Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåte for isolering, kultur og manipulering av mus embryonale bukspyttkjertelen. Dette representerer et utmerket
Abstract
Bukspyttkjertelen styrer vitale funksjoner i kroppen vår, inkludert produksjon av fordøyelsesenzymer og regulering av blodsukkeret en. Selv i det siste tiåret mange studier har bidratt til et solid fundament for å forstå bukspyttkjertelen organogenese, viktige hull vedvarer i vår kunnskap om tidlig bukspyttkjertelen formasjon 2. En fullstendig forståelse av disse tidlige hendelser vil gi innsikt i utviklingen av dette organet, men også i uhelbredelige sykdommer som er rettet mot bukspyttkjertelen, som diabetes eller kreft i bukspyttkjertelen. Til slutt, vil denne informasjonen generere en blåkopi for å utvikle celle-erstatning terapi i sammenheng med diabetes.
Under embryogenesen stammer bukspyttkjertelen fra forskjellige embryonale utvekster av dorsal og ventral forutgående endoderm på embryonale dag (E) 9.5 i musen embryo 3,4. Begge utvekster evaginate i det omkringliggende mesenchyme som solid epithelial knopper, som gjennomgår spredning, forgrening og differensiering for å generere et fullt moden organ 2,5,6. Nylige bevis har antydet at vekst og differensiering av bukspyttkjertelen celle linjene, inkludert insulin-produserende β-celler, avhengig av riktig vev-arkitektur, epitelisk ombygging og celle posisjonering innen den forgrenede bukspyttkjertelen epitel 7,8. Men hvordan forgrening morphogenesis oppstår og er koordinert med spredning og differensiering i bukspyttkjertelen er i stor grad ukjent. Dette er delvis på grunn av det faktum at dagens kunnskap om disse utviklingsprosesser har lettelse nesten utelukkende på analyse av faste prøver, mens morfogenetisk hendelser svært dynamiske.
Her, rapporterer vi en fremgangsmåte for dissecting og dyrking mus embryonale bukspyttkjertelen knopper ex vivo på glassbunn retter, som tillater direkte visualisering av fremkallende bukspyttkjertelen (figur 1). Denne kultenure systemet er ideelt utviklet for konfokal laserskanning mikroskopi og, i særdeleshet, live-celle bildebehandling. Pankreatisk eksplanter kan fremstilles ikke bare fra villtype mus embryoer, men også fra genmanipulerte muselinjer (f.eks transgen eller knockout), slik sanntidsdata studier av mutante fenotyper. Dessuten er denne ex vivo kultursystem verdifullt å studere effektene av kjemiske forbindelser på bukspyttkjertelen utvikling, slik å skaffe kvantitative data om spredning og vekst, forlengelse, forgrening, tubulogenesis og differensiering. I konklusjonen, gir utviklingen av en ex vivo bukspyttkjertelen eksplantering kultur metode kombinert med høy oppløsning en sterk plattform for å observere morfogenetisk og differensiering hendelser som de oppstår innenfor utvikling musen embryo.
Protocol
Protokollen er beskrevet her har blitt tilpasset fra teknikken opprinnelig beskrevet i Percival og slakk 9 og optimalisert for konfokal mikroskopi.
1. Belegg av Glass Bottom kultur retter
Følgende trinn bør utføres under sterile betingelser i en laminær strømningshette.
- Bukspyttkjertelen explants dyrkes i 35-mm petriskåler med 20-mm diameter glass mikrobrønn bunnen (f.eks Mattek Corporation). Bruk ett glass nederst parabolen per eksplantering kultur og for hele varigheten av kulturen. På dagen før disseksjon og isolering av bukspyttkjertelen knopper, jakke glass nederst mikrobrønnene med fibronektin.
- Fortynnes steril fibronektin i cellekultur-gradert vann til en 50 ug / ml endelig konsentrasjon og legge et minimumsvolum av det (~ 150 pl) inn i 20-mm mikrobrønn av Mattek platene dekker hele glassoverflaten (figur 1E). Plasser rettenei et 4 ° C kjøleskap for inkubering over natten.
- På dagen for disseksjon, suge fibronektin, skyll mikrobrønn med cellekultur-grade vann og tilsett et minimum volum på 150 ul BME (Basal Medium Eagle) medium supplert med penn / Strep (1%), Glutamin (1% ) og 50 ug / ml Gentamicin [Disseksjon medium]. La de belagte retter i laminær hette før du er klar til plate de explants.
Hvis ikke alle fibronektin belagte retter blir brukt, kan de bli lagret i opptil 1 uke ved 4 ° C. Ikke la rettene tørke, fyll dem med Dissection Medium og plassere dem i kjøleskapet.
I tillegg til fibronektin, har pancreatic eksplanter blitt dyrket på forskjellige substrater, for eksempel 9 laminin Matrigel 10,11 eller mikroporøse membraner 12. På grunn av dens virkninger på forgrening, bruker vi fibronektin 9 som substrat.
2. Disseksjon av DØrsal bukspyttkjertelen Bud fra E11.5 - E12.5 Mouse Embryos
- Tidsbestemt-gravide hunnmus på embryonale dag (E) 11,5 eller 12,5 er ofret og embryo er samlet inn ved hjelp dissecting instrumenter tidligere rengjøres med 70% etanol. Plasser den dissekerte livmoren i 10-cm skåler inneholdende iskald PBS supplert med 50 ug / ml gentamicin.
- Under en stereomikroskop med belysning ovenfra, separat livmoren i individuelle embryo segmenter ved hjelp av små saks eller Dumont tang, forsiktig skrelle bort muskel av livmor og ta den enkelte embryo, som er omgitt av decidua. Bruk standard embryo disseksjon teknikker 13 for å avdekke embryoer og fjerne plommesekken og amnion. Deretter fjerner overkroppen av embryoet (over leveren) og halen regionen. Dette vil tillate eksponering av indre organer (figur 1B). Overfør midten av kroppen av embryoer i 10-cm plater som inneholder iskald BME disseksjon medium.
- NåBruk bare transillumination nedenfra å visualisere og å dissekere dorsal bukspyttkjertelen knopp under stereomikroskop. Forsiktig, åpne midten av kroppen av embryoet ved å lage en lateral snittet med tang. Finn magen og milten. Den dorsale bukspyttkjertelen knoppen er festet lateralt til bakre region av magesekken (figur 1C). Bruke Dumont tang, dissekere bort dorsal bukspyttkjertelen knopp fra tilgrensende strukturer, slik som magen og milten, men etterlot noen mesenchyme rundt epitelet (figur 1D). Hjelp av en glass Pasteur-pipette, overføre den isolerte knoppen inn en 35-mm petriskål inneholdende kaldt BME disseksjon medium supplert med 10% føtalt kalveserum [dyrkningsmedium]. Gjenta disse trinnene til alle pancreata er isolert. Hvis pancreata av ulike genotyper er isolert, holde dem adskilt med Nunc 4-brønners plater.
3. Plating og kultur Bukspyttkjertelen explants
Endelig plating av eksplanter utføres i vevskultur rom og / eller i umiddelbar nærhet til vevet kulturinkubatoren å minimere fysisk bevegelse av kulturene.
- Under sterile betingelser i en laminær strømningshette erstatte BME Dissection medium i fibronektin-belagte Mattek retter med ~ 150 ul BME dyrkningsmedium forvarmes ved 37 ° C.
- Nøye, overføre bukspyttkjertelen explants inn belagte Mattek retter (ett eksplantering per parabol) for langsiktig kultur med et glass Pasteur pipette. Å sikre spredning under kultur, kan mesenchyme omgir eksplanter bli litt dratt, om nødvendig, med en fin nål.
- Forsiktig, legg kulturer i en vev kulturinkubatoren (37 ° C, 5% CO 2) for noen timer for å la explants feste til glassbunn mikrobrønnene. Når de er festet, fylle opp Mattek retter med 1,5 ml til 2 ml av BME kulturmediet forvarmes ved 37 ° C. Dagen for disseksjon kalles dag 0.
- Manipulation av pancreatic eksplantasjon kulturene utføres under sterile betingelser i en laminær strømningshette. Den BME kultur medium er endret annenhver dag, med mindre eksperimentelle krav diktere forskjellig timing (f.eks inkubasjon av explants med kjemiske midler). De eksplanter kan dyrkes i denne tilstanden i 5 dager opp til en uke.
4. Hel-mount Immunofluorescence Staining Protokoll for Bukspyttkjertelen explants
Alle trinnene i immunfluorescens protokollen (fra fiksering til avbildning) blir utført i det samme Mattek parabol, som gir bedre bilder enn en plast bunn parabolen. Etter fiksering, gjør pancreatic eksplantasjon kulturer ikke må holdes under sterile betingelser.
- Aspirer BME kulturmedium og vask eksplantasjon gang med 2 ml 1X PBS.
- For eksplantering fiksering erstatte PBS med 2 ml iskald 4% paraformaldehyd (PFA) og sett formen på is i 20 min. Virvel plate forsiktig fra tid tiltid, men unngå Risteapparatene, som eksplantering kan løsne.
- Fjern PFA og vaske eksplantasjon tre ganger med 2 ml av 1X PBS i 10 minutter hver ved romtemperatur (RT).
- Blokk med 2 ml blokkering løsning (1X PBS + 0,1% Triton-X + 3% Donkey Serum) i minst 30 minutter ved RT.
- Fortynnes primære antistoff i blokkering løsning og tilsett ~ 150 pl av fortynningen direkte inn i 20-mm mikrobrønn av Mattek platene dekker hele eksplantasjon overflaten for inkubering over natten ved 4 ° C. For å minimere fysiske bevegelser, legge primære antistoff til eksplanter direkte i kaldt rom (4 ° C). For å hindre fordamping, før du legger antistoff, legg Mattek platene i et fuktig kammer.
- Neste dag fjerne antistoff løsningen og vask tre ganger med 2 ml PBS 1X + 0,1% Tween-20 (PBT) i 30 minutter hver ved RT.
- Fortynne sekundært antistoff i blokkering løsning [i henhold til produsentens anbefalinger, vi bruker esel Alexa Fluor fargestoffer videregående antiorganer på 1:750 fortynning] og legge ~ 150 pl av fortynningen direkte inn i 20-mm mikrobrønn av Mattek platene, som dekker hele eksplantasjon overflaten, for 1-2 timers inkubasjon ved RT i mørket. For kjernefysisk kontrafarging inkluderer Hoechst sammen med sekundært antistoff fortynning. For å hindre fordamping, før du legger antistoff, legg Mattek platene i et fuktig kammer.
- Vask tre ganger med 2 ml PBS 1X + 0,1% Tween-20 (PBT) i 30 minutter hver ved RT.
- Før påsettingen vaskes én gang med 1X PBS for å fjerne Tween-20. Montere ved tilsetning en dråpe av vandig monteringsmedium (med anti-fading) inn i 20-mm mikrobrønn av Mattek platene. Forsiktig, dekke eksplantering med et dekkglass. Unngå luftbobler.
- Explants på Mattek plater kan sees under standard fase kontrast mikroskopi eller konfokalmikroskopi, avhengig av målene i eksperimentet. For konfokalmikroskopi analyse bruker vi en Zeiss LSM 700 invertert innstilling. Sett opp egnede lasere for fluorophores ossed. Velg et mål som vil bildet den ønskede delen av bukspyttkjertelen eksplantering. En 10X vann-nedsenking Målet er egnet til å holde hele eksplantasjon i synsfeltet. En 40X vann-eller olje-immersion mål er egnet til å fokusere på bestemte områder av bukspyttkjertelen eksplantering med større oppløsning. De explants kan være optisk delt og deretter kjøpte Z-stabler rekonstruert i 3D, ved hjelp av egnet programvare.
5. Live-celle Imaging-protokollen av Bukspyttkjertelen explants
- Miljøkammeret oppsett: bruk en miljømessig kabinett og en liten inkubasjon kammer [med temperatur og CO 2 kontroll] som sitter på mikroskopet scenen. Riktig dyrkning av embryonale bukspyttkjertelen trenger en stabil temperatur på 37 ° C og en kontrollert atmosfære av fuktet 5% CO 2. Egnede kamre er tilgjengelige fra flere leverandører (F.eks Zeiss, Nikon, Olympus). Monter varmeren boksen og slå den på ent minst 1 time før avbildning begynner å tillate utstyret å varme opp og stabilisere CO 2 innhold til 5%.
- For time-lapse avbildning av bukspyttkjertelen eksplantering kulturer, bruker vi en Zeiss LSM 700 invertert mikroskop. For lasere og objektiv utvalg se punkt 4.10.
- La bukspyttkjertelen eksplantering feste godt til glass-bunn rett før du starter live imaging. [Vi vanligvis opptre live avbildning starter på dag 1].
I en laminær hette, Aspirer og erstatte eksplantasjon medium med fersk BME dyrkningsmedium å starte med optimale næringsforhold. - Forsiktig overføre explants til mikroskopet rom og plasser Mattek rett i inkubasjonstiden kammeret i prøven innehaveren av confocal mikroskop.
- Forbered målet (f.eks tilsett olje eller vann-medium i henhold til valg av nedsenking mål) og fokusere på regionen av interesse i eksplantering. Lukk miljøkammeret skikkelig. For å hindre fordamping under time-lapseanskaffelse med vann-nedsenking mål, i stedet for vann er det anbefalt å bruke viskøse immersion fluider som er kommersielt tilgjengelig (f.eks Zeiss Immersol W).
- Sett opp laser intensitet, Z-stack oppkjøp parametere og tidsintervall (se også diskusjon for feilsøking). Starte eksperimentet.
- Etter bildebehandling, eksport Z stabler og alle tidspunkter og analysere dem ved hjelp av egnet programvare (f.eks ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).
6. Representant Resultater
Dorsal bukspyttkjertelen knopper (sammen med omkringliggende mesenchyme) ble dissekert fra mus embryoer mellom E11.5 og E12.5 og belagt direkte på glassbunn kultur retter (figur 1). Blodkar er tilstede i mesenchyme omgir epitel og kan visualiseres ved farging for endotelial markør Pecam 12 (data ikke vist). Etter to dager med kultur, bukspyttkjertel explants underwent betydelig vekst og begynte å organisere seg i forgrenede epiteliale strukturer, som kjerner var positive for bukspyttkjertelen transkripsjonsfaktor, Pdx1 (figur 2a-c). Gjennomsnittlig z-tykkelse av pankreas explants på dag 3 av kultur er 60-80 mikrometer. Overflaten og volumet av eksplanter kan måles ved hjelp av egnede programvare (f.eks Huygens). Morfologi og immunfluorescens analyser viste at bukspyttkjertelen explants dyrket ved hjelp av denne protokollen rekapitulert in vivo tidlig bukspyttkjertelen differensiering og morfogenetisk hendelser 5,10,11,14 (figur 2). Bukspyttkjertelen explants på dag 4 av kultur gjennomgikk typiske "tips og trunk" segregering av epitel 8, viser cpa1 + stamceller ved tuppen av epiteliale grener (figur 2C) og differensiert insulin + og glukagon + celler organisert som klynger inni stammen (Figur 2D ). I tillegg pancreatic epitel i ex vivo kulturer viste riktig cytoskjelettet organisasjon og celle polaritet, med apikal lokalisering av F-aktin (figur 2E, i grønt) og b1-integrin på basale membraner (figur 2E, i rødt).
Å studere bukspyttkjertelen forgreninger i sanntid, ble embryonale pancreatic eksplanter isolert fra tofarget fluorescerende reporter mus stamme membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mt / mg; mus stamme er tilgjengelig på Jackson Laboratory) (Figur 3). Stillbilder fra en time-lapse film av MT / mG bukspyttkjertelen explants dyrket i kultur er vist i figur 3.. Lokalisering av mT fluorescerende protein til membran strukturer skisserer celle morfologi og lar oppløsning av fine cellulære prosesser, slik at å spore celle ombygging og migrasjon over tid.
Etter en 12-timers time-lapse eksperimentet mT fluorescens signalet forblir levedyktig og Detectable, selv om intensiteten er redusert, mest sannsynlig på grunn av photodamage (figur 3). Tekniske løsninger for å unngå eller redusere photodamage og fototoksisitet er omtalt i diskusjon delen.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av dorsal bukspyttkjertelen bud disseksjon fra E12.5 mus embryo. (A) Lysfelt bilde av E12.5 mus embryo. Overkroppen av embryoet (over leveren) og halen regionen er fjernet for å isolere midten av kroppen (B). Snittene blir vist med røde stiplede linjer. (C) Videre disseksjon resulterer i eksponering av magesekken og tolvfingertarmen regionen (angitt med stiplet boks). The dorsal bukspyttkjertelen knopp (se rød stiplet sirkel) er på bunnen av magen og ved siden av milten primordium. Den dissekerte dorsal bukspyttkjertelen BUD (D) overføres med en Pasteur pipette i mikrobrønn av et glass nederst parabolen inneholdende BME dyrkingsmedium (E, F). Forkortelser: STO (mage), SP (milt), dp (dorsal bukspyttkjertelen knopp), duo (tolvfingertarmen). Scale barer, 1000 mikrometer (A, C).
Figur 2. Hel-mount confocal immunfluorescens analyse av bukspyttkjertelen eksplantering kulturer. (A) lysfelt bilder av bukspyttkjertelen explants på dag 1 og dag 2 av ex vivo kultur. Rød stiplet linje indikerer initiering av forgrening av epitel. (B) 3D rekonstruksjon av hel-mount farging for Pdx1 på dag 3 bukspyttkjertelen kultur. Bukspyttkjertelen explants viste tubuli Pdx1 +-celler som gjennomgår omfattende forgrening av 48 hr av kulturer. (C) Whole-mount farging av dag 3 bukspyttkjertelen eksplantering med antistoffer mot basolateral membran markør E-cadherin (ECAD), tip stamfar markør, Carboxypeptidase 1 (Cpa1) og fosfor Histone H3 (pHH3). Mesteparten av den mitotiske aktiv pHH3 + celler colocalize på de perifere tips med Cpa1 + celler. Dashed lines indikerer tips av grenene. (D) Hel-mount farging for endokrine avstamning markører, insulin (Ins) og glukagon (Gluca) på dag 3. Gule piler indikerer klynger av Ins + og Gluca + celler. Inset (D '), høyere-forstørrelse av en av de endokrine cellen klyngen. (E) Whole-mount farging av dag 3 bukspyttkjertelen eksplantering for Pdx1, β1 integrinet (β1int) og F-aktin (Fakta). Mesenchymalceller (stjernetegn) samt blant Pdx1-positive epitelceller. Bildene som vises i C, D og E er single confocal optiske deler av Z-serien. Scale barer, 100 mikrometer (A, B), 50 mikrometer (CE).
Figur 3. Representative live-cell imaging av ex vivo kultivert bukspyttkjertelen eksplantering. (AD) rammer fra en time-lapse film av en bukspyttkjertelen eksplantering fra en mT / mG mus transgene embryo. Tidspunkt for avbildning vises i timer: minutter. Den eksplantering ble fotografert starter på dag 1. Z-stack bilderble ervervet med en 40X neddyppingsobjektivet hver 12 min for totalt 15 timers. Stiplede linjer indikerer spissen av grenene og grensen mellom epitel og mesenchyme. Målestokk, 50 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Når bukspyttkjertelen skjebne er spesifisert, bukspyttkjertelen stamceller gjennomgår omfattende spredning, differensiering og morphogenesis til slutt danne en moden og funksjonell organ 2,4. I dag, tar hvordan forgreininger sted i bukspyttkjertelen, og hvordan den er koblet til stamcellemobilisering proliferasjon og differensiering er stort sett ukjent. Bukspyttkjertelen Eksplantasjon kulturer representerer et ideelt system for å belyse disse prosessene ex vivo 5,9,11. Ved å kombinere live-cell imaging med ex vivo explants av tidlig bukspyttkjertelen knopper kan man få et klart bilde av hendelsene som finner sted under bukspyttkjertelen morphogenesis i embryo. Denne videoen artikkelen presenterer en enkel tilnærming til å etablere ex vivo kulturer av embryonale bukspyttkjertelen på et glass-støtte, noe som gjør dem ideelle for hel-mount immunfluorescens og live imaging.
Tallrike eksempler på bruk av ex vivo pancreatic eksplanter for imaging cell morfologi, vekst og differensiering er presentert her. Viktigere, disse eksemplene viser at embryonale pancreases kultivert ex vivo ved hjelp av denne protokollen etterligne de tidlige stadiene av in vivo embryonale bukspyttkjertelen utvikling 2,3. For eksempel, initierer forgrening ca 24 timer etter plating av E11.5 bukspyttkjertelen, som forventet i vivo (figur 2A). Mens morphogenesis og celledifferensiering i kulturer ligner det man ser i vivo, er den samlede veksten av explants ikke sammenlignbare, og betydelig mindre enn det man ser i utvikling av embryo. Under kultur forholdene som er beskrevet her, bukspyttkjertel explants slutter å vokse på dag 5 og gjennomgå degenerasjon etter en uke (data ikke vist). Derfor er den rapporterte ex vivo dyrkning systemet begrenset og bedre egnet til undersøkelse av tidlige aspekter bukspyttkjertelen organogenese.
Vi presenterer her eksempler på ex vivo kulturer thpå etablerte vi fra villtype samt MT / mG reporter mus embryoer. Bruk av en fluorescerende reporter belastning er uunnværlig for sanntids avbildning, slik at visualisering av cellulære og subcellulære strukturer og studie av deres dynamikk i et 3D-miljø. For eksempel, gjør det mulig lokalisering av mT fluorescerende protein til membran strukturer oss til nettopp visualisere celle morfologi og spor celle ombygging og migrasjon over tid i bukspyttkjertelen explants. En av de mest vanlig problem og begrensning i live celle bildebehandling eksperimenter er photodamage som kan oppstå som et resultat av gjentatt eksponering for fluorescenseksitasjon belysning. Generelt har en å balansere bildekvaliteten med fototoksisitet i sammenheng med sine egne eksperimentelle innstillinger. For eksempel, for å minimalisere photodamage en mulighet er å redusere forekomsten av bildebehandling og øke tidsforløp mellom etterfølgende rammer eller, alternativt, for å optimalisere den Z stabelen oppkjøpetved å redusere antallet optiske stykker.
Endelig, er ex vivo dyrkning av embryonale bukspyttkjertelen en verdifull system for screening kjemiske forbindelser og deres effekt på bukspyttkjertelen utvikling. Forbindelsen eller faktorer kan tilsettes direkte til kulturmediet og utviklingsmessige effekter kan lett vurderes under et mikroskop. Ved hjelp av data analyse programvare, kan man selv få kvantitative data om spredning og vekst, forlengelse, forgrening, tubulogenesis og differensiering. Det er også mulig å bruke transgene eller knockout vev å etablere orgel kulturer eller utføre raskere gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter i eksplanter, for eksempel gjennom lentivirus transduksjon eller morfolino oligonukleotider, henholdsvis (data ikke vist). Alle disse tilnærmingene ville tillate sanntid studier av muterte fenotyper og videre forståelse av genregulatoriske nettverk i utviklingsland bukspyttkjertelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forskning i den Spagnoli lab. er finansiert av Helmholtz Association, FP7-IRG-2008-ENDOPANC stipend og ERC-2009-Starter HEPATOPANCREATIC Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
