Summary
כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג מצוין
Abstract
הלבלב שולט בתפקודים חיוניים של הגוף שלנו, כולל ייצור של אנזימי עיכול ופיקוח על רמות סוכר בדם 1. אמנם בעשור האחרון מחקרים רבים תרמו ליסודות מוצקים להבנת organogenesis לבלב, פערים חשובים להתמיד בידע של היווצרות לבלב המוקדמת 2 שלנו. הבנה מלאה של האירועים המוקדמים הללו תספק תובנה לתוך הפיתוח של איבר זה, אלא גם למחלות חשוכות מרפא המתמקדות בלבלב, כמו סוכרת או סרטן הלבלב. לבסוף, את המידע הזה יפיק תכנית לפיתוח טיפולים להחלפת תא בהקשר של סוכרת.
במהלך התפתחות עוברת, הלבלב נובע מאוטופיות צמחה עובריות שונות של האנדודרם המעי הקדמי גב וגחון ביום עוברי (E) 9.5 בעבר עכבר 3,4. שני האוטופיות צמח evaginate לmesenchyme מקיף כepithelia מוצקניצני הליטר, שעוברים התפשטות, מסתעף ובידול לייצר איבר בגרות מלאה 2,5,6. העדויות האחרונות הראו כי צמיחה והתבדלות של תאי לבלב שושלות, כולל את β-תאים המייצרים אינסולין-, תלויות ברקמות ארכיטקטורת שיפוץ ראוי, אפיתל ומיצוב תא בתוך אפיתל לבלב הסתעפות 7,8. עם זאת, איך מסתעף המורפוגנזה מתרחשת ומתואם עם ריבוי ובידול בלבלב הוא ידוע ברובם. זה בחלקו בשל העובדה שהידע נוכחי על תהליכים התפתחותיים אלה הסתמך כמעט אך ורק על ניתוח של דגימות קבועות, תוך אירועים המוךפו"גנטי הם דינמיים מאוד.
כאן, אנו מדווחים שיטה לvivo culturing העכבר העוברי לבלב הניצנים לשעבר במנות תחתית זכוכית, המאפשרות הדמיה ישירה של לבלב הפיתוח (איור 1) ולנתח. כת זומערכת יור פתח באופן אידיאלי למיקרוסקופיה confocal סריקת הליזר, ובהדמיה בפרט, חי תאים. explants לבלב יכול להיות מוכן לא רק מעוברי עכברי סוג פראי, אלא גם מזני עכבר מהונדס גנטי (למשל מהונדס או נוקאאוט), המאפשר לימודים בזמן אמיתי של פנוטיפים מוטציה. יתר על כן, מערכת תרבות vivo לשעבר זה יקר כדי לחקור את ההשפעות של תרכובות כימיות על התפתחות לבלב, ומאפשר לקבל מידע כמוני על שגשוג וצמיחה, התארכות, הסתעפות, tubulogenesis והבחנה. לסיכום, הפיתוח של שיטת vivo לשעבר לבלב explant תרבות בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה מספק פלטפורמה חזקה להתבוננות אירועים המוךפו"גנטי ובידול כפי שהם מתרחשים בתוך עובר העכבר המתפתח.
Protocol
הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מהטכניקה המתוארת במקור בפרסיבל ו9 מרווח והמותאם למיקרוסקופיה confocal.
1. ציפוי של מנות תרבות תחתית הזכוכית
יש לבצע את הפעולות הבאות בתנאים סטריליים בברדס זרימה למינרית.
- explants לבלב מתורבת בצלחות פטרי 35-מ"מ עם זכוכית קוטר microwell תחתון 20-מ"מ (למשל מאטק תאגיד). השתמש בצלחת תחתית כוס אחת לתרבות explant ולכל משכה של התרבות. ביום שלפני הנתיחה והבידוד של ניצני הלבלב, מעייל microwells תחתית הזכוכית עם פיברונקטין.
- דלל פיברונקטין סטרילי במי תא תרבות כיתה ל50 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי ולהוסיף נפח מינימאלי שלו (~ 150 μl) לmicrowell 20-המ"מ של צלחות מאטק מכסות את משטח הזכוכית השלמה (האיור 1E). הנח את הכליםב4 מעלות צלזיוס במשך דגירת מקרר למשך הלילה.
- ביום הנתיחה, לשאוב פיברונקטין, לשטוף עם מי microwell תא תרבות כיתה ולהוסיף נפח מינימאלי של 150 μl של BME (Basal הבינוני נשר) בינונית בתוספת עם עט / דלקת (% 1), גלוטמין (1% ) ו 50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין [בינוני Dissection]. להשאיר את הכלים המצופים בברדס הזרימה למינרית עד מוכן לצלחת את explants.
אם לא כל המנות פיברונקטין מצופים משמשות, הם יכולים להיות מאוחסנים במשך עד שבוע 1 ב 4 ° C. אל תשאירו הכלים להתייבש, ממלאים אותם בינוני Dissection ולמקם אותם במקרר.
בנוסף לפיברונקטין, explants לבלב כבר בהצלחה בתרבית על מצעים שונים, כגון 9 laminin, matrigel 10,11 או קרומי microporous 12. בשל השפעותיו על הסתעפות, אנו משתמשים פיברונקטין 9 כמצע.
2. נתיחה של Dאד orsal לבלב מE11.5 - E12.5 עוברי עכברים
- נקבות עכברי מתוזמן בהריון ביום עוברי (E) 11.5 או 12.5 מוקרבים ועוברים נאספים באמצעות מכשירים המפרקים את ניקו בעבר עם אתנול 70%. הנח את הרחם הגזור בצלחות 10-סנטימטר המכילים PBS הקר כקרח בתוספת 50 מיקרוגרם / המ"ל גנטמיצין.
- תחת stereomicroscope עם תאורה מלמעלה, הנפרד רחם למקטעי עובר בודדים באמצעות מספריים קטנים או מלקחי דומון, בעדינות לקלף את שריר הרחם ולהסיר את העוברים הבודדים, שמוקפים בdecidua. השתמש בטכניקות נתיחת עובר תקן 13 לחשוף את העוברים ולהסיר את צק החלמון וamnion. לאחר מכן, להסיר את החלק העליון של גופו של העובר (מעל הכבד) ובאזור הזנב. זה יאפשר חשיפה של איברים פנימיים (1B איור). העברת גופת האמצע של עוברים לצלחות 10-סנטימטר המכילים בינוני נתיחת BME קר כקרח.
- עכשיולהשתמש קוף רק מלמטה כדי להמחיש ולנתח את ניצן הלבלב הגבה תחת stereomicroscope. בעדינות, לפתוח את אמצע הגוף של העובר על ידי ביצוע חתך רוחבי עם מלקחיים. אתר את הקיבה והטחול. ניצן הלבלב הגבה מצורף רוחבי לאזור האחורי של הבטן (התרשים 1C). שימוש במלקחי דומון, לנתח את ניצן הלבלב הגבה ממבנים סמוכים, כגון קיבה והטחול, אבל להשאיר איזה mesenchyme סביב האפיתל (1D איור). שימוש בזכוכית פסטר פיפטה, להעביר את הניצן המבודד לתוך צלחת פטרי 35-מ"מ המכיל בינוני נתיחת BME הקר בתוספת 10% עגל בסרום עוברי [בינוני תרבות]. חזור על שלבים אלה עד שכל pancreata הם מבודדים. אם pancreata של גנוטיפים שונים מבודד, לשמור אותם בנפרד באמצעות Nunc צלחות 4-כן.
3. ציפוי ותרבות של explants לבלב
plat הסופיing של explants מתבצע בחדר תרבות רקמות ו / או בסמוך לרקמת תרבות החממה כדי למזער את התנועה פיזית של התרבויות.
- בתנאים סטריליים בברדס זרימה למינרית להחליף הבינוני Dissection BME במנות פיברונקטין מצופה מאטק עם ~ 150 μl של מדיום תרבות BME מראש חממה-ב 37 ° C.
- זהירות, להעביר את explants הלבלב למאכלים מצופים מאטק (explant אחד לכל מנה) לתרבות לטווח ארוך באמצעות זכוכית פסטר פיפטה. כדי להבטיח פיזור במהלך התרבות, mesenchyme מקיף את explants יכול להיות קרע במקצת, במידת צורך, עם מחט דקה.
- בעדינות, למקם את התרבויות ברקמות תרבות אינקובטור (37 מעלות צלזיוס; 5% CO 2) לכמה שעות כדי לאפשר את explants לצרף את microwells תחתית הזכוכית. ברגע שהם מחוברים, למלא את כלי מאטק עם מ"ל 1.5 מ"ל עד 2 מתוך התרבות בינונית BME מראש חמם-ב 37 ° C. יום הנתיחה שמכונה היום 0.
- גברipulation של תרבויות explant לבלב מתבצע בתנאים סטריליים בברדס זרימה למינרית. מדיום תרבות BME משתנה בכל יום אחר, אלא אם כן דרישות ניסיוניות להכתיב עיתוי שונה (למשל דגירה של explants עם חומרים כימיים). את explants יכול להיות מתורבת במצב זה במשך 5 ימים עד שבוע.
4. פרוטוקול כתמים immunofluorescence שלם להר explants לבלב
כל הצעדים של פרוטוקול immunofluorescence (מקיבעון להדמיה) מתבצעים באותה המנה מאטק, אשר מניבה תמונות טובות יותר מצלחת פלסטיק בעל תחתית. לאחר קיבוע, תרבויות explant לבלב לא צריכות להיות כל זמן תחת תנאים סטריליים.
- לשאוב מדיום תרבות BME ולשטוף explant פעם אחת עם 2 המ"ל 1X PBS.
- לקיבעון explant להחליף PBS עם paraformaldehyde 2 מ"ל קר כקרח 4% (PFA) והנח את הצלחת על קרח למשך 20 דקות. מערבולת בעדינות את הצלחת מעת לזמן, אבל להימנע מפלטפורמות נדנדה, כexplant עלולה להתנתק.
- הסר PFA ולשטוף שלוש פעמי explant עם 2 מ"ל של 1X PBS למשך 10 דקות כל אחד בטמפרטורת חדר (RT).
- בלוק עם פתרון 2 מיליליטר חסימה (1X PBS + 0.1% Triton-X + דונקי 3% סרום) במשך לפחות 30 דקות ב RT.
- דלל נוגדן ראשוני בחסימת פתרון ולהוסיף ~ 150 μl של הדילול ישירות לתוך microwell 20-המ"מ של צלחות מאטק מכסה את פני השטח כולו explant לדגירת הלילה ב 4 ° C. כדי למזער את התנועות פיסיות, להוסיף נוגדן ראשוני לexplants ישירות בחדר הקר (4 מעלות צלזיוס). כדי למנוע אידוי, לפני הוספת הנוגדן, הנח את צלחות מאטק בתא לח.
- למחרת מוציא את פתרון הנוגדן ולשטוף שלוש פעמים עם 2 המ"ל 1X PBS + 0.1% Tween-20 (PBT) למשך 30 דקות כל אחד בRT.
- דללו נוגדן משני בחסימת פתרון [על פי ההמלצות של היצרן; אנו משתמשים פלואוריד בצבעים חמורים Alexa אנטי משניגופות ב1:750 דילול] ולהוסיף ~ 150 μl של הדילול ישירות לתוך microwell 20-המ"מ של צלחות מאטק, המכסה את פני שטח explant השלמים, לדגירת שעות 1-2 בRT בחושך. לcounterstaining הגרעיני, כולל Hoechst יחד עם דילול נוגדן משני. כדי למנוע אידוי, לפני הוספת הנוגדן, הנח את צלחות מאטק בתא לח.
- לשטוף שלוש פעמים עם 2 המ"ל 1X PBS + 0.1% Tween-20 (PBT) למשך 30 דקות כל אחד בRT.
- לפני ההתקנה, לשטוף פעם אחת עם 1X PBS להסיר Tween-20. הר על ידי הוספת טיפה בינונית גוברים מימי אחד (עם אנטי דהייה) לmicrowell 20-המ"מ של צלחות מאטק. בעדינות, לכסות explant עם coverslip זכוכית. הימנע מבועות אוויר.
- Explants על צלחות מאטק ניתן לראות תחת מיקרוסקופ הרגיל או ניגוד בשלב מיקרוסקופיה confocal, בהתאם למטרותיו של הניסוי. לניתוח מיקרוסקופיה confocal להשתמש בהגדרה הפוכה LSM Zeiss 700. הגדרת לייזרים מתאימים לfluorophoresed. בחר אובייקטיבי שתמונה תהיה באזור הרצוי של explant הלבלב. מטרת 10X טבילה במים מתאימה כדי לשמור על כל explant בשדה הראייה. מים או שמן טבילת יעדי 40X מתאימים להתמקד באזורים מסוימים של explant הלבלב עם רזולוציה גבוהה יותר. את explants יכול להיות אופטי נותח ולאחר מכן רכשו Z-הערימות שוחזרו ב 3D, באמצעות תוכנה מתאימה.
5. פרוטוקול ההדמיה Live-תא של explants לבלב
- התקנה קאמרית סביבתית: שימוש מתחם סביבתי ותא דגירה קטנה [עם 2 בקרת הטמפרטורה וCO] שיושבת על במת מיקרוסקופ. culturing התקין של הלבלב העוברי דורש טמפרטורה יציבה של 37 מעלות צלזיוס ואווירה מבוקרת של CO 5% humidified 2. תאים מתאימים זמינים ממספר ספקים (למשל, צייס, ניקון, אולימפוס). להרכיב את תיבת התנור ולהפעיל אותוt 1 שעה לפחות לפני שמתחילה הדמיה כדי לאפשר את הציוד כדי להתחמם ולאזן 2 תוכן CO עד 5%.
- עבור הדמית זמן לשגות של תרבויות explant לבלב, אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוך LSM Zeiss 700. ללייזרים ובחירה אובייקטיבית לראות את הנקודה 4.10.
- בואו explant הלבלב לצרף גם לצלחת זכוכית התחתונה לפני תחילת ההדמיה החייה. [אנחנו בדרך כלל לבצע הדמיה חייה מתחילה ביום 1].
במכסת מנוע זרימה למינרית, לשאוב ולהחליף את מדיום explant עם מדיום התרבות טרי BME להתחיל עם תנאים תזונתיים אופטימליים. - בעדינות להעביר את explants לחדר מיקרוסקופ ולמקם את צלחת מאטק בתא הדגירה לבעל הדגימה של confocal מיקרוסקופ.
- הכן האובייקטיבי (למשל להוסיף שמן או מים בינוניים לפי הבחירה אובייקטיבית טבילה) ולהתמקד באזור של עניין בexplant. סגור את תא הסביבה כראוי. כדי למנוע אידוי במהלך זמן לשגותרכישה עם יעדי טבילה במים, במקום של מים מומלץ להשתמש בנוזלי טבילה צמיגים כי הם זמינים מסחריים (למשל Zeiss Immersol W).
- הגדר את עוצמת ליזר, פרמטרים לרכישת Z-מחסנית ומרווח זמן (ראה גם דיון לפתרון בעיות). להתחיל בניסוי.
- לאחר ההדמיה, יצוא Z ערימות וכל נקודתי הזמן ולנתח אותם באמצעות תוכנה מתאימה (למשל ImageJ, Volocity, Imaris, הויגנס).
6. נציג תוצאות
ניצני לבלב הגבו (יחד עם mesenchyme הסביבה) נותחו מעוברי עכברים בין E11.5 וE12.5 והציפוי ישירות על מנות תרבות תחתית זכוכית (איור 1). כלי דם נמצאים בmesenchyme מקיף את האפיתל וניתן דמיינו ידי immunostaining לסמן אנדותל 12 Pecam (מידע לא מוצג). לאחר ימים של התרבות, und explants לבלבerwent צמיחה משמעותית והתחיל להתארגן במבנים מסועפים אפיתל, גרעינים שהיו חיוביים לגורם שעתוק הלבלב, Pdx1 (איור 2A-C). Z-העובי הממוצע של explants לבלב ביום 3 של התרבות הוא 60-80 מיקרומטר. פני השטח והנפח של explants ניתן למדוד באמצעות תוכנות מתאימות (למשל Huygens). מורפולוגיה וimmunofluorescence ניתוחים הראו כי explants לבלב התרבית באמצעות פרוטוקול זה סכם בבידול vivo מוקדם לבלב ואירועים המוךפו"גנטי 5,10,11,14 (איור 2). explants לבלב ביום 4 לתרבות עבר "טיפ וגזע" אופייני פרדה של האפיתל 8, מציגה cpa1 + תאי אב בקצות ענפי אפיתל (האיור 2C) ו+ אינסולין מובחן וגלוקגון התאים + המאורגנים כמו אשכולות בתוך תא המטען (האיור 2D ). בנוסף, pancreatiאפיתל ג בתרבויות vivo לשעבר הראה ארגון cytoskeleton נכון וקוטביות תא, עם לוקליזציה קודקוד של F-תקטין (2E איור, בירוק) וB1-integrin בקרומי basal (2E איור, באדום).
ללמוד לבלב הסתעפות בזמן האמת, explants לבלב העוברי בודדו ממתח כפול צבע ניאון כתב העכבר 15 membrane-Tomato/membrane-Green (mT / מיליגאוס; עכבר זן זמין בג'קסון המעבדה) (איור 3). עדיין פריימים מתוך סרט זמן לשגות של explants לבלב הר / מיליגאוס גדל בתרבית מוצגים באיור 3. הלוקליזציה של החלבון פלואורסצנטי mT למבנים קרומיים מתארת מורפולוגיה של תאים ומאפשרת רזולוציה של תהליכים תאיים גלם המאפשרים לעקוב אחר שיפוץ תא והגירה לאורך זמן.
לאחר ניסוי 12-HR זמן לשגות אות פלואורסצנציה mT נשארת קיימא וdetectable, למרות עוצמתו היא מופחתת, ככל הנראה בשל ניזקי שמש (איור 3). פתרונות טכניים כדי למנוע או לצמצם את ניזקי שמש וphototoxicity הם דנו בסעיף הדיון.
איור 1. ייצוג סכמטי של נתיחת ניצן הלבלב הגבה מעבר העכבר E12.5. (א) תמונת brightfield של עובר העכבר E12.5. פלג הגוף העליון של העובר (מעל הכבד) ובאזור הזנב יוסר לבודד אמצע הגוף (B). חתכים שמוצגים על ידי קווים מקווקווים אדומים. (C) תוצאות נתיחה נוספות בחשיפה של הקיבה והתריסריון האזור (מסומנת בתיבה המקווקות). ניצן הלבלב הגבה (ראה עיגול אדום מקווקו) הוא בבסיס של הקיבה ובסמוך לprimordium הטחול. ניצן הלבלב הגבה הגזור (ד ') מועבר בפסטר פיפטה בmicrowell של צלחת תחתית זכוכית המכילה מדיום התרבות BME (E, F). קיצורים: STO (בטן), SP (טחול), DP (ניצן לבלב הגבה), צמד (תריסריון). ברי סולם, 1000 מיקרומטר (A, C).
איור 2. ניתוח immunofluorescence confocal שלם הר של תרבויות explant לבלב. (A) תמונות של brightfield explants לבלב ביום 1 ויום 2 לתרבות vivo לשעבר. קו מקווקו אדום מציין חניכה של הסתעפות של האפיתל. (ב) שיקום 3D של כל הר-immunostaining לPdx1 על תרבות לבלב היום 3. explants הלבלב הראה tubules של Pdx1 תאים + עוברים הסתעפות נרחבת של 48 שעות של תרבויות. (ג) immunostaining שלם ההר explant לבלב היום 3 עם נוגדנים נגד סמן basolateral קרום הדואר cadherin (ECAD), סמן מוליד קצה, Carboxypeptidase 1 (Cpa1) וH3 phospho-היסטון (pHH3). רוב המיטוטי הפעילים pHH3 + תאי colocalize בקצות הפריפריה עם Cpa1 תאים +. l המקווקואינס עולה קצה של הסניפים. (ד) כל immunostaining-Mount לסמנים אנדוקריניות שושלת, אינסולין (INS) וגלוקגון (Gluca) ביום 3. חצים צהובים מצביעים על אשכולות של Ins + וGluca תאים +. הבלעה (ד '),-גבוהה יותר גדלה של אחד מצביר התאים האנדוקרינית. (ה) כל immunostaining-הר explant לבלב היום 3 לPdx1, β1 integrin (β1int) ו-F-תקטין (עובדה). תאי mesenchymal (כוכביות) זורים בין תאי האפיתל Pdx1 חיוביים. תמונות מוצגות בC, D ו-E הן סעיפים אופטיים confocal יחידים של Z-סדרה. ברי סולם, 100 מיקרומטר (A, B); 50 מיקרומטר (CE).
איור 3. הדמיה חייה תאי נציג explant לבלב vivo לשעבר המתורבת. (AD) מסגרות מסרט הזמן לשגות של explant לבלב מעובר mT / מיליגאוס עכבר מהונדס. זמן של הדמיה מוצג בשעות: דקות. Explant היה צלם מתחיל ביום 1. Z-מחסנית תמונותנרכשו במטרת טבילת שמן 40X כל 12 דקות עבור סכום כולל של 15 שעות. קווים מקווקווים מצביעים על קצה של ענפים והגבול בין האפיתל וmesenchyme. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ברגע שגורל לבלב מצוין, ותאי לבלב לעבור התפשטות נרחבת, בידול והמורפוגנזה סופו של דבר ליצירת איבר בוגר ותפקודי 2,4. נכון לעכשיו, איך ההסתעפות מתרחשת בלבלב ואיך זה קשור לריבוי מולידו ובידול היא במידה רבה לא ידוע. תרבויות explant לבלב מייצגות מערכת אידיאלית להבהיר תהליכים אלה vivo לשעבר 5,9,11. על ידי שילוב הדמיה חייה תאים עם explants vivo לשעבר של ניצני לבלב המוקדמים ניתן לקבל תמונה ברורה של האירועים שמתרחשים במהלך המורפוגנזה לבלב בעובר. מאמר זה מציג וידאו בגישה פשוטה להקמת תרבויות vivo לשעבר של לבלב עוברי על תמיכת זכוכית, מה שהופך אותם אידיאליים לכל הר-immunofluorescence והחי הדמיה.
דוגמאות רבות של השימוש בexplants הלבלב vivo לשעבר להדמית גמורפולוגיה ell, צמיחה ובידולו מוצגים כאן. חשוב לציין, דוגמאות אלו מראות כי עוברי לבלב vivo לשעבר תרבותי באמצעות פרוטוקול זה לחקות את השלבים המוקדמים של פיתוח בלבלב עוברי vivo 2,3. לדוגמה, הסתעפות יוזמת כ 24 שעות לאחר ציפוי של לבלב E11.5, כצפויה in vivo (איור 2 א). בעוד המורפוגנזה והתמיינות תאים בתרבויות דומה מאוד לזו שנצפו בvivo, הצמיחה הכוללת של explants אינה בר השוואה, והרבה פחות מזה שנראה בעובר המתפתח. על פי תנאי התרבות המתוארת כאן, explants הלבלב להפסיק לגדול ביום 5 ולעבור ניוון אחרי שבוע אחד (מידע לא מוצג). לכן, מערכת culturing vivo לשעבר דיווחה מוגבלת ומתאימה יותר לחקירת היבטים מוקדמים של organogenesis לבלב.
אנו מציגים דוגמאות של תרבויות ה vivo לשעבר כאןבהקמנו מ, כמו גם עוברי עכברי סוג פראי הר / מיליגאוס כתב. השימוש בלחץ כתב ניאון הוא הכרחי עבור הדמיה בזמן אמת, המאפשר הדמיה של מבנים תאיים וsubcellular ולימוד הדינמיקה שלהן בסביבת 3D. לדוגמה, הלוקליזציה של החלבון פלואורסצנטי mT למבנים קרומיים מאפשרת לנו לחזות במדויק מורפולוגיה תא ותא שיפוץ מסלול והגירה על פני הזמן בexplants הלבלב. אחד של הבעיה והמגבלה השכיחות ביותר בניסויי הדמיה לחיות סלולריים הוא ניזקי שמש שעלולה להתרחש כתוצאה מחשיפה חוזרת ונשנית להארת עירור קרינה. באופן כללי, יש לאזן את איכות תמונה עם phototoxicity בהקשר של ההגדרות הניסיוניות שלה. לדוגמה, כדי למזער את ניזקי שמש אפשרות אחת הוא להפחית את התדירות של הדמיה ולהגדיל את פער זמנים בין מסגרות רצופות או, לחלופין, כדי לייעל את רכישת מחסנית Zעל ידי צמצום מספר הפרוסות אופטיות.
לבסוף, culturing vivo לשעבר של לבלב עוברי הוא מערכת יקרה להקרנת תרכובות כימיות והשפיע על התפתחות לבלב. המתחם או הגורמים ניתן להוסיף ישירות לתרבות הבינונית וניתן להעריך את ההשפעות התפתחותיות בקלות תחת מיקרוסקופ. שימוש בתוכנה לניתוח נתונים, אפשר אפילו לקבל נתונים כמותיים על שגשוג וצמיחה, התארכות, הסתעפות, tubulogenesis והבחנה. כמו כן ניתן להשתמש ברקמות מהונדסות או נוקאאוט להקים תרבויות איברים או לבצע רווח ופסד של פונקציה מהר יותר בניסויי explants, למשל באמצעות oligonucleotides morpholino תמרת lentivirus או, בהתאמה (נתונים אינם מוצגים). כל הגישות הללו תאפשרנה לימודים בזמן אמת של פנוטיפים מוטציה והבנה נוספת של רשתות גני רגולטורים בלבלב מתפתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר ב Spagnoli המעבדה. ממומן על ידי אגודת הלמהולץ, FP7-IRG-2008-ENDOPANC המענק וגרנט HEPATOPANCREATIC ERC-2009 החל-.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
