Summary
Здесь мы опишем метод выделения, культура и манипуляция мышиных эмбриональных поджелудочной железы. Это представляет собой отличное
Protocol
В протоколе описаны здесь была заимствована из метод, первоначально описанный в Персиваль и Slack 9 и оптимизирован для конфокальной микроскопии.
1. Покрытие стеклянной посуды Нижний культуры
Следующие шаги должны осуществляться в стерильных условиях в ламинарном боксе.
- Рак поджелудочной эксплантов культивируют в 35-мм чашки Петри с 20-мм стекла микролуночные нижней (например Маттек Corporation). Используйте один со стеклянным дном блюдо на эксплант культуры и на протяжении всего периода культуры. За день до вскрытия и изоляции поджелудочной почки, пальто со стеклянным дном лунок с фибронектина.
- Развести стерильной фибронектина в культуре клеток-класса воде до 50 мкг / мл конечной концентрации и добавить Минимальный объем его (~ 150 мкл) в 20-мм микролуночные пластин Маттек покрывающий всю поверхность стекла (рис. 1E). Поместите блюдВ 4 ° C холодильник для инкубации в течение ночи.
- В день вскрытия, аспирации фибронектин, промыть микролуночные с культурой клеток-класс воды и добавить минимальным объемом 150 мкл BME (базальной среде Игла) среде с добавлением Pen / Strep (1%), глютамин (1% ) и 50 мкг / мл гентамицина [Dissection Средний]. Оставьте покрытием блюд в ламинаре до готовности пластины эксплантов.
Если не все, покрытой фибронектином блюд используются, они могут храниться до 1 недели при температуре 4 ° C. Не дайте высохнуть блюд, наполнить их Dissection среднего и поместить их в холодильник.
В дополнение к фибронектин, поджелудочной железы эксплантов были успешно культивировать на различных подложках, таких как ламинин 9, 10,11 матригель или микропористых мембран 12. Из-за его воздействия на ветвление, мы используем 9 фибронектина в качестве субстрата.
2. Препарирование Dorsal Bud поджелудочной железы от E11.5 - E12.5 эмбрионов мышей
- Временный беременных самок мышей в эмбриональный день (E) 11,5 или 12,5 приносятся в жертву и эмбрионов собираются с использованием инструментов рассекает предварительно очищенную с 70% этанола. Поместите расчлененный матки в 10-см пластины, содержащие ледяной PBS, дополненной 50 мкг / мл гентамицина.
- В стереомикроскопа с подсветкой сверху, отдельные матки на отдельные сегменты эмбриона с помощью небольших ножниц или щипцов Дюмон, осторожно удаляйте мышц матки и удаление отдельных эмбрионов, которые окружены децидуальной. Используйте стандартные методы рассечения эмбриона от 13 до подвергать эмбрионов и удалить желточный мешок и амнион. Впоследствии, удалить верхнюю часть тела зародыша (на печени) и хвостовой области. Это позволит воздействием внутренних органов (рис. 1б). Передача середины тела эмбрионов в 10-см пластины, содержащие ледяной BME рассечение среды.
- Сейчасиспользовать только просвечивание снизу, визуализировать и анализировать спинной поджелудочной зародыше под стереомикроскопа. Аккуратно откройте середины тела эмбриона, сделав боковой разрез щипцами. Найдите желудка и селезенки. Спинной поджелудочной зародыше крепится сбоку на заднем области желудка (рис. 1С). Использование щипцов Дюмон, рассекают от спинной поджелудочной зародыше от смежных структур, таких как желудок и селезенка, но оставляя некоторый мезенхимы вокруг эпителия (рис. 1D). Использование стеклянной пипетки Пастера перенести изолированные почки в 35-мм чашки Петри содержащий холодную среду рассечение BME с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки [Культура Средний]. Повторяйте эти действия, пока все pancreata изолированы. Если pancreata различных генотипов изолированы, храните их отдельно использовании Nunc 4-луночные планшеты.
3. Покрытие и культуры поджелудочной Экспланты
Final платформыING эксплантов осуществляется в комнатной культуре ткани и / или в непосредственной близости к культуре ткани инкубатора свести к минимуму физическое движение культур.
- В стерильных условиях в ламинаре заменить BME Средний Dissection в покрытой фибронектином блюда Маттек с ~ 150 мкл культуральной среды BME предварительно нагревают при 37 ° C.
- Осторожно, передает поджелудочной железы эксплантов в покрытых блюд Маттек (один эксплантов за блюдо) для долгосрочного культуры с помощью стеклянной пипетки Пастера. Для обеспечения распространения в культуре, окружающей мезенхимы эксплантов может быть слегка разорван, если необходимо, с помощью тонкой иглы.
- Аккуратно поместите культуры в культуре ткани инкубатора (37 ° C, 5% CO 2) в течение нескольких часов, чтобы эксплантов приложить к лунки со стеклянным дном. Как только они присоединены, заполните Маттек блюда с 1,5 мл до 2 мл культуральной среды BME предварительно нагревают при 37 ° C. В день вскрытия называют день 0.
- Человекipulation культур эксплантов поджелудочной железы проводят в стерильных условиях в ламинарном боксе. BME культуральной среде меняется каждый день, если экспериментальные требования диктуют различные сроки (например, инкубационный эксплантов с химическими агентами). Эксплантов можно культивировать в этом состоянии в течение 5 дней до одной недели.
4. Всего крепления иммунофлуоресценции протокола окрашивания для поджелудочной Экспланты
Все шаги иммунофлюоресценции протокола (от фиксации изображения) осуществляется в том же блюдо Маттек, которая дает лучшее изображение, чем пластиковые дном блюдо. После фиксации культур поджелудочной железы эксплантов не нужно хранить в стерильных условиях.
- Аспирируйте BME культуральной среды и промыть эксплантов раза с 2 мл 1X PBS.
- Для эксплантов фиксации заменить PBS с 2 мл ледяной 4% параформальдегида (PFA) и поместить блюдо на льду в течение 20 мин. Swirl планшет слегка время отвремени, но избежать качания платформы, а эксплантов может отсоединить.
- Удалить PFA и мыть эксплантов в три раза с 2 мл 1X PBS в течение 10 минут каждый при комнатной температуре (RT).
- Блок с 2 мл блокирующий раствор (1X PBS + 0,1% Triton-X + 3% Donkey сыворотки) в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Развести первичных антител в блокировании решения и добавить ~ 150 мкл разведения непосредственно в 20-мм микролуночные пластин Маттек покрывающий всю поверхность эксплантов для инкубации в течение ночи при 4 ° C. Чтобы свести к минимуму физические движения, добавить первичные антитела к эксплантов непосредственно в холодной комнате (4 ° C). Для предотвращения испарения, перед добавлением антител, разместите Маттек пластин во влажной камере.
- На следующий день удаления раствора антител и вымыть три раза с 2 мл 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
- Развести вторичные антитела в блокирующем растворе [в соответствии с рекомендациями производителя, мы используем осла Alexa Fluor красителей вторичных антиорганов на разведении 1:750] и добавить ~ 150 мкл разведения непосредственно в 20-мм микролуночные пластин Маттек, покрывающий всю поверхность эксплантов, в течение 1-2 ч инкубации при комнатной температуре в темноте. Для ядерных counterstaining, включают Hoechst вместе с вторичным разведения антител. Для предотвращения испарения, перед добавлением антител, разместите Маттек пластин во влажной камере.
- Вымойте три раза с 2 мл 1X PBS + 0,1% Tween-20 (PBT) в течение 30 минут каждый при комнатной температуре.
- Перед монтажом, мыть один раз 1X PBS, чтобы удалить Tween-20. Установить, добавив одну каплю водной среде монтаж (с защитой от выцветания) в 20-мм микролуночные пластин Маттек. Осторожно, накройте эксплантов с бокалом покровное. Избегайте пузырьков воздуха.
- Эксплантов на пластинах Маттек можно рассматривать под микроскопом стандартного фазового контраста или конфокальной микроскопии, в зависимости от целей эксперимента. Для конфокальной микроскопии анализа мы используем Zeiss LSM 700 перевернутой настройки. Установите соответствующие лазеры для флуорофоров насиздание Выберите цель, которая будет изображение нужной области поджелудочной эксплантов. 10X воды погружения цели подходят чтобы держать весь эксплантов в поле зрения. 40X целей воду или масло-погружение подходит сосредоточить внимание на конкретных регионов поджелудочной железы эксплантов с большим разрешением. Эксплантов может быть оптически разрез, а затем приобрела Z-стеки реконструирован в 3D, с использованием соответствующего программного обеспечения.
5. Онлайн-клеточной изображений протокол поджелудочной Экспланты
- Экологические настройки камеры: использовать экологические корпус и небольшой камере инкубации [с температурой и контроля CO 2], который сидит на столик микроскопа. Правильное культивирования эмбриональных поджелудочной железы требует стабильной температуре 37 ° C и контролируемой атмосфере увлажненного 5% CO 2. Подходит камерах имеются у нескольких поставщиков (Например, Zeiss, Nikon, Olympus). Соберите обогреватель окна и включите егоПо меньшей мере 1 час до начала изображения, чтобы позволить оборудования для разогрева и равновесие содержания СО 2 до 5%.
- Для покадровой визуализации поджелудочной железы культур эксплантов, мы используем Zeiss LSM 700 инвертированного микроскопа. Для лазеров и объективного выбора см. пункт 4.10.
- Пусть поджелудочной железы эксплантов приложить хорошо стеклянным дном блюдо перед началом живого изображения. [Мы обычно выполняют живые изображения, начиная с дня 1].
В ламинаре, аспирации и заменить эксплантов среде со свежей питательной среды BME, чтобы начать с оптимальными питательными условиях. - Аккуратно передачи эксплантов к микроскопу комнату и поместить блюдо Маттек в инкубационной камеры в держатель образца из конфокальной микроскопии.
- Подготовка цели (например, добавить масло или вода среды в соответствии с выбором погружения цели) и сосредоточить внимание на область интереса в эксплантов. Закройте экологической камеру правильно. Для предотвращения испарения при покадровойПриобретение водой погружения цели, вместо воды рекомендуется использовать вязкие жидкости погружения, которые являются коммерчески доступными (например, Zeiss Immersol W).
- Настройка интенсивности лазерного излучения, Z-стек параметры приобретение и временной интервал (см. также обсуждение для устранения неполадок). Начать эксперимент.
- После обработки изображений, экспорта Z стеки и все моменты времени и анализировать их с помощью соответствующего программного обеспечения (например, ImageJ, Volocity, Imaris, Гюйгенс).
6. Представитель Результаты
Спинной почек поджелудочной железы (вместе с окружающей мезенхимы) были вскрыты из мышиных эмбрионов между E11.5 и E12.5 и высевают непосредственно на стеклянное дно чашки для культивирования (рис. 1). Кровеносные сосуды присутствуют в окружающей мезенхимы и эпителия могут быть визуализированы иммунным для эндотелиальных маркеров PECAM 12 (данные не представлены). После двух дней культуры, поджелудочной железы унд эксплантовerwent значительный рост и начали объединяться в разветвленных эпителиальных структур, ядра которых были положительными на транскрипционный фактор, поджелудочной железы, Pdx1 (рис. 2A-C). Средняя г-толщина поджелудочной железы эксплантов на 3 день культуры составляет 60-80 мкм. Поверхности и объема эксплантов может быть измерена с помощью соответствующего программного обеспечения (например, Гюйгенс). Морфология и иммунофлюоресценции анализ показал, что поджелудочной железы эксплантатов культивировались с использованием этого протокола воспроизводятся в естественных условиях ранней дифференциации поджелудочной железы и морфогенетических событий 5,10,11,14 (рис. 2). Рак поджелудочной эксплантов на 4-й день культуры прошли типичный "наконечник и ствол" сегрегация эпителия 8 отображение cpa1 + клеток-предшественников на концах эпителиальные ветвей (рис. 2С) и дифференцированные + инсулин и глюкагон +-клеток организованы в кластеры внутри ствола (рис. 2D ). Кроме того, pancreatiС эпителия в бывших культур естественных условиях показали, правильную организацию цитоскелета и клеточной полярности, с апикальной локализации F-актин (рис. 2E, в зеленом) и b1-интегрина в базальных мембран (рис. 2E, красного цвета).
Для изучения поджелудочной железы ветвление в реальном времени, эмбриональной поджелудочной железы эксплантов были изолированы от двойного цвета флуоресцентных мышей штамма репортер membrane-Tomato/membrane-Green 15 (мТл / мг; мыши штамма доступен в Jackson Laboratory) (рис. 3). Кадры из покадровой фильм мТл / мг поджелудочной железы эксплантов, выращенных в культуре показано на рисунке 3. Локализация мТл флуоресцентного белка с мембранными структурами общих чертах морфологии клеток и позволяет разрешение штрафа клеточные процессы, позволяющие отслеживать реконструкции и миграции клеток с течением времени.
После 12-часов покадровой эксперимента сигнал мТл флуоресценции остается жизнеспособной и детеCTable, хотя его интенсивность снижается, скорее всего, из-за фотостарения (рис. 3). Технические решения, чтобы избежать или уменьшить фотостарения и фототоксичности обсуждается в разделе обсуждения.
Рисунок 1. Схематическое изображение спинного рассечение почки поджелудочной железы E12.5 эмбрионов мыши. (A) Светлое изображение E12.5 эмбрионов мыши. Верхняя часть тела зародыша (на печени) и хвостовой области удаляются, чтобы изолировать середины тела (B). Разрезы показаны красными пунктирными линиями. (C) Дальнейшие результаты рассечение в воздействии на желудке и двенадцатиперстной кишке область (показано пунктирной рамке). Спинной поджелудочной зародыше (см. красная пунктирная окружность) на базе живот и рядом с селезенкой зачатке. Расчлененный бутон спинной поджелудочной железы (D) переносится с пипетки Пастера в микролуночные в блюдо со стеклянным дном содержащие BME культуральной среде (E, F). Сокращения: СТО (желудок), SP (селезенка), DP (спинной поджелудочной зародыше), дуэт (двенадцатиперстной кишки). Шкала баров, 1000 мкм (A, C).
Рисунок 2. Всего крепления конфокальной иммунофлуоресцентного анализа культур поджелудочной железы эксплантов. (A) Светлое изображение поджелудочной железы эксплантов в день 1 и день 2 бывших культуры естественных условиях. Красная пунктирная линия показывает начало ветвления эпителия. (B) 3D-реконструкция целого крепление для иммунной Pdx1 на 3 день поджелудочной железы культуры. Рак поджелудочной эксплантов показал канальцев Pdx1 + клеток происходят широкие разветвления по 48 часов культур. (C) Всего крепления иммуноокрашивания дня 3 поджелудочной железы эксплантов с антителами против маркера базолатеральной мембраны E-кадгерина (ECAD), маркер чаевые предшественников, карбоксипептидазы 1 (Cpa1) и фосфорно-гистона H3 (pHH3). Большинство из митотического активных pHH3 + клеток локализуются на периферии советы с Cpa1 + клеток. Штриховые лИнес указывают кончик ветки. (D) Всего крепления иммуногистохимическое эндокринной линии маркеров, инсулин (Ins) и глюкагон (Gluca) на 3-й день. Желтые стрелки указывают кластеров Ins + и Gluca + клеток. Врезка (D '), более высоким увеличением одного из кластеров клетки эндокринной системы. (E) Всего крепления иммуноокрашивания дня 3 поджелудочной железы эксплантов для Pdx1, β1 интегрином (β1int) и F-актин (факт). Мезенхимальных клеток (звездочки) перемежаются между Pdx1-позитивных эпителиальных клеток. Показаны изображения в C, D и Е являются одним конфокальной оптической разделы Z-серии. Шкала баров, 100 мкм (A, B); 50 мкм (CE).
Рисунок 3. Представитель живых клеток изображениями бывших естественных условиях культурного эксплантов поджелудочной железы. (AD) Кадры из покадровой фильм поджелудочной железы эксплантов из мТл / мг эмбрионов мышей трансгенными. Время визуализации показан на часы: минуты. Эксплантов была отображаемого начиная с 1 день. Z-стек изображенийбыли приобретены с целью 40X иммерсионного масла каждые 12 мин в течение в общей сложности 15 часов. Пунктирные линии чаевые филиалов и границы между эпителием и мезенхимы. Шкала бар, 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
После поджелудочной железы судьба указано, предшественники клеток поджелудочной железы проходят обширные пролиферации, дифференцировки и морфогенеза, в конечном счете сформировать зрелое и функциональный орган 2,4. В настоящее время, как ветвление происходит в поджелудочной железе, и как это связано с распространением предшественников и дифференциация в значительной степени неизвестными. Культур поджелудочной эксплантов представляют собой идеальное система выяснения этих процессов бывших естественных условиях 5,9,11. Объединив живых клеток изображений с экс эксплантов естественных условиях раннего почек поджелудочной железы можно получить четкое представление о событиях, которые происходят во время морфогенеза поджелудочной железы у эмбриона. Это видео статья представляет собой простой подход к созданию бывших естественных культур эмбриональных поджелудочной железы на стеклянной поддержку, что делает их идеальными для всей монтажа иммунофлюоресценции и живые изображения.
Многочисленные примеры использования бывших эксплантов поджелудочной железы естественных условиях для получения изображений сELL морфологии, роста и дифференцировки представлены здесь. Важно, что эти примеры показывают, что эмбриональные поджелудочной железы культурного естественных бывший используя этот протокол имитировать на ранних стадиях в естественных условиях эмбрионального развития поджелудочной железы 2,3. Так, например, ветвящиеся инициирует примерно 24 часов после посева поджелудочной железы E11.5, как и ожидалось в естественных условиях (рис. 2A). В то время морфогенеза и дифференцировки клеток в культуре напоминает, что видел в живом организме, общий рост эксплантов не сопоставимы, и значительно меньше, чем видели в развивающемся эмбрионе. Под культурой условиях, описанных здесь, поджелудочной железы эксплантов перестают расти на 5 день и подвергаются дегенерации после одной недели (данные не показаны). Таким образом, сообщил бывший естественных условиях культивирования системы ограничены и лучше подходит для исследования ранней аспекты поджелудочной железы органогенеза.
Здесь мы приведем примеры бывших й естественных культурмы установили на дикого типа, а также мТл / мг эмбрионов репортер мыши. Использование флуоресцентных штамм репортер необходима для изображений в реальном времени, что позволяет визуализации клеточных и субклеточных структур и исследование их динамики в 3D-среде. Например, локализация мТл флуоресцентного белка с мембранными структурами позволяет точно визуализировать морфологию клеток и трек реконструкции и миграции клеток с течением времени в поджелудочной эксплантов. Одной из наиболее распространенных проблем и ограничений в живых клетках экспериментов визуализации фотостарения, которые могут возникнуть в результате многократного воздействия флуоресценции освещение возбуждения. В общем, надо, чтобы сбалансировать качество изображения с фототоксичности в контексте своих экспериментальных установок. Например, чтобы свести к минимуму фотостарения одна возможность заключается в снижении частоты изображения и увеличить промежуток времени между последовательными кадрами или, наоборот, оптимизировать приобретение Z стекза счет сокращения числа оптических ломтиками.
Наконец, экс естественных условиях культивирования эмбриональных поджелудочной железы является ценным системы для скрининга химических соединений и их влияние на развитие поджелудочной железы. Соединение или факторы могут быть добавлены непосредственно в культуральной среде и развитию эффекты могут быть легко оценить под микроскопом. Использование программного обеспечения для анализа данных, можно даже получить количественные данные о распространении и росте, удлинения, ветвления, тубулогенеза и дифференциации. Кроме того, можно использовать трансгенных или нокаутом тканей к созданию органа культур или осуществлять быстрый прирост и потерей функции экспериментов в эксплантов, например, посредством трансдукции лентивирус или морфолино олигонуклеотиды, соответственно (данные не представлены). Все эти подходы позволят в режиме реального времени исследования мутантных фенотипов и дальнейшее понимание генных регуляторных сетей в развивающихся поджелудочной железы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследования в Spagnoli лаборатории. финансируется за счет Гельмгольца, FP7-IRG-2008-ENDOPANC грантов и ERC-2009-начала HEPATOPANCREATIC Грант.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies: Carboxypeptidase E-cadherin F-actin Glucagon Insulin β1-integrin Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3 |
AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Hybridoma bank Cell Signalling |
1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 |
|
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Kept in sterile conditions |
| Cell culture grade water | PAA | S15-012 | Kept in sterile conditions |
| Culture dishes (glass-bottomed), 35-mm | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Donkey Serum | Chemicon | S30-100 ml | |
| Fetal calf serum Gold | PAA | A15-151 | Kept in sterile conditions |
| Fibronectin | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg/ml in cell culture grade water |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750-037 | Kept in sterile conditions |
| Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Kept in sterile conditions |
| 4-well Multidishes | Nunc | 176740 | |
| Microscopes: Inverted Confocal Microscope (LSM 700) Stereomicroscope (Discovery V12) |
Zeiss Zeiss |
Objectives: C-Apochromat 10X / 0.45 W M27 (work. dist. 1.8 mm; imaging depth ~100 mm); C-Apochromat 40X / 1.2 W Corr M27 (work. dist. 0.28 mm; ~imaging depth 50 μm) Transillumination from below and fiber-optic illumination from above |
|
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.3 | Stock solution 20% |
| Pasteur Pipet (Glass), 150 mm | VWR | HECH567/1 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | Kept in sterile conditions |
| Petri dishes, 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Petri dishes, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH7.4 | PAA | H15-002 | Kept in sterile conditions |
| Spring Scissors 8 mm blade curved | Fine Science Tools | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Watchmaker's foreceps Dumont #5 | Roth | K342.1 |
References
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M. Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development. Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).
- Spagnoli, F. M. From endoderm to pancreas: a multistep journey. Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).
- Hick, A. -C. Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1. BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).
- Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137, 4295-4305 (2010).
- Kesavan, G. Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification. Cell. 139, 791-801 (2009).
- Zhou, Q. A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis. Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).
- Percival, A., Slack, J. Analysis of pancreatic development using a cell lineage label. Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).
- Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).
- Puri, S., Hebrok, M. Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging. Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).
- Magenheim, J. Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth. Development. 138, 4743-4752 (2011).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).
- Horb, L. D., Slack, J. M. Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas. Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
