تجنب فقاعات الهواء.
10. ويمكن الاطلاع على لوحات إإكسبلنتس ماتيك تحت المجهر القياسية المرحلة التباين أو المجهري متحد البؤر، اعتمادا على أهداف التجربة. للتحليل المجهري متحد البؤر نستخدم LSM زايس 700 الإعداد مقلوب. انشاء الليزر المناسب لfluorophores لناأد. تحديد الهدف من شأنها أن صورة المنطقة المطلوب من يزدرع البنكرياس. A 10X الغمر بالمياه الهدف من ذلك هو مناسبة للحفاظ على يزدرع كامل في مجال الرؤية. A 40X المياه أو النفط الغمر، الأهداف هي مناسبة للتركيز على مناطق معينة من يزدرع البنكرياس مع أكبر القرار. يمكن للإإكسبلنتس يكون مقطوع بصريا ثم حصلت Z-مداخن بناؤها في 3D، وذلك باستخدام البرمجيات المناسبة.

5. الخلية الحية من البروتوكول التصوير إإكسبلنتس البنكرياس

1. إعداد غرفة البيئية: استخدام العلبة البيئية وغرفة حضانة الصغيرة [مع التحكم ₂ درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون] الذي يجلس على المسرح المجهر. زراعة البنكرياس السليم للالجنينية تتطلب درجة حرارة ثابتة من 37 ° C وأجواء تسيطر عليها مرطب 5٪ CO _2. غرف مناسبة وتتوفر العديد من الباعة (على سبيل المثال، زايس، نيكون، أوليمبوس). تجميع مربع سخان وتحويلها علىر 1 ساعة على الأقل قبل التصوير يبدأ في السماح للمعدات في عملية الاحماء وتتوازن محتوى CO ₂ إلى 5٪.
2. الوقت الفاصل بين لتصوير الثقافات يزدرع البنكرياس، نستخدم LSM زايس 700 مجهر مقلوب. ليزر واختيار الهدف انظر النقطة 4.10.
3. السماح لليزدرع البنكرياس إرفاق جيدا إلى الطبق الزجاجي السفلي قبل بدء التصوير مباشرة. [ونحن أداء عادة التصوير الحية بدءا من اليوم 1].
   الصفحي هود في التدفق، ونضح واستبدال المتوسطة يزدرع مع BME الطازجة مستنبت أن تبدأ مع ظروف المغذيات الأمثل.
4. نقل بلطف إلى غرفة إإكسبلنتس المجهر ووضع الطبق ماتيك في غرفة الحضانة في حامل العينة من المجهر متحد البؤر.
5. إعداد الهدف (مثل إضافة الزيت أو الماء المتوسطة وفقا لاختيار الهدف الغمر) والتركيز على المنطقة من الاهتمام في يزدرع. إغلاق الدائرة البيئية بشكل صحيح. لمنع التبخر خلال مرور الزمناستحواذ مع الغمر بالمياه الأهداف، بدلا من المياه فمن المستحسن استخدام سوائل لزجة الغمر المتوفرة تجاريا (مثل زايس Immersol W).
6. انشاء كثافة الليزر، المعلمات اقتناء Z-مكدس والفاصل الزمني (انظر المناقشة أيضا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها). بدء التجربة.
7. بعد التصوير، وتصدير المداخن Z وجميع النقاط الزمنية وتحليلها باستخدام البرنامج المناسب (على سبيل المثال يماغيج، Volocity، Imaris، هيغنز).

6. ممثل النتائج

تم تشريح البنكرياس براعم الظهرية (جنبا إلى جنب مع اللحمة المتوسطة المحيطة) من أجنة الفئران وبين E11.5 E12.5 ومطلي مباشرة على الأطباق الزجاجية الثقافة أسفل (الشكل 1). الأوعية الدموية موجودة في اللحمة المتوسطة المحيطة ظهارة ويمكن تصور من قبل المناعية للعلامة البطانية Pecam ¹² (البيانات لا تظهر). بعد يومين من والثقافة البنكرياس إإكسبلنتس اوندerwent نموا كبيرا وبدأت في تنظيم أنفسهم في هياكل الظهارية متفرعة، الذي نوى كانت ايجابية للعامل النسخ البنكرياس، Pdx1 (الشكل 2A-C). متوسط ​​Z-سمك إإكسبلنتس البنكرياس في يوم 3 من الثقافة 60-80 ميكرومتر. ويمكن قياس السطح وحجم إإكسبلنتس استخدام برامج مناسبة (مثل هيغنز). وأظهرت مورفولوجيا والتحليلات التي إإكسبلنتس المناعي البنكرياس مثقف باستخدام هذا البروتوكول خصت في الجسم الحي التمايز البنكرياس المبكر والأحداث تخلقية ^{5،10،11،14} (الشكل 2). خضع إإكسبلنتس البنكرياس في يوم 4 من ثقافة نموذجية "تلميح والجذع" الفصل بين ظهارة ^8، عرض cpa1 + الخلايا الاصلية في نصائح من فروع الظهارية (الشكل 2C) ومتباينة + الأنسولين والخلايا الجلوكاجون + تنظيمها في مجموعات داخل الجذع (الشكل 2D ). وبالإضافة إلى ذلك، والتهاب البنكرياسوأظهرت ظهارة ج في الجسم الحي الثقافات السابقين المناسبة تنظيم الهيكل الخلوي والخلية القطبية، مع توطين القمي من F-الأكتين (2E الشكل، باللون الأخضر) و B1-إنتغرين في الأغشية القاعدية (2E الشكل، باللون الأحمر).

لدراسة البنكرياس المتفرعة في الوقت الحقيقي، تم عزل إإكسبلنتس البنكرياس الجنينية من ثنائي اللون الفلورسنت مراسل سلالة الماوس membrane-Tomato/membrane-Green ¹⁵ (مليون طن / ملغ؛ سلالة الفأر هو متاح في مختبر جاكسون) (الشكل 3). لا يزال يتم عرض إطارات من فيلم مرور الزمن من إإكسبلنتس البنكرياس مليون طن / ملغ نمت في الثقافة في الشكل 3. توطين البروتين الفلوري طن متري إلى هياكل غشاء يحدد شكل الخلية ويسمح القرار من العمليات الخلوية غرامة، وتمكين إعادة عرض لتعقب الخلايا والهجرة مع مرور الوقت.

بعد تجربة مرور الزمن 12-HR إشارة مضان ميليتسلا لا تزال قابلة للحياة وdetectable، حتى ولو تم تخفيض حدته، على الأرجح بسبب photodamage (الشكل 3). وتناقش الحلول التقنية لتجنب أو تقليل photodamage والضيائية في قسم المناقشات.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للتشريح البنكرياس الظهرية برعم من جنين فأر E12.5. (A) Brightfield صورة جنين فأر E12.5. يتم إزالة الجزء العلوي من الجسم للجنين (فوق الكبد) ومنطقة الذيل لعزل منتصف الجسم (B). وتظهر شقوق بواسطة الخطوط المنقطة الحمراء. (C) نتائج تشريح أخرى في التعرض للمعدة والاثني عشر منطقة (المشار إليها بواسطة مربع منقط). مهدها البنكرياس الظهرية (انظر دائرة منقطة باللون الأحمر) هو في القاعدة المعدة وبجوار منشم الطحال. يتم نقل البنكرياس الظهرية تشريح برعم (D) مع ماصة باستور في microwell من الزجاج طبق أسفل تحتوي على مستنبت BME (E، F). الاختصارات: ستو (المعدة)، SP (الطحال)، DP (برعم البنكرياس الظهرية)، الثنائي (الاثني عشر). على نطاق والحانات، 1000 ميكرومتر (A، C).

الشكل 2. الجامع جبل التحليل المناعي مبائر الثقافات يزدرع البنكرياس. (A) من الصور Brightfield إإكسبلنتس البنكرياس في يوم 1 و 2 من اليوم ثقافة فيفو السابقين. خط منقط الأحمر يشير إلى بدء المتفرعة من ظهارة. (B) إعادة الإعمار 3D جبل لكامل المناعية للPdx1 على الثقافة اليوم البنكرياس 3. وأظهرت إإكسبلنتس البنكرياس من خلايا الأنابيب تمر + Pdx1 المتفرعة واسعة من قبل 48 ساعة من الثقافات. (C) الجامع جبل المناعية من يزدرع يوم البنكرياس 3 مع الأجسام المضادة ضد علامة غشاء basolateral E-كادهيرين (جامد)، علامة تلميح السلف، كربوكسي ببتيداز 1 (Cpa1) والفوسفات-H3 هيستون (pHH3). معظم الإنقسامية بالموقع pHH3 + الخلايا colocalize في نصائح الطرفية مع الخلايا + Cpa1. متقطع Lإيناس تشير غيض من الفروع. (D) الجامع جبل المناعية للعلامات النسب الغدد الصماء، والأنسولين (INS) والجلوكاجون (Gluca) في اليوم 3. الأسهم الصفراء تشير إلى مجموعات من الخلايا وظائف إضافية + + Gluca. أقحم ('D)، وارتفاع التكبير واحد من الغدد الصماء الكتلة الخلية. (E) الجامع جبل المناعية من يزدرع يوم البنكرياس 3 للPdx1 إنتغرين β1، (β1int) وF-الأكتين (وقائع). خلايا اللحمة المتوسطة (العلامات النجمية) يتخلل بين Pdx1 إيجابية الخلايا الظهارية. الصور المبينة في C، D و E هي واحدة من المقاطع البصرية مبائر Z-سلسلة. على نطاق والحانات، 100 ميكرومتر (A، B) و 50 ميكرون (CE).

الشكل 3. الممثل الخلية الحية التصوير من خارج الجسم يزدرع البنكرياس مثقف. (AD) إطارات من فيلم الوقت الفاصل بين ليزدرع البنكرياس من جنين طن / ملغ المعدلة وراثيا الماوس. ويرد وقت التصوير في ساعات: دقائق. تم تصوير ويزدرع ابتداء من الساعة يوم 1. Z-كومة الصورتم الحصول عليها مع الهدف 40X الغمر النفط كل 12 دقيقة لما مجموعه 15 ساعة. تشير الخطوط المتقطعة نصيحه من فروع والحدود بين ظهارة واللحمة المتوسطة. مقياس بار، و 50 ميكرومتر.

Discussion

مرة واحدة يتم تحديد مصير البنكرياس، الخلايا الاصلية البنكرياس الخضوع انتشار واسعة، والتمايز والتشكل في نهاية المطاف لتشكيل هيئة ناضجة وظيفية ^2،4. في الوقت الحاضر، وكيف المتفرعة يحدث في البنكرياس وكيف يتم توصيله انتشار السلف والتمايز غير معروف إلى حد كبير. يزدرع الثقافات البنكرياس تمثل النظام المثالي لتوضيح هذه العمليات خارج الجسم ^5،9،11. من خلال الجمع بين التصوير الخلية الحية مع فيفو السابقين إإكسبلنتس من براعم البنكرياس في وقت مبكر يمكن للمرء الحصول على صورة واضحة عن الأحداث التي تحدث أثناء التشكل البنكرياس في الجنين. هذه المقالة الفيديو يعرض مقاربة بسيطة لإنشاء الثقافات فيفو السابقين من البنكرياس الجنينية على دعم الزجاج، مما يجعلها مثالية لكامل جبل المناعي والتصوير الحي.

العديد من الأمثلة على استخدام السابقين إإكسبلنتس البنكرياس المجراة لج التصويروتعرض مورفولوجيا الذراع والنمو والتمايز هنا. الأهم من ذلك، هذه الأمثلة تبين أن الجنين البنكرياس مثقف فيفو السابقين باستخدام هذا البروتوكول تحاكي المراحل الأولى من التنمية في الجسم الحي البنكرياس الجنينية ^2،3. على سبيل المثال، يبدأ المتفرعة حوالي 24 ساعة بعد الطلاء من البنكرياس E11.5، كما هو متوقع في الجسم الحي (الشكل 2A). بينما التشكل وتمايز الخلايا في الثقافات التي تشبه ينظر في الجسم الحي، والنمو الإجمالي للإإكسبلنتس غير قابلة للمقارنة، وأقل بكثير من تلك المسجلة في الجنين النامية. وفقا للشروط الثقافة وصفها هنا، إإكسبلنتس البنكرياس تتوقف عن النمو في اليوم 5 و الخضوع الضمور بعد أسبوع واحد (لا تظهر البيانات). ولذلك، فإن نظام الجسم الحي السابقين ذكرت زراعة محدودة وأكثر ملاءمة للتحقيق في الجوانب الأولى من توالد الأعضاء البنكرياس.

نقدم هنا أمثلة على الثقافات خارج الجسم الفي أنشأنا من البرية من نوع وكذلك طن / ملغ أجنة الفئران مراسل. لا غنى عن استخدام سلالة مراسل الفلورية في الوقت الحقيقي التصوير، مما يمكن التصور الهياكل الخلوية والتحت خلوية ودراسة ديناميكية في بيئة 3D. على سبيل المثال، توطين البروتين الفلوري طن متري إلى هياكل غشاء تمكننا من تصور بدقة شكل الخلية والخلية المسار إعادة عرض والهجرة على مر الزمن في إإكسبلنتس البنكرياس. واحد من المشكلة الأكثر شيوعا وقيود في التصوير التجارب الحية الخلية photodamage التي قد تحدث نتيجة للتعرض المتكرر للإنارة الإثارة مضان. بشكل عام، على المرء أن يوازن جودة الصورة مع الضيائية في سياق إعداداته الخاصة التجريبية. على سبيل المثال، لتقليل احتمال واحد هو photodamage للحد من وتيرة التصوير وزيادة الفاصل الزمني بين إطارات متتالية أو، بدلا من ذلك، لتحسين اكتساب كومة Zعن طريق الحد من عدد من شرائح الضوئية.

وأخيرا، السابقين فيفو زراعة البنكرياس الجنينية هو نظام قيمة لفحص المركبات الكيميائية وآثارها على التنمية البنكرياس. يمكن إضافة المجمع أو عوامل مباشرة لثقافة المتوسط، ويمكن تقييم الآثار التنموية بسهولة تحت المجهر. باستخدام برامج تحليل البيانات، يمكن للمرء الحصول على بيانات كمية عن حتى الانتشار والنمو، واستطالة، المتفرعة، tubulogenesis والتمايز. ومن الممكن أيضا استخدام أنسجة معدلة وراثيا أو خروج المغلوب لإنشاء جهاز أو الثقافات تنفيذ أسرع مكاسب والخسائر من الوظائف في التجارب إإكسبلنتس، على سبيل المثال من خلال تنبيغ الفيروسة البطيئة أو أليغنوكليوتيد] morpholino على التوالي (البيانات لا تظهر). فإن جميع هذه النهج تسمح في الوقت الحقيقي من الدراسات والظواهر متحولة مزيد من الفهم شبكات الجينات التنظيمية في البنكرياس النامية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Kept in sterile conditions
Cell culture grade water	PAA	S15-012	Kept in sterile conditions
Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm	MatTek Corporation	P35G-0-20-C
Donkey Serum	Chemicon	S30-100 ml
Fetal calf serum Gold	PAA	A15-151	Kept in sterile conditions
Fibronectin	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water
Gentamicin	Invitrogen	15750-037	Kept in sterile conditions
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Kept in sterile conditions
4-well Multidishes	Nunc	176740
Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above
Paraformaldehyde	Roth	0335.3	Stock solution 20%
Pasteur Pipet (Glass), 150 mm	VWR	HECH567/1
Penicillin/Streptomycin	PAA	P11-010	Kept in sterile conditions
Petri dishes, 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Petri dishes, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH7.4	PAA	H15-002	Kept in sterile conditions
Spring Scissors 8 mm blade curved	Fine Science Tools	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Watchmaker's foreceps Dumont #5	Roth	K342.1