Summary
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultur und Manipulation von embryonalen Maus Bauchspeicheldrüse. Dies stellt eine hervorragende
Abstract
Die Bauchspeicheldrüse steuert wichtige Funktionen unseres Körpers, einschließlich der Produktion von Verdauungsenzymen und Regulierung des Blutzuckerspiegels 1. Obwohl in den letzten zehn Jahren viele Studien zu einer festen Grundlage für das Verständnis der Bauchspeicheldrüse Organogenese beigetragen haben, bestehen große Lücken in unserem Wissen über frühe Bauchspeicheldrüse Bildung 2. Ein vollständiges Verständnis dieser frühen Ereignisse Einblick in die Entwicklung dieses Organs zu schaffen, sondern auch in unheilbaren Krankheiten, die die Bauchspeicheldrüse zielen, wie Diabetes oder Bauchspeicheldrüsenkrebs. Schließlich werden diese Informationen generieren Konzept für die Entwicklung Zell-Ersatz-Therapien im Rahmen des Diabetes.
Während der Embryogenese, stammt die Bauchspeicheldrüse aus unterschiedlichen embryonalen Auswüchse der dorsalen und ventralen foregut Endoderm am embryonalen Tag (E) 9,5 im Maus-Embryo 3,4. Beide Auswüchse evaginate in das umgebende Mesenchym als feste Epithelienl Knospen, die Proliferation unterziehen, Verzweigung und Differenzierung eine ausgereifte Orgel 2,5,6 generieren. Jüngste Beweise haben vorgeschlagen, dass das Wachstum und die Differenzierung von Pankreas-Zelllinien, einschließlich der Insulin produzierenden β-Zellen, auf ordnungsgemäße gewebespezifischen Architektur, epitheliale Zelle Remodellierung und Positionierung innerhalb des Pankreas Epithel Verzweigungsmittel 7,8 abhängt. Doch wie Verzweigungen Morphogenese auftritt und mit der Proliferation und Differenzierung in der Bauchspeicheldrüse koordiniert ist weitgehend unbekannt. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die derzeitigen Wissen über diese Entwicklungsprozesse bisher fast ausschließlich auf der Analyse von festen Proben herangezogen, während morphogenetischen Ereignisse hochdynamisch sind.
Hier berichten wir über eine Methode zum Präparieren und Kultivieren von embryonalen Maus-Pankreas Knospen ex vivo am Glasboden Gerichte, die direkte Visualisierung der Entwicklung von Pankreas (Abbildung 1) zu ermöglichen. Dieser Kulture-System ist ideal für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie entwickelt und vor allem Live-Cell-Imaging. Pancreatic Explantate können nicht nur von Wildtyp-Maus-Embryonen hergestellt werden, sondern auch aus gentechnisch veränderten Mauslinien (zB transgenen oder Knockout), so dass Echtzeit-Studien von mutierten Phänotypen. Darüber hinaus ist diese ex vivo Kultursystem wertvolle um die Wirkungen von chemischen Verbindungen auf Bauchspeicheldrüsenentwicklung studieren, ermöglicht, um quantitative Daten über die Proliferation und das Wachstum, die Dehnung, Verzweigungsgrad, Tubulogenese und Differenzierung zu erreichen. Zusammenfassend stellt die Entwicklung eines ex vivo Pankreas Explantatkultur Methode mit hochauflösenden bildgebenden kombiniert eine starke Plattform für die Beobachtung morphogenetischen und Differenzierung Ereignisse, wie sie in den Entwicklungsländern Maus-Embryo auftreten.
Protocol
Das hier beschriebene Protokoll wurde von der Technik, die ursprünglich in Percival und Slack 9 beschrieben und optimiert für die konfokale Mikroskopie angepasst.
Ein. Beschichtung von Glass Bottom Kultur Dishes
Die folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt werden.
- Pancreatic Explantate werden in 35-mm-Petrischalen mit 20-mm Durchmesser Glas Mikrowell Boden (zB MatTek Corporation) kultiviert. Verwenden Sie ein Glasboden Gericht pro Explantat Kultur und für die gesamte Dauer der Kultur. Am Tag vor der Präparation und Isolierung der Pankreas Knospen, beschichten Glasboden Vertiefungen, die mit Fibronektin.
- Verdünnen sterile Fibronektin in Zellkultur-grade Wasser zu einer 50 ug / ml Endkonzentration und fügen Sie eine minimale Lautstärke von ihm (~ 150 ul) in der 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten über die gesamte Glasfläche (1E). Die Schalenin einem 4 ° C Kühlschrank für Übernacht-Inkubation.
- Am Tag der Dissektion absaugen Fibronektin, spülen Sie die Mikrotiterplatten mit Zellkultur-grade Wasser und ein Mindestvolumen von 150 ul BME (Basal Medium Eagle) Medium mit Pen / Strep (1%), Glutamin (1% ergänzt ) und 50 ug / ml Gentamicin [Dissection Medium]. Lassen Sie die beschichteten Platten in der Laminarströmungshaube bis zu seiner Platte die Explantate.
Wenn nicht alle Fibronektin-beschichteten Schalen verwendet werden, können diese gespeichert werden für bis zu 1 Woche bei 4 ° C. Lassen Sie sich nicht die Gerichte trocknen, füllen sie mit Dissection Medium und legen Sie sie in den Kühlschrank stellen.
Neben Fibronektin wurden Pankreas Explantate wurden erfolgreich auf verschiedenen Substraten, wie Laminin 9, Matrigel 10,11 oder mikroporösen Membranen 12 kultiviert. Wegen ihrer Auswirkungen auf Verzweigungen, verwenden wir Fibronektin 9 als Substrat.
2. Dissection von DØrsal Pancreatic Bud E11.5 - E12.5 Maus Embryonen
- Zeitgesteuerten-schwangeren weiblichen Mäusen während der embryonalen Tag (E) 11,5 oder 12,5 geopfert und Embryonen werden gesammelt, indem Sezieren Instrumenten zuvor mit 70% Ethanol gereinigt. Legen Sie die seziert Gebärmutter in 10-cm-Platten mit eiskaltem PBS mit 50 ug / ml Gentamicin ergänzt.
- Unter einem Stereomikroskop mit Beleuchtung von oben, separate der Gebärmutter in einzelne Embryo Segmenten mit kleinen Schere oder Dumont Pinzette vorsichtig abziehen dem Muskel der Gebärmutter und entfernen Sie die einzelnen Embryonen, die durch die decidua umgeben sind. Verwenden Sie Standard-Embryos Präparation Techniken 13 um die Embryonen zu entlarven und entfernen Sie den Dottersack und Amnion. Anschließend Entfernen des Oberkörpers des Embryos (oberhalb der Leber) und der Schwanzbereich. Dies ermöglicht Exposition der inneren Organe (1B). Übertragen der Mittelkörper der Embryonen in 10-cm-Platten mit eiskaltem BME Dissektion Medium.
- JetztVerwenden Sie nur Durchleuchtung von unten zu visualisieren und zu den dorsalen Pankreas Knospe unter dem Stereomikroskop sezieren. Sanft, öffnen Sie die Mitte Körper des Embryos, indem Sie einen seitlichen Einschnitt mit einer Pinzette. Suchen Sie den Magen und die Milz. Die dorsale Pankreas Knospe ist seitlich an dem hinteren Bereich des Magens (1C) befestigt. Mit Dumont Pinzette, sezieren entfernt die dorsale Pankreas Knospe von benachbarten Strukturen, wie der Magen und Milz, aber verlassen einige Mesenchym um die Epithel (Abbildung 1D). Mit einem Glas Pasteurpipette, übertragen die isolierte Keim in eine 35-mm-Petrischale mit kaltem BME Dissektion Medium mit 10% fötalem Kälberserum [Kultur Medium] ergänzt. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Pankreas isoliert sind. Wenn Bauchspeicheldrüsen von verschiedenen Genotypen isoliert sind, bewahren Sie diese getrennt mit Nunc 4-Well-Platten.
3. Plating und Kultur Pancreatic Explantate
Finale platten der Explantate erfolgt in Gewebekultur Raum und / oder in unmittelbarer Nähe zu der Gewebekultur-Inkubator durchgeführt, um physische Bewegung der Kulturen zu minimieren.
- Unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube ersetzt die BME Dissection Medium in den fibronektinbeschichtete MatTek Gerichte mit ~ 150 ul BME Kulturmedium bei 37 vorgewärmt ° C.
- Vorsichtig, übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse Explantate in beschichteten MatTek Gerichte (ein Explantat pro Schale) für langfristige Kultur mit einem Glas Pasteur Pipette. Um sicherzustellen Ausbreitung während der Kultur kann die Mesenchym umgebenden Explantate leicht zerrissen werden, falls notwendig, mit einer feinen Nadel.
- Sanft legen die Kulturen in einer Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) für einige Stunden, bis die Explantate auf den Glasboden Vertiefungen anzubringen. Sobald sie gebunden sind, füllen die MatTek Gerichte mit 1,5 ml bis 2 ml BME Kulturmedium vorgewärmt bei 37 ° C. Der Tag der Dissektion wird als Tag 0 bezeichnet.
- Mannipulation der pankreatischen Explantatkulturen wird unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt. Die BME Kulturmedium wird jeden zweiten Tag gewechselt, sofern experimentellen Anforderungen unterschiedlichen Zeitpunkten (z. B. Inkubation der Explantate mit chemischen Mitteln) diktieren. Die Explantate können in diesem Zustand für 5 Tage bis zu einer Woche kultiviert.
4. Whole-mount Immunfluoreszenz Färbeprotokoll für Pancreatic Explantate
Alle Schritte des Immunfluoreszenz-Protokoll (ab Fixierung an Bildgebung) sind in der gleichen MatTek Gericht, das bessere Bilder liefert als ein Kunststoff-Boden versehenen Schale durchgeführt. Nach der Fixierung kann Pankreas Explantatkulturen daher keine unter sterilen Bedingungen gehalten werden.
- Absaugen BME Kulturmedium und waschen das Explantat einmal mit 2 ml 1X PBS.
- Für Explantat Fixierung ersetzen PBS mit 2 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd (PFA) und die Schale auf Eis für 20 min. Schwenken Sie die Platte vorsichtig von Zeit zuZeit, sondern vermeiden rocken Plattformen, wie das Explantat könnte zu lösen.
- Entfernen PFA und waschen Sie die Explantat dreimal mit 2 ml 1X PBS für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT).
- Block mit 2 ml Blockierungslösung (PBS 1X + 0,1% Triton-X + 3% Serum Esel) für mindestens 30 min bei RT.
- Verdünnte Primärantikörpers in Blockierungslösung und füge ~ 150 ul der Verdünnung direkt in das 20-mm Mikrovertiefung der MatTek Platten über die gesamte Oberfläche Explantat für eine Inkubation über Nacht bei 4 ° C. Um körperliche Bewegungen zu minimieren, fügen primären Antikörpers an den Explantaten direkt in den Kühlraum (4 ° C). Um Verdunstung zu verhindern, vor der Zugabe des Antikörpers, platzieren die MatTek Platten in einer feuchten Kammer inkubiert.
- Am nächsten Tag Entfernen der Antikörper-Lösung und dreimal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) für jeweils 30 min bei RT.
- Verdünnen sekundären Antikörper in Blockierungslösung [nach den Empfehlungen des Herstellers, wir benutzen Esel Alexa Fluor Farbstoffe sekundären antiGremien auf 1:750 verdünnt] und fügen Sie ~ 150 ul der Verdünnung direkt in der 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten, die das gesamte Explantat Oberfläche, für 1-2 h Inkubation bei RT im Dunkeln. Für nukleare Gegenfärbung gehören Hoechst zusammen mit sekundären Antikörper Verdünnung. Um Verdunstung zu verhindern, vor der Zugabe des Antikörpers, platzieren die MatTek Platten in einer feuchten Kammer inkubiert.
- Waschen dreimal mit 2 ml 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) für jeweils 30 min bei RT.
- Vor der Montage, einmal abwaschen mit 1X PBS Tween-20 zu entfernen. Montieren, indem ein Tropfen wässrigen Medium (mit Anti-Fading) in den 20-mm Mikrotiter der MatTek Platten. Sanft, decken die Explantat mit einem Deckglas. Luftblasen vermeiden.
- Explantate auf MatTek Platten können unter Standardbedingungen Phasenkontrastmikroskopie oder konfokalen Mikroskopie angesehen werden, abhängig von den Zielen des Experiments. Für die konfokale Mikroskopie Analyse verwenden wir ein Zeiss LSM 700 invertierten Einstellung. Richten Sie geeignete Laser für Fluorophore unsed.. Wählen Sie ein Ziel, das will Bild den gewünschten Bereich des Pankreas Explantat. Ein Wasser-10X Immersionsobjektiv geeignet ist, die gesamte Explantat in dem Sichtfeld zu halten. A 40X Wasser-oder Öl-Immersions-Ziele sind geeignet, um auf spezifische Bereiche des Pankreas Explantats mit einer höheren Auflösung zu konzentrieren. Die Explantate kann optisch geschnitten und dann die erworbenen Z-Stapel rekonstruiert in 3D, mit der entsprechenden Software.
5. Live-cell Imaging Protokoll von Bauchspeicheldrüsenkrebs Explantate
- Klimakammer Setup: Verwenden Sie eine Schutzgehäuse und eine kleine Inkubationskammer [mit Temperatur-und CO 2-Regelung], die auf dem Mikroskoptisch sitzt. Ordnungsgemäße Kultivieren der embryonischen Bauchspeicheldrüse erfordert eine stabile Temperatur von 37 ° C und einer kontrollierten Atmosphäre von befeuchteten 5% CO 2. Geeignete Räume sind von verschiedenen Herstellern erhältlich (ZB Zeiss, Nikon, Olympus). Montieren Sie die Heizung ein und schalten Sie ihn eint mindestens 1 Stunde vor Imaging startet, damit die Geräte zum Aufwärmen und Gleichgewicht CO 2-Gehalt von 5%.
- Für Zeitraffer-Aufnahmen von Pankreas Explantatkulturen, verwenden wir einen Zeiss LSM 700 inversen Mikroskop. Für Laser und objektive Auswahl siehe Punkt 4.10.
- Lassen Sie das Pankreas Explantat gut mit dem Glasboden-Teller legen, bevor die Live-Bildgebung. [Wir in der Regel live imaging ab Tag 1].
In einer Laminarströmungshaube absaugen und ersetzen Sie das Explantat Medium durch frisches BME Kulturmedium mit optimaler nährstoffarmen Bedingungen starten. - Übertragen Sie leicht die Explantate auf dem Mikroskop Zimmer und legen Sie die MatTek Gericht im Inkubationskammer in den Probenhalter des konfokalen Mikroskops.
- Bereiten Sie das Ziel (z. B. fügen Öl oder Wasser-Medium nach der Wahl Immersionsobjektiv) und konzentrieren sich auf die Region von Interesse in dem Explantat. Schließen Sie die Klimakammer richtig. Um die Verdunstung während der Zeitraffer zu verhindernAkquisition mit Wasser-Immersions-Objektive, an Stelle von Wasser empfiehlt es sich, viskose Immersionsflüssigkeiten, die im Handel erhältlich sind (z. B. Zeiss Immersol W) verwenden.
- Richten Sie Laserintensität, Z-Stapel Erfassungsparameter und Zeitintervall (siehe auch Beiträge zu Troubleshooting). Starten Sie das Experiment.
- Nach der Bebilderung, Export Z-Stacks und allen Zeitpunkten und analysieren sie mit geeigneter Software (zB ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).
6. Repräsentative Ergebnisse
Dorsalen Pankreas Knospen (zusammen mit dem umgebenden Mesenchym) wurden aus Mausembryonen zwischen E11.5 und E12.5 und plattiert direkt am Glasboden Kulturschalen (Abbildung 1) seziert. Blutgefäße sind in dem Mesenchym umgebenden Epithel und visualisiert werden kann durch Immunfärbung für den endothelialen Marker PECAM 12 (Daten nicht gezeigt). Nach zwei Tagen der Kultur-, Bauchspeicheldrüsen-Explantaten underwent signifikanten Wachstum und begonnen, sich in verzweigte epithelialen Strukturen, deren Kerne waren positiv für den pankreatischen Transkriptionsfaktor Pdx1 (2A-C) anzuordnen. Die durchschnittliche Dicke der z-Pankreas-Explantate am Tag 3 der Kultur ist 60-80 um. Die Oberfläche und das Volumen der Explantate können unter Verwendung geeigneter Software (zB Huygens) werden. Morphologie und Immunfluoreszenz Analysen zeigten, dass Pankreas Explantate mit diesem Protokoll in vivo frühen pankreatischen Differenzierung und morphogenetischen Ereignisse 5,10,11,14 (Abbildung 2) rekapituliert kultiviert. Pancreatic Explantate am Tag 4 der Kultur erlebte typischen "Spitze und Stamm" Segregation des Epithels 8, Anzeige CPA1 + Vorläuferzellen an den Spitzen der epithelialen Filialen (2C) und differenzierten Insulin + und Glucagon + Zellen als Cluster im Kofferraum organisiert (Abbildung 2D ). Darüber hinaus ist die Bauchspeicheldrüsenc Epithel in den ex vivo Kulturen zeigten ordnungsgemäße Organisation des Cytoskeletts und Zellpolarität, mit apikalen Lokalisation von F-Aktin (Abbildung 2E, in grün) und b1-Integrin an den Basalmembranen (2E, in rot).
(; Mausstamm ist am Jackson Laboratory mT / mg) (Abbildung 3) Pankreas Verzweigung in Echtzeit zu untersuchen, wurden embryonale Pankreas Explantate aus dem Dual-color fluoreszierenden Reporter Mausstamm membrane-Tomato/membrane-Green 15 isoliert. Standbilder aus einem Zeitraffer-Film mT / mg Pankreas Explantate in Kultur gezüchtet werden in Abbildung 3 dargestellt. Die Lokalisation des mT fluoreszierendes Protein an Membranstrukturen umreißt Zellmorphologie und ermöglicht Auflösung feiner zelluläre Prozesse, so dass die Zelle Umbau und Migration über die Zeit zu verfolgen.
Nach einer 12-Stunden-Zeitraffer-Experiment mT Fluoreszenzsignal lebensfähig bleibt und VerschlechterungCTable, obwohl dessen Intensität reduziert wird, wahrscheinlich aufgrund Lichtschäden (Abbildung 3). Technische Lösungen zur Vermeidung oder Verringerung Lichtschäden und Phototoxizität sind in der Diskussion Abschnitt diskutiert.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des dorsalen Pankreas Knospe Dissektion von E12.5 Maus-Embryo. (A) Hellfeld Bild von E12.5 Maus-Embryo. Der Oberkörper des Embryos (oberhalb der Leber) und Heckbereich werden entfernt, um den mittleren Körper (B) zu isolieren. Die Schnitte werden durch rote gestrichelte Linien dargestellt. (C) Ferner Dissektion Ergebnissen der Exposition des Magens und Duodenums Region (angedeutet durch den gestrichelten Kasten). Die dorsale Pankreas Knospe (siehe roter gestrichelter Kreis) ist an der Basis des Magens und neben der Milz Primordium. Der seziert dorsalen Pankreas Knospe (D) mit einer Pasteurpipette in die Mikrotiterplatten von einem Glasboden Schale mit BME Kulturmedium (E transferiert, F). Abkürzungen: sto (Magen), sp (Milz), dp (dorsalen Pankreas Knospe), Duo (Zwölffingerdarm). Maßstabsbalken, 1000 um (A, C).
Abbildung 2. Whole-mount konfokalen Immunfluoreszenz Analyse des Pankreas Explantatkulturen. (A) Hellfeld Bilder von Pankreas-Explantate am Tag 1 und Tag 2 von ex vivo Kultur. Red gepunktete Linie zeigt Einleitung Verzweigung des Epithel. (B) 3D-Rekonstruktion von whole-mount Immunfärbung für Pdx1 am Tag 3 Pankreas Kultur. Pancreatic Explantate zeigten Tubuli Pdx1 + Zellen, die eine umfangreiche Verzweigung um 48 hr der Kulturen. (C) Whole-Mount-Immunfärbung von Tag 3 Pankreas Explantat mit Antikörpern gegen den basolateralen Membran Marker E-Cadherin (ECAD), tip Vorläuferzellen Marker, Carboxypeptidase 1 (CPA1) und Phospho-Histon H3 (pHH3). Die meisten der mitotischen aktive pHH3 +-Zellen kolokalisiert an den peripheren Tipps mit CPA1 + Zellen. Gestrichelte lines anzuzeigen Spitze der Zweige. (D) Whole-Mount-Immunfärbung für endokrine Linie Marker, Insulin (Ins) und Glucagon (Gluca) am Tag 3. Gelbe Pfeile zeigen Cluster Ins + und Gluca + Zellen. Einsatz (D ') mit höherer Vergrößerung von einer der endokrinen Zellen-Clusters. (E) Whole-Mount-Immunfärbung von Tag 3 Pankreas Explantat für Pdx1, β1 Integrin (β1int) und F-Aktin (Fact). Mesenchymale Zellen (Sternchen) unter Pdx1-positive Epithelzellen durchsetzt. Bilder in C, D und E dargestellt sind einzelne Abschnitte des konfokalen optischen Z-Reihe. Maßstabsbalken, 100 um (A, B); 50 um (CE).
Abbildung 3. Vertreter Live-Cell-Imaging von ex vivo kultivierten pankreatischen Explantat. (AD) Frames von einem Zeitraffer-Film eines Pankreas Explantat aus einer mT / mG Maus transgenen Embryos. Minute: Time of Imaging wird in Stunden angezeigt. Das Explantat wurde abgebildet ab Tag 1. Z-Stapel-Aufnahmenwurden mit einem 40X Ölimmersionsobjektiv alle 12 min für insgesamt 15 Stunden erfasst. Die gestrichelten Linien zeigen den Filialen und Grenze zwischen Epithel und Mesenchym kippen. Maßstab, 50 um.
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Discussion
Sobald pankreatischen Schicksal angegeben, durchlaufen Pankreas-Vorläuferzellen umfangreiche Proliferation, Differenzierung und Morphogenese zu bilden schließlich ein reifes und funktionalen Organs 2,4. Derzeit dauert, wie Verzweigen in der Bauchspeicheldrüse und wie es um Vorläuferzellen Proliferation und Differenzierung verbunden ist weitgehend unbekannt. Pancreatic Explantatkulturen stellen ein ideales System zur Aufklärung dieser Prozesse ex vivo 5,9,11. Durch die Kombination von Live-Cell-Imaging mit ex vivo Explantate der frühen Pankreas Knospen kann man ein klares Bild von den Ereignissen, die stattfinden, während der Bauchspeicheldrüse Morphogenese im Embryo. Dieses Video Artikel stellt einen einfachen Ansatz, um ex vivo Kulturen embryonaler Bauchspeicheldrüse auf einem Glasträger, die sie ideal für whole-mount Immunfluoreszenz und Live-Bildgebung ermöglicht etablieren.
Zahlreiche Beispiele für die Verwendung von ex vivo Pankreas Explantate zur Abbildung cell Morphologie, Wachstum und Differenzierung werden hier vorgestellt. Wichtig ist, zeigen diese Beispiele, dass embryonale kultivierten ex vivo unter Verwendung dieses Protokoll imitieren die frühen Stadien der in vivo embryonalen Pankreasentwicklung 2,3 Bauchspeicheldrüsen. Zum Beispiel initiiert Verzweigungsmittel etwa 24 Stunden nach dem Ausstreichen von E11.5 Pankreas, wie in vivo (Abbildung 2A) erwartet. Während Morphogenese und Zelldifferenzierung in den Kulturen ähnelt, dass in vivo gesehen, ist das allgemeine Wachstum der Explantate nicht vergleichbar und deutlich weniger als die in dem sich entwickelnden Embryo gesehen. Unter die Kulturbedingungen hier beschriebenen stoppen pankreatischen Explantate wachsende an Tag 5 und durchlaufen Degeneration nach einer Woche (Daten nicht gezeigt). Daher ist die berichtete ex vivo Kultivierung System begrenzt und besser geeignet für die Untersuchung der frühen Aspekte der Bauchspeicheldrüse Organogenese.
Wir stellen Ihnen hier Beispiele für ex vivo Kulturen tham gründeten wir von Wildtyp-als auch mT / mG Reporter Maus-Embryonen. Verwendung einer fluoreszierenden Reporter-Stamm ist für die Echtzeit-Bildgebung unerläßlich, wodurch die Visualisierung der zellulären und subzellulären Strukturen und die Untersuchung ihrer Dynamik in einer 3D-Umgebung. Zum Beispiel ermöglicht die Lokalisierung der mT fluoreszierendes Protein an Membranstrukturen uns genau visualisieren Zellmorphologie und Track Zelle Umbau und Migration im Laufe der Zeit in den Langerhans-Explantaten. Eines der häufigsten Probleme und Begrenzung im Live-Cell-Imaging Experimente ist Lichtschäden, die als Ergebnis einer wiederholten Exposition gegenüber Fluoreszenzanregung Beleuchtung auftreten. Im Allgemeinen muss man die Bildqualität mit der Phototoxizität Ausgleich im Rahmen der eigenen experimentellen Einstellungen. Zum Beispiel, um eine Möglichkeit zu minimieren Lichtschäden ist, um die Frequenz der Bildgebung zu reduzieren und die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Rahmen oder alternativ, um die Z-Stapel Akquisition optimierendurch Reduzieren der Anzahl von optischen Scheiben.
Schließlich ist ex vivo Kultivierung von embryonalen Pankreas ein wertvolles System zum Screening chemischer Verbindungen und ihre Wirkung auf Pankreas-Entwicklung. Die Verbindung oder Faktoren können direkt dem Kulturmedium zugegeben werden, und die Wirkungen auf die Entwicklung kann leicht unter dem Mikroskop beurteilt. Anhand der Daten-Analyse-Software, könnte man sogar quantitative Daten über die Verbreitung und das Wachstum, Dehnung, Verzweigung, Tubulogenese und Differenzierung. Es ist auch möglich, transgenen oder Knockout Gewebe verwenden, um Organkulturen schaffen oder schneller durchzuführen und Verstärkungs-loss-of-function Experimente in Explantate, zum Beispiel durch Lentivirus Transduktion oder Morpholino-Oligonucleotide, bzw. (Daten nicht gezeigt). Alle diese Ansätze erlauben würde Echtzeit-Studien von mutierten Phänotypen und weiteren Verständnis von Gen-regulatorischen Netzwerken in den Entwicklungsländern Bauchspeicheldrüse.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Research in Die Spagnoli Labor. wird von der Helmholtz-Gemeinschaft, FP7-IRG-2008-ENDOPANC Zuschuss und ERC-2009-Ab HEPATOPANCREATIC Stipendium finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
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