Summary
مجموع داخلي التأمل الإسفار (TIRF) المجهري هو نهج قوي لمراقبة الهياكل على مقربة من سطح الخلية في التباين العالي وقرار مؤقت. علينا أن نبرهن كيف يمكن توظيف TIRF لدراسة ديناميات البروتين في خلايا قشرة جدار المغلقة الخلية البكتيرية والفطرية.
Abstract
وقد برزت TIRF المجهري باعتبارها تكنولوجيا التصوير قوية لدراسة المكانية والزمانية ديناميكية الجزيئات فلوري في التجارب المختبرية والخلايا الحية 1. هذه الظاهرة البصرية من الانعكاس الداخلي الكامل يحدث عندما يمر الضوء من وسط معامل الانكسار مع ارتفاع في متوسط معامل الانكسار مع انخفاض في زاوية أكبر من زاوية حرجة مميزة (أي أقرب إلى كونه بالتوازي مع الحدود). على الرغم من أن ينعكس كل الضوء مرة أخرى في ظل هذه الظروف، يتم إنشاء موجة زائل التي تنتشر عبر وعلى طول الحدود، والذى يضمحل بشكل كبير، مع المسافة، وتخترق المناطق فقط عينة التي هي 100-200 نانومتر بالقرب من واجهة 2. بالإضافة إلى تقديم قرار محوري متفوقة، وإثارة انخفاض من أصل fluorophores التركيز يخلق إشارة إلى نسب عالية جدا من الضوضاء ويقلل من الآثار الضارة للphotobleaching 2،3. كونها تقنية widefield، TIRF يسمح أيضا أسرع AC صورةquisition من مسح معظم الاجهزة مبائر القائم.
للوهلة الأولى، عمق الاختراق المنخفض للTIRF يبدو لتكون متوافقة مع التصوير من الخلايا البكتيرية والفطرية، والتي غالبا محاطة بجدران سميكة الخلية. على العكس من ذلك، وجدنا أن جدران الخلايا من خميرة وخلايا بكتيرية فعلا على تحسين قابليتها للاستخدام من TIRF وزيادة مجموعة من الهياكل ملاحظتها 4-8. وبالتالي، يمكن العديد من العمليات الخلوية يمكن الوصول إليها مباشرة بواسطة الكائنات الحية الدقيقة TIRF في صغير وحيد الخلية، والتي غالبا ما تقدم قوي تقنيات التلاعب الجيني. وهذا يسمح لنا لأداء التجارب في الكيمياء الحيوية الحية، حيث يمكن حركية التفاعلات البروتينية والأنشطة المقررة مباشرة في الخلايا الحية.
نحن هنا وصف الخطوات الفردية المطلوبة للحصول على صور عالية الجودة للTIRF خميرة الخباز أو عصيات الخلايا الرقيقة. نشير إلى مختلف المشاكل التي يمكن أن affeط م TIRF تصور تحقيقات فلوري في الخلايا وتوضيح إجراءات تطبيق مع أمثلة عدة. أخيرا، علينا أن نبرهن كيف يمكن الصور TIRF تحسينها باستخدام تقنيات استعادة صورة ثابتة.
Protocol
1. عينة تحضير
- إعداد قسائم الغطاء
يجب تنظيف Coverslips من جزيئات الغبار وTIRF حساسة للإشارات خلفية الناشئة عن ساترة (الشكل 1A، فيلم 1).- باستخدام ملقط زلات غطاء مكان في حامل السيراميك مع غطاء.
- ملء إناء زجاجي مع هيدروكسيد الصوديوم M 1 (يمكن إعادة استخدامها عدة مرات).
- احتضان لمدة 2 ساعة تحت تناوب متواصل بطيء (المداري شاكر). وحضانة المفرط (> 8 ح) خلق زلات غطاء شفاف.
- غسل مرتين مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق تحت تناوب متواصل بطيء.
- يغطي متجر في حامل الخزف في الإيثانول بنسبة 100٪.
- إعداد الخلايا العصوية الرقيقة
- تمييع لOD 600 من 0،01-0،05 في 5 مل من وسائط النمو المناسب وتنمو إلى مرحلة الأسي (OD 600 من 0،3-0،7).
- إعداد 1.25٪ الاغاروز في الماء أو المتوسطة. استخدام وسائل الإعلام الاصطناعية للحد من مضان الخلفية. حل مسحوق في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل على 95 درجة مئوية وتخزينها في كتلة التدفئة عند 72 درجة مئوية.
- إضافة قطرة صغيرة من الاغاروز إلى وسط شريحة والصحافة في لوحة مسطحة مع شريحة الثانية. شرائح منفصلة بعناية بعد ما لا يقل عن 2 دقيقة أو قبل الاستخدام.
- تدور بانخفاض 500 ميكروليتر في خلايا صغيرة للطرد المركزي في 12،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
- تجاهل طاف، وresuspend بيليه في 50 ميكرولتر المتوسطة.
- إضافة 2-4 خلايا ميكروليتر من وسط لوحة الاغاروز.
- أخذ زلة غطاء تنظيفها من الحاوية الايثانول مليئة ملقط، جفاف مع الهواء المضغوط وضعه بعناية في عينة.
- اسمحوا الخلايا تسوية ما لا يقل عن 2 دقيقة قبل الفحص المجهري.
- ختم حواف ساترة مع VALAP (الفازلين، اللانولين وParafin، مختلطة في وزن تحت حرارة متساوية، تطبق مع فرشاة صغيرة أو بصق العلا) للتصوير على المدى الطويل.
- إعداد خلايا خميرة الخباز
- تمييع ما قبل الثقافة، وتنمو في وسائل الإعلام المناسبة لما لا يقل عن 5 ساعات إلى مرحلة الأسي (OD 600 0،2-0،8).
- اتخاذ ساترة من الحاوية مع ملقط والجافة مع الهواء المضغوط.
- نشر 5 كونكانافالين ميكرولتر حل (كونا، 2 ميكروغرام / مل في الماء المقطر) على زلة غطاء مع ماصة والجافة مع الهواء المضغوط. كونا بربط الكربوهيدرات من خميرة جدار الخلية ويشل خلايا الخميرة.
- نقل 4،5 خلية الخميرة ميكرولتر التعليق على جانب واحد من ساترة كونا المغلفة. بعناية وضع زلة غطاء على الشريحة المجهر. تبدأ مع حافة واحدة، والسماح إسقاط ببطء لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
- اسمحوا الخلايا تسوية ما لا يقل عن 2 دقيقة قبل الفحص المجهري.
- حواف ختم ساترة مع VALAP (انظر أعلاه) للتصوير على المدى الطويل.
الطبقة = "jove_title"> 2. صورة اكتساب
- مجهر الإعداد
أجرينا جميع التجارب على الإعداد TIRF مخصصة على أساس موقف IMIC مؤتمتة بالكامل (حتى الضوئيات) مع هدف 100X أوليمبوس NA 1.45. تم استخدام أشعة الليزر DPSS 75 ميغاواط في 488 نيوتن متر (ياقوت متماسك) و 561 نيوتن متر (Cobolt رقص الجاز) ومصادر الضوء. وقد تم اختيار ليزر من خلال AOTF وتوجيهها من خلال الألياف واسع النطاق لIMIC. تم استخدام الجلفانومتر يحركها رئيس الماسح الضوئي ثنائي محور لضبط الزوايا أو حدوث انتعاش بعد الإسفار Photobleaching (FRAP) موقف. تم استخدام الجلفانومتر إضافية للتبديل بين epifluorescence، FRAP وTIRF. وقد تم جمع الصور مع كاميرا Andor DU-897 iXON EMCCD وعدسة تكبير 2X أمام الكاميرا. وتمت السيطرة اكتساب اقتناء لايف (حتى الضوئيات) مجموعة من البرامج.
وينبغي النظر في النقاط التالية:- برمجة السيطرة على مصدر إضاءة (ليزر لالمعهد الوطني للإحصاء)، وزاوية TIRF أمر ضروري من أجل تحقيق النتائج استنساخه، وخاصة بالنسبة للمتعددة الألوان TIRF، حيث زوايا سقوط تحتاج إلى تعديل لإثارة كل طول موجة لضمان المساواة في اختراق موجات زائل. ويمكن لنا في الإعداد TIRF زاوية أن تعدل على الفور عن طريق اثنين من غلفانومترات، التي تخضع لسيطرة مباشرة من صفقة شراء البرمجيات لايف.
- إعداد مخصصة لدينا بالإضافة إلى ذلك يتيح التبديل السريع بين epifluorescence، TIRF وFRAP عبر الجلفانومتر 3، مما يسمح للقياس بسيط من حركية الترجمة لكائنات تتبع في TIRF.
- الهدف من نوع TIRF يتطلب فتحات العددية عالية من NA> 1.4. استخدمنا 100X أوليمبوس NA 1،45 هدف.
- EMMCD الكاميرات تعمل بشكل جيد جدا مع TIRF بسبب إشارة بهم إلى ارتفاع نسبة الضوضاء. للسماح للتصوير مع حساسية الأمثل كنا بكسل 512x512 مضيئة الكاميرا الخلفية EMCCD مع حجم بكسل من 16 ميكرون. للحفاظ على الحد الأقصى لقرار وضعها لدينا magn 2Xعدسة ification أمام الكاميرا.
- كما TIRF هو أسلوب widefield، كثافة من أشعة الليزر وانتشرت. ليزر قوي لذلك في أغلب الأحيان تحسين التصوير. كنا 75 ميغاواط الصمام الثنائي ضخ الصلبة (DPSS) الليزر في 488 نانومتر و 561.
- للحفاظ على الخلايا تحت الظروف المثلى للنمو خلال التصوير، واستخدام الضوابط البيئية الملائمة. كنا مخصصة غرفة التدفئة جعلت (الشكل 1B) لدراسة درجة الحرارة المسوخ خميرة الحساسة. لتبادل المتوسطة خلال اكتساب كنا إما غرف تدفق بسيط أو أطباق ثقافة زجاج القاع التي يمكن الوصول إليها بسهولة من فوق على مجهر مقلوب.
- تعديل معايير
- تحديد موقف من الخلايا باستخدام مشرق إضاءة المجال. أحمر المصابيح هي جيدة ولا سيما لأنها لا تحفز كبيرة تلف الصورة.
- التحول إلى إضاءة ليزر ليزر وحدد المناسبة والتركيبات مرشح لإثارة fluorophores منالاختيار. تأكد من أن زاوية TIRF هو دون الحرجة، أو أنك لن تكون قادرة على الكشف عن أي إشارة الناجمة عن بروتينات اندماج GFP. إذا كنت في شك ضبط TIRF زاوية إلى 0 درجة للحصول على شعاع الليزر عمودي. العثور على القسم العلوي من الخلية (جانب من الخلية التي تواجه ساترة). تغيير زاوية حادث من شعاع الليزر الإشارات حتى تختفي ثم زيادة زاوية ببطء حتى النقطة التي مضان في يظهر سطح الخلية (فيلم 2). ضبط Z-تركيز مرة أخرى على الموقف الأمثل على السطح. مقبول زوايا TIRF لا تخلق هالة ضبابية على حافة الخلية (الشكل 1C). إذا الصورة كبيرة التبييض يحدث أثناء الإعداد، حفظ زاوية TIRF والانتقال إلى مرحلة وضع غير مقصور قبل البدء في اكتساب.
- ضبط شدة الليزر والكاميرا لتعظيم مكاسب النطاق الديناميكي (إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء دون بكسل تشبع). وعادة ما تكون الكاميرات EMCCD الأمثل للكشف عن إشارات منخفضة للغاية في إشارة إلى ارتفاع الفئران الضوضاءدائرة الرقابة الداخلية. لأقوى الإشارات العادية كاميرات CCD تنتج أقل من الضجيج وتقديم مجموعة واسعة ديناميكية.
- TIRF المجهر حساس جدا لارتفاع الفروق الصغيرة في ساترة، مما أدى إلى خلايا قليلة فقط، والتي يمكن تصويرها في نفس الوقت (الشكل 1D). ويمكن لخلايا صغيرة في كثير من الأحيان ولذلك فإن اكتساب المنطقة (منطقة ذات أهمية، ROI) أن تخفض إلى المنطقة دون الإقليمية التي تحتوي على الكائن في الاختيار. هذا أيضا يقلل من الوقت اللازم لنقل البيانات من الرقاقة على القرص الصلب، في كثير من الأحيان الحد من معدل خطوة في إطار معدلات عالية.
- للون مزدوج التجارب TIRF تأكد للحد من النزف من خلال من fluorophores. لRFP / GFP أزواج استخدام مرشحات انبعاث منفصلة كما طلب تقديم العروض هو متحمس ضعيف بواسطة ضوء نانومتر 488 (الشكل 2A). لم يتم معظم المرشحات متوافقة تماما مع بعضها البعض. يمكن تصحيح تصفية يقابلها باستخدام الخرز فلوري ممزوجة مع الخلايا. لتحقيق مماثل عمق الاختراق، وضبط زوايا TIRF على حدة FOR كل خط ليزر. ويوضح سير العمل في شكل نموذجي. 2B.
- معلمة الحرجة التي تؤثر على جودة الصورة هو محاذاة الليزر وهدف نظيف. لمحاذاة الليزر، والتركيز أولا على Z-موقف المستخدمة في التصوير TIRF. ثم إزالة عينة وتنظيف والهدف من كل النفط (النفط المتبقي سوف يؤدي إلى الانحراف من ضوء الليزر والرقطة في ملف شعاع). المشروع ليزر على السقف في وضع TIRF ومعايرة 0 درجة مثل هذا الموقف أن الليزر هو في خط مستقيم مع الهدف (استخدام بقعة إشارة، دائما ارتداء نظارات وقاية ليزر وتجنب كل الأفكار في مسار شعاع). تركز بقعة الليزر إلى حجم الحد الأدنى. الإعداد التي قمنا بها توفر عدسة المنقولة وضعه بين galvos ومجهر لتسهيل معايرة السريع. بعد التعديل الأمثل، يجب أن الملف الليزر تشكيل تعريف جيد بقعة مع شكل دائري تقريبا. إجراء معايرة قبل كل دورة للحصول على أفضل جودة الصورة.
3. ممثل النتائج
- توزيع المتماثلات الأكتين والانزيمات جدار الخلية في العصوية الرقيقة. تصوير نحن الخلايا معربا عن اندماج GFP من MBL نديد الأكتين أو PbpH ناقلة الببتيد بواسطة TIRF وepifluorescence العادية. ينخفض بشكل واضح على عمق تغلغل في TIRF وتقتصر على سطح تواجه ساترة (الشكل 3A، B). وأعرب عن ناقلة الببتيد PbpH ضعيف يموضع إلى بقع قشرية تظهر بالكاد من قبل epifluorescence لكن يمكن تمييزها بوضوح من خلال TIRF (الشكل 3B). ويمكن اختراق أفضل لوحظ انخفاض في إشارة PbpHGFP على الحاجز، والتي تظهر على شكل خطوط في epifluorescence لكن كنقاط في TIRF (الشكل 3B، السهم).
- وترد بالفعل المجالات البروتين في خميرة غشاء البلازما. أمثلة لشبكة تشبه الأنماط التي شكلتها بروتينات غشاء البلازما في الخميرة في الشكل. و1C2. بالإضافة إلى تباين في تحسين TIRF الذي يسمح تمييز واضح من هذه الأنماط التي تشبه شبكة، ويمكن في بعض الأحيان إشارات ضعيفة يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري TIRF حصرا. كما سبيل المثال، نحن تصوير التحام GFP من Bit61 TORC2 مجمع مكون من خميرة الخباز. يتم التعبير عن هذا البروتين ضعيف وتشكل البقع القشرية الصغيرة مع نسخ بروتين قليل فقط في التصحيح 9. في epifluorescence بقع قليلة فقط مرئية فوق خلفية قوية، في حين يمكن تصوير البقع مع إشارة جيدة للغاية لنسبة الضوضاء في TIRF (الشكل 3C). لذلك يتم بشكل جيد يناسب TIRF لدراسة الهياكل فلوري ضعيفة والبروتينات على سطح الخلية. القرار المحوري ارتفاع تقدمها TIRF يقلل بالفعل مضان الخلفية. ويمكن الحصول على مزيد من تحسن تباين الصورة من خلال مختلف الخطوات لمعالجة الصور. وهناك تقنية بسيطة هو معيار تكافؤ خلفية المحلية حيث يتم طرح صورة واضحة منالأصلي. لا يمكن أن يؤديها ضوح مع مجموعة متنوعة من المرشحات الترددات المنخفضة بما في ذلك المرشحات وسيطة أو التمويه (الشكل 3D). محلي خلفية الطرح يزيل الضوضاء ويشحذ هياكل الكثافة العالية. ومع ذلك، غالبا ما يأتي هذا على حساب فقدان الهياكل الدقيقة وتضخيم مبالغ فيه من مناطق الكثافة العالية (الشكل 3D، والسهم). إجراء المتفوق هو deconvolution 2D، التي يمكن القيام بها مع حزم البرمجيات الحرة أو المتاحة تجاريا مثل يماغيج، مطلب أو هيغنز (العلم حجم التصوير BV). صور TIRF تقديم قرار محوري جيد جدا، وبالتالي انتشار نقطة تقريبا ثنائي الأبعاد وظيفة (PSF). نحن مصممون تجريبيا هذا قوات الأمن الفلسطينية من خلال الحصول على الصور من 40 نانومتر الخرز فلوري مع نفس الإعدادات التي تم استخدامها لتصوير الفعلية (الهدف، كاميرا، الإثارة وانبعاث طول الموجة) واستخدمت بعد ذلك قوات الأمن الفلسطينية تجريبية لdeconvolution مع خوارزمية أقصى احتمال الكلاسيكية في هيغنز. مرةيسقط من أفلام GFPRas2 أو من Fet3GFP وPma1RFP (أفلام 3 و 4) شرح زيادة التباين بعد deconvolution. في الصور الملونة مزدوج هو أمر بالغ الأهمية لتحقيق أقصى قدر من النقيض من ذلك، لتكون قادرة على تحديد القيم colocalization (فيلم 4).
- تحليل دوران البروتين في قشرة الخلية. TIRF وFRAP توفر مزيجا قويا لدراسة ديناميات بروتينات القشرية. ومع ذلك، للسماح للكفاءة استخدام هذه التقنيات، ويلزم مراقبة السريع لزوايا الليزر والمواقف. في TIRF، وهي تقنية حقل واسع، ليزر يحتاج إلى أن يركز على متن الطائرة التنسيق مرة أخرى ويحتاج إلى اتباع زاوية حدوث الضحلة لتحقيق انعكاس المطلوب. في المقابل، FRAP يتطلب الليزر إلى أن تركز بشكل مباشر على عينة وضعه مع دقة مكانية عالية للسماح للتبيض من هياكل محددة أو المناطق. الإعداد من الضوئيات حتى كنا في التجارب التي قمنا بها توفر سيطرة سريعة جدا وسهولة واكثر من عشرالمعلمات ESE. وتستخدم اثنين من الجلفانومتر التي تسيطر عليها المرايا لضبط الموقف FRAP في X، Y أو لتعيين زاوية السقوط في TIRF. ويستخدم مرآة 3 للتبديل بين مسارات منفصلة لشعاع TIRF وFRAP إضاءة (تم توسيع الليزر بواسطة عدسات إضافية في مسار TIRF). يتم التحكم في جميع الإعدادات عن طريق برنامج (اكتساب حي) لوس انجليس والمعايرة لا يمكن أن يؤديها بسرعة على كل تجربة لتحقيق أفضل الظروف. هذا البرنامج يتيح أيضا تعريف من المناصب التبييض خلال الحصول على الصور، وهو أمر ضروري للتجارب FRAP على هياكل متحركة.
باستخدام هذه الميزة يمكن أن نستبعد treadmilling من شعيرات MBL كمصدر للالحركة الملحوظة من MBL التي تحتوي على بقع (الشكل 3E). هذه الملاحظة بدافع بحثنا عن آليات الحركة البديلة، وأدى في نهاية المطاف في تحديد موقعنا من نوع غير متوقع تماما من الحركة، حيث يتم نقل مجمعات البروتين داخل الخلايا (بما في ذلك MBL) من خلال األنشطةتي واي لجدار الخلية توليف الانزيمات الموجودة على السطح الخارجي للخلية 4. على نحو مماثل، كنا قادرين على مراقبة إعادة ترتيب البطيء للبروتينات خميرة غشاء البلازما، التي توزع في شبكة مثل المجالات التي تغطي كامل سطح الخلية (الشكل 3F).
هذه الأمثلة توضح كيف يمكن لديناميات والزخرفة من البروتينات القشرية المقررة مباشرة عن طريق الجمع بين TIRF وتقنيات FRAP.
4. ممثل النتائج
الشكل 1. تعديل معايير. A. القذرة مقابل تنظيفها المشتركverslip. إشارة خلفية الناجمة عن الغبار على ساترة تتداخل مع إشارة GFP / RFP المحتملة، ساترة لديه أقل تنظيف الخلفية. باء صنعت خصيصا الكهربائية للتدفئة وحدة تحكم في درجة الحرارة تظهر مجموعة (أ)، ودرجة الحرارة في تحقيق (ب) و عينة حامل (ج) . جيم Pma1GFP بروتين الخميرة تصوير مع زوايا حدوث انخفاض (من أعلى اليسار إلى اليمين أسفل). تظهر الصور لفقدان مفاجئ للإشارة في الزاوية الحرجة والانخفاض التدريجي في المعلومات الهيكلية وإشارة إلى نسبة الضوضاء. D. حقل غير المتكافئ للرأي. تم تصوير وتعليق كثيفة من الخرز فلوري، وتبين أن جزءا فقط من مجال الرؤية هو في التركيز. مقياس القضبان في A، B: 2 ميكرون، في C: 10 ميكرومتر.
الشكل 2. مزدوج اللون التصوير. A. ينزف من خلال Pil1RFP. هو متحمس Pil1RFPمع 488 نانومتر، والليزر نانومتر 561 ومضان يتم تسجيلها مع فلتر الفرقة تمريرة مزدوجة. إشارة من Pil1RFP مرئيا ضعيف في القناة GFP. مقياس شريط 2 ميكرومتر خطوات باء نموذجي لتجنب تنزف من خلال التصوير في لون مزدوجة. بعد التصوير الخلايا مع مجموعات مرشح مستقل، وأنها deconvolved والانحياز (باستخدام الخرز فلوري) قبل أن يتم دمج لتحليلها.
الشكل 3. ممثل النتائج. أ. مقارنة لتوزيع GFPMbl في B. الرقيقة باستخدام TIRF أو العادية epifluorescence المجهري (EPI). الزرقاء: حدود خلية من حقل صورة مشرقة. صور تمثل متوسط التوقعات من سلسلة زمنية للإشارة إلى المنطقة التي تغطيها بقع MreB مراقبة متحركة مع أوضاع تصوير مختلفة. تحسين B. قرار محوري وعلى النقيض من صورة TIRFالصورة التي التقطت لPbpHGFP ناقلة الببتيد في B. الرقيقة. سهام تشير إلى تلطيخ الحاجز الذي يظهر كما في حلقة epifluorescence وكما في بقع TIRF. وقت التعرض: 100 مللي مقارنة بين جيم وepifluorescence TIRF الاضاءه من Bit61 مكون مجمع تور في خميرة S. وضعيف جدا وأعرب Bit61 9. وقت التعرض: 250 السيدة د. مقارنة بين مختلف طرق معالجة الصور. سلسلة تبين الخام صورة TIRF من Pma1GFP والطرح من التمويه أو عدم وضوح الصور متوسط، وكذلك deconvolution باستخدام خوارزمية احتمال الحد الأقصى في هيغنز. E. TIRF-FRAP من رقعة GFPMbl واحدة (فوق النجمة) تتحرك عبر B. الرقيقة الخلية. وkymograph من التصحيح غير يتعافى والملف شدة على طول kymograph (الخط المتقطع) تستبعد treadmilling كمصدر للحركة. F. TIRF-FRAP خلية الخميرة معربا عن Pma1GFP. لاحظ إغلاق ناشر للالفجوة في نمط تلطيخ القشرية. الحانات النطاق: 2 ميكرون. الوقت بالثواني.
فيلم 1. الفيلم يظهر B. الرقيقة الخلايا التعبير عن بروتين الانصهار طلب تقديم العروض على ساترة القذرة. نلاحظ أن طلب تقديم العروض إشارة بالكاد يمكن تمييزها من الضوضاء في الخلفية. دورة الزمن 100 مللي. انقر هنا لعرض الفيلم .
فيلم 2. الفيلم من Pma1GFP مع زوايا سقوط مختلفة. يتم تبديل زاوية من دون الحرجة إلى زاوية حرجة، حتى يتم فقدان إشارة. علما، في إشارة دون الحرجة الداخلية زاوية مرئيا، مما تسبب في الصور صاخبة حتى في الزاوية الحرجة فقط من البروتين في PM مرئيا. دورة الزمن 200 مللي ثانية. شريط الحجم: 2 ميكرون. انقر هنا لعرض الفيلم .
فيلم 3. الفيلم من خميرة GFPRas2، والتي تبين alternatصور جي TIRF الخام وdeconvolved. GFPRas2 هو بروتين سريع الحركة (T1 / 2 من البيانات 2S غير منشورة)، وأوقات اكتساب سريع تعتبر هامة لتحليل السلوك الديناميكي. دورة الزمن 150 مللي. شريط الحجم: 2 ميكرون. انقر هنا لعرض الفيلم .
فيلم 4. مزدوج فيلم لون من الخميرة والبروتينات Fet3GFP Pma1RFP. أول 10 لقطة تمثل صور خام وdeconvolved إطارات الماضي. هذا الفيلم يؤكد على أهمية معالجة الصور لتحليل colocalization. الصور الباهتة RAW أصبح المشدد، وإجراء تحليل ممكن. دورة الزمن 5 ثوان. شريط الحجم: 2 ميكرون. انقر هنا لعرض الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIRF المجهري هو الأسلوب المفضل للبروتينات صورة هامشية. عمق الاختراق المنخفض للمجال زائل يقلل من الخروج من ضوء التركيز، الأمر الذي يؤدي إلى إشارة جيدة للغاية لنسبة الضوضاء، ويتيح الحصول على البيانات مع ارتفاع معدلات الإطار، أو التصوير من البروتينات ضعيف جدا التي أعرب عنها. مزيج من التباين العالي وارتفاع معدلات الإطار يجعل TIRF المجهري أداة مثالية لديناميات المكانية والزمانية والتصوير من البروتينات المترجمة cortically. ومن المثير للاهتمام أن جدار الخلية سميك المحيطة بها العديد من الكائنات الحية الدقيقة لا تعيق التصوير من البروتينات الطرفية التي TIRF. في الواقع، فإن الجيل الفعلي للزائل من المرجح جدا يحدث في واجهة بين جدار الخلية و5،10 غشاء البلازما. انعكاس الضوء الذي يخرج من خلية قد تؤدي إلى انتشار الضوء على طول جدار الخلية، والذي قد يفسر على مساحة كبيرة يمكن تصويرها في خلايا الخميرة 8.
للحصول على جودة أفضل من الدردشة TIRFالذين تتراوح أعمارهم من الأهمية بمكان أن يكون هناك نظام الفحص المجهري محسوبة بدقة. ينبغي أن تركز الليزر والانحياز قبل كل دورة التصوير. يجب تنظيف Coverslips (الشكل 1A) والخلايا يجب أن يجمد بشكل صحيح. لمضاعفة تنزف التصوير الطيفي اللون من خلال يجب أن يؤخذ في الاعتبار أو القضاء عليها عن طريق استخدام فلتر مجموعات منفصلة مرشحات نطاق الانبعاثات. وهذا يأتي من الواضح بسعر مرات أبطأ اكتساب نتيجة لتغير فلتر ميكانيكي. يمكن للعجلات مرشح سريع أو مصادر الجلفانومتر إضاءة مدفوعة الالتفاف على هذا التأخير إذا لزم الأمر. بدلا من ذلك، يمكن استخدام fluorophore الحرجة (RFP) على أضعف بروتين أعرب في زوج، والتقليل من مستوى تدخل إشارة.
بالرغم من التباين العالي، والصور التي اتخذت مع المجهر TIRF تحتوي على ضجيج كبير. لإزالة هذا الضجيج ويمكن معالجة المزيد من الصور زيادة على النقيض صورة مع مختلف خطوات الترشيح. الأسلوب مع أفضل النتائج في موقعناالتجربة هي deconvolution 2D. وهذا يتطلب قياس التجريبي لقوات الأمن الفلسطينية في كل عينة وحالة المجهر. ومع ذلك، يمكن أن يتم تنفيذ هذا الى حد ما بسهولة وسرعة باستخدام الخرز فلوري مختلطة في عينة منها. ويمكن لاثنين من الألوان وبالإضافة إلى هذه التجارب الخرز تستخدم لمحاذاة قناة.
وقد برهنا على مميزات استخدام المجهر TIRF للتصوير من البروتينات القشرية في الكائنات الحية الدقيقة. مزيج من TIRF ومعالجة الصور يتيح الحصول على صور مع الإطار معدلات عالية (<50 مللي ثانية) وعلى النقيض، ويمكن أيضا تصور من البروتينات وأعرب ضعيف مثل Bit61. ميزة إضافية لأداء TIRF التصوير على الكائنات الحية الدقيقة هي أن الضغط تورم في هذه الخلايا يؤدي إلى الأغشية البلازما المسطحة، ويقلل الآثار طوبولوجي إلى إشارات TIRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
