Summary
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is een krachtige aanpak van de structuren te observeren in de buurt van het celoppervlak bij hoge contrast en temporele resolutie. We laten zien hoe TIRF kan worden gebruikt om eiwitten dynamiek te studeren aan de cortex van de celwand-ingesloten bacteriën en schimmels cellen.
Abstract
TIRF microscopie heeft zich ontpopt als een krachtig imaging technologie om spatio-temporele dynamiek van fluorescerende moleculen in vitro te bestuderen en in levende cellen 1. De optische verschijnsel van totale interne reflectie optreedt wanneer licht van een medium met hoge brekingsindex in een medium met lage brekingsindex een hoek groter dan een kenmerk grenshoek (bijvoorbeeld dichter bij parallel zijn met de grens). Hoewel al het licht wordt gereflecteerd terug onder zulke omstandigheden, is een vergankelijk golf gecreëerd die zich voortplant over en langs de grens, die exponentieel vervalt met de afstand, en alleen doordringt monster gebieden die 100-200 nm de buurt van de interface 2. Naast het leveren van een superieure axiale resolutie, de verminderde excitatie van onscherpe fluoroforen zorgt voor een zeer hoge signaal-ruis-ratio's en minimaliseert schadelijke effecten van fotobleken 2,3. Omdat het een groothoek techniek, TIRF maakt het ook mogelijk een snellere beeldverwerking acquisition dan de meeste op basis van het scannen van confocale setups.
Op het eerste gezicht, de lage indringdiepte van TIRF niet compatibel is met beeldvorming van bacteriële en fungale cellen, die vaak zijn omgeven door een dikke celwanden. Integendeel, hebben we ontdekt dat de celwanden van gist en bacteriële cellen eigenlijk de bruikbaarheid van TIRF verbeteren en vergroten het bereik van waarneembare structuren 4-8. Veel cellulaire processen kan dus direct worden benaderd door TIRF in kleine, eencellige micro-organismen, die vaak bieden krachtige genetische manipulatie technieken. Dit stelt ons in staat om te presteren in vivo experimenten biochemie, waar kinetiek van eiwit interacties en activiteiten die direct kan worden beoordeeld in levende cellen.
We beschrijven hier de individuele stappen die nodig zijn om hoge kwaliteit TIRF beelden te verkrijgen voor Saccharomyces cerevisiae of Bacillus subtilis cellen. Wij wijzen erop verschillende problemen die kunnen Affect TIRF visualisatie van fluorescerende probes in cellen en illustreren de procedure met een aantal toepassingsvoorbeelden. Tot slot laten we zien hoe TIRF beelden kunnen verder worden verbeterd met behulp van gevestigde beeld restauratietechnieken.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Voorbereiden dekglaasjes
Dekglaasjes moeten worden gereinigd van stofdeeltjes als TIRF is gevoelig voor achtergrondgeluiden signalen die voortvloeien uit het dekglaasje (Fig. 1A, Film 1).- Met behulp van een tang plaats dekglaasjes in een keramische houder met deksel.
- Vul glazen fles met 1 M NaOH (hergebruikt kan worden meerdere keren).
- Incubeer gedurende 2 uur onder langzame, continue rotatie (schudapparaat). Overmatige incubatie (> 8 uur) zal leiden tot ondoorzichtige dekglaasjes.
- Was tweemaal met gedestilleerd water gedurende 5 minuten onder langzame, continue rotatie.
- Bewaren in keramische houder bedekt met 100% ethanol.
- Voorbereiden van Bacillus subtilis cellen
- Verdun een OD 600 van 0,01 - 0,05 in 5 ml van geschikte kweekmedia en groeien exponentiële fase (OD 600 0.3 tot 0.7).
- Bereid 1,25% agarose in water of medium. Gebruik synthetische media op de achtergrond fluorescentie te verminderen. Los poeder in 1,5 ml kunststofbuis bij 95 ° C en opslaan in verwarmingsblok bij 72 ° C.
- Voeg een kleine druppel agarose het midden van een dia en druk tot een vlakke plaat met een tweede slede. Zorgvuldig afzonderlijke dia's na ten minste 2 min of voor gebruik.
- Spin down 500 pi cellen in micro-centrifuge bij 12.000 rpm gedurende 1 minuut.
- Gooi supernatant, en resuspendeer pellet in 50 ul medium.
- Voeg 2-4 pi cellen in het midden van de agarose pad.
- Neem gereinigd dekglas van ethanol gevulde houder met een pincet, droog perslucht en leg op monster.
- Laat cellen regelen ten minste 2 min voor microscopie.
- Sluit de randen van dekglaasje met VALAP (vaseline, lanoline en petroleum, gemengd bij gelijk gewicht onder hitte van toepassing, met kleine borstel of spuugdeula) voor lange termijn beeldvorming.
- Voorbereiden van Saccharomyces cerevisiae cellen
- Verdun voorkweek en groeien in geschikte media tenminste 5 uur op exponentiële fase (OD 600 0.2-0.8).
- Neem een dekglaasje van de container met een pincet en droog met perslucht.
- Spread 5 pi Concanavaline A oplossing (ConA, 2 ng / ml in gedestilleerd water) in dekglas met een pipet en droge perslucht. ConA bindt aan koolhydraten van de gist celwand en immobiliseert gistcellen.
- Breng 4,5 pi gistcel suspensie aan een zijde van de ConA beklede dekglaasje. Leg dekglas op microscoopglaasje. Begin met een rand en laat zakken langzaam naar de vorming van luchtbellen te voorkomen.
- Laat cellen regelen ten minste 2 min voor microscopie.
- Seal randen van dekglaasje met VALAP (zie boven) voor de lange termijn beeldvorming.
- Microscoop setup
We hebben alle experimenten uitgevoerd op een aangepaste TIRF setup op basis van een volledig geautomatiseerde iMic stand (Till Photonics) met een Olympus 100x 1,45 NA doelstelling. 75 mW DPSS lasers bij 488 nm (Coherent Sapphire) en 561 nm (Cobolt Jive) werden gebruikt als lichtbronnen. Lasers zijn geselecteerd door middel van een AOTF en geregisseerd door middel van een breedband fiber to the iMic. Een galvanometer aangedreven twee-assige scanner hoofd werd gebruikt om een invalshoek of Fluorescence Recovery pas na Photobleaching (FRAP) positie. Een extra galvanometer werd gebruikt om te schakelen tussen epifluorescentie, FRAP en TIRF. Beelden werden verzameld met een Andor IXON DU-897 EMCCD camera en 2x vergrotingslens voor de camera. Overname werd gecontroleerd door de Live Acquisition (Till Photonics) software pakket.
De volgende punten moeten worden overwogen:- Programmeerbare controle over de lichtbron (laser line) en TIRF hoek is van essentieel belang voor reproduceerbare resultaten en vooral voor multi-color TIRF, waar een invalshoek moeten worden aangepast voor elke excitatie golflengte op gelijke penetratie van verdwijnende golven te garanderen. In onze setup TIRF hoek kan onmiddellijk worden aangepast via twee galvanometers, die direct worden aangestuurd vanuit de Live acquisitie software pakket.
- Onze op maat gemaakte opstelling laat bovendien een snelle omschakeling tussen epifluorescentie, TIRF en FRAP via een derde galvanometer, waardoor eenvoudige meting van lokalisatie kinetiek voor objecten terug te vinden in TIRF.
- Doelstelling van het type TIRF vereist een hoge numerieke openingen van NA> 1.4. We gebruikten een Olympus 100x NA 1,45 doelstelling.
- EMMCD camera's werken heel goed met TIRF door hun hoge signaal-ruisverhouding. Om beeldvorming mogelijk is met een optimale gevoeligheid hebben we gebruik gemaakt van een 512x512 pixel terug verlicht EMCCD camera met een pixelgrootte van 16 micrometer. Om een maximale resolutie te houden plaatsten we een 2x magnificatie lens voor de camera.
- Als TIRF is een groothoek techniek, intensiteit van de laserstralen wordt gespreid. Sterke lasers dan ook vaak te verbeteren beeldvorming. We gebruikten 75 mW diode gepompte vaste stof (DPSS) lasers bij 488 nm en 561 nm.
- Om cellen te houden onder optimale groeiomstandigheden tijdens beeldvorming, gebruik dan een geschikte milieu-controles. We gebruikten een maat verwarmingskamer (Fig. 1B) gist temperatuurgevoelige mutanten te bestuderen. Voor middelgrote uitwisseling tijdens acquisitie we ofwel gebruikt simpele flow kamers of glazen bodem cultuur gerechten die gemakkelijk kunnen worden van bovenaf toegankelijk via de omgekeerde microscoop.
- Instellen van parameters
- Identificeer positie van cellen met behulp van helderveld verlichting. Rode LED's zijn bijzonder goed als ze niet leiden tot aanzienlijke foto schade.
- Schakel over naar laser verlichting en selecteer de juiste lasers en filter combinaties om de fluoroforen van Excitekeuze. Zorg ervoor dat de TIRF hoek subcritisch is, of je zal niet in staat zijn om elk signaal als gevolg van GFP fusie-eiwitten op te sporen. In geval van twijfel te stellen TIRF hoek ten opzichte van 0 ° tot een loodrechte laserstraal te verkrijgen. Zoek het bovenste deel van de cel (kant van de cel naar de dekglaasje). Verander de invalshoek van de laserstraal tot signalen verdwijnen dan langzaam te verhogen hoek tot aan het punt waar fluorescentie op het celoppervlak verschijnt weer (Film 2). Pas weer z-gericht voor optimale positie aan het oppervlak. Acceptabel TIRF hoeken maken geen wazig aureool aan de rand van de cel (afb. 1C). Indien er zich belangrijke foto's bleken optreedt tijdens de installatie, slaat u de TIRF hoek en verplaatsen naar een ongebleekt podium positie vóór het starten overname.
- Pas laser intensiteiten en camera winst voor dynamisch bereik (hoge signaal-ruisverhouding zonder verzadigen pixels) te maximaliseren. Typisch EMCCD camera's zijn optimaal tot zeer lage signalen te detecteren bij hoge signaal-ruis-ratios. Voor sterkere signalen regelmatige CCD-camera's produceren minder geluid en bieden een groter dynamisch bereik.
- TIRF microscopie is zeer gevoelig voor kleine hoogteverschillen van het dekglaasje, waardoor slechts enkele cellen die kunnen worden afgebeeld tegelijkertijd (Fig. 1D). Voor kleine cellen het verkrijgen gebied (dat van belang, ROI) kan dus verlaagd worden tot een deelgebied met het object keuze. Dit vermindert ook de tijd die nodig is om gegevens van de chip naar de harde schijf, vaak de snelheidsbeperkende stap bij hoge frame rates over te dragen.
- Voor de dubbele kleur TIRF experimenten zorg ervoor dat bloeden minimaliseren door van fluoroforen. Voor RFP / GFP paren gebruik maken van aparte emissie-filters als RFP wordt zwak enthousiast over 488 nm (afb. 2A). De filters niet perfect op elkaar afgestemd. Filter offset kan worden gecorrigeerd met behulp van fluorescerende kralen gemengd met cellen. Om vergelijkbare indringdiepte bereiken afzonderlijk fo passen TIRF hoekenr elke laser lijn. Een typische werkstroom is weergegeven in Fig. 2B.
- Een kritische parameter beïnvloeden van de beeldkwaliteit is met een laser uitlijning en een schoon doel. Om de laser eerste focus op de z-positie voor beeldvorming TIRF brengen. Verwijder vervolgens het monster en het reinigen van de doelstelling van alle olie (resterende olie zal leiden tot diffractie van het laserlicht en spikkels in de balk profiel). Projecteer de laser op het plafond in de TIRF modus en het ijken van de 0 ° zodanig dat de laser in een rechte lijn met de doelstelling (gebruik referentiestip, draag altijd een laser een veiligheidsbril en vermijd alle reflecties in de balk pad). Focus de laser plek om een minimale grootte. De opstelling heeft een beweegbaar lens geplaatst tussen galvos en microscoop snel kalibratie vergemakkelijken. Na een optimale aanpassing, moet de laser profiel vormen een goed plekje te definiëren met ruwweg ronde vorm. Voer kalibratie voor elke sessie naar een optimale beeldkwaliteit te verkrijgen.
3. Representatieve resultaten
- Verdeling van actine homologen en celwand enzymen in Bacillus subtilis. We afgebeeld cellen die GFP-fusies van het actine homoloog Mbl of de transpeptidase PbpH door TIRF en regelmatige epifluorescentie. De indringdiepte in TIRF duidelijk als beperkt tot het oppervlak tegenover het dekglaasje (Fig. 3A, B). De zwak uitgedrukt transpeptidase PbpH lokaliseert aan corticale patches die zijn nauwelijks zichtbaar door epifluorescentie, maar is duidelijk te onderscheiden door TIRF (Fig. 3B). De verminderde penetratie kan het best worden waargenomen PbpHGFP signaal septa, die verschijnen als lijnen epifluorescente maar als puntjes in TIRF (Fig. 3B, pijl).
- Eiwitdomeinen in de gist plasmamembraan. Voorbeelden netwerk-achtige patronen gevormd door plasmamembraaneiwitten in gist reeds in Fig. 1C en2. Naast de verbeterde contrast in TIRF dat duidelijk onderscheid van deze netwerk-achtige patronen mogelijk maakt, kunnen zwakke signalen soms uitsluitend worden gedetecteerd door TIRF microscopie. Als we bijvoorbeeld afgebeeld een GFP fusie van de TORC2 complexe component Bit61 van Saccharomyces cerevisiae. Dit eiwit is zwak uitgedrukt en vormt kleine corticale patches met slechts een paar eiwitten exemplaren per patch 9. In epifluorescentie weinig vlekken zichtbaar boven de sterke achtergrond, terwijl vlekken kunnen worden afgebeeld met zeer goede signaal-ruisverhouding in TIRF (fig. 3C). Daarom TIRF is bijzonder goed geschikt voor zwak fluorescerende structuren en eiwitten te studeren aan het celoppervlak. De axiale resolutie beperkt door TIRF reeds achtergrond fluorescentie. Extra verbetering van het imago contrast kan worden verkregen door middel van verschillende beeldverwerking stappen. Een eenvoudige standaard techniek is de lokale achtergrond egalisatie waar een wazig beeld wordt afgetrokken van deorigineel. Vervaging uitgevoerd met verschillende laagdoorlaatfilters met mediaan Gaussian filters (Fig. 3d). Lokale achtergrond aftrek verwijdert ruis en verscherpt hoge intensiteit structuren. Echter, dit komt vaak voor de prijs van een verlies van fijne structuren en overdreven versterking van de hoge intensiteit regio's (Fig. 3D, pijl). Een superieure procedure is 2D deconvolutie, die kan worden uitgevoerd met gratis of in de handel verkrijgbare softwarepakketten zoals ImageJ, Matlab of Huygens (Wetenschappelijk Volume Imaging bv). TIRF beelden bijzonder goede axiale resolutie en dus bijna tweedimensionale puntspreidingsfunctie (PSF). We experimenteel bepaalde dit PSF door de overname van beelden van de 40 nm fluorescerende kralen met dezelfde instellingen die werden gebruikt voor de daadwerkelijke beeldvorming (doel, camera, excitatie en emissie golflengte) De experimentele PSV werd vervolgens gebruikt voor deconvolutie met een klassieke maximum likelihood-algoritme in Huygens. Tijdvervalt films van GFPRas2 of van Fet3GFP en Pma1RFP (Films 3 en 4) tonen de toename van het contrast na deconvolutie. In de dubbele afbeeldingen in kleur is het essentieel om het contrast te maximaliseren, om te kunnen colokalisatie waarden (Film 4) te kwantificeren.
- Analyse van proteïne omzet in de cel cortex. TIRF en FRAP bieden een krachtige combinatie voor de studie van de dynamiek van corticale eiwitten. Echter, een efficiënt gebruik van deze technieken kan is snelle controle van laser hoeken en posities nodig. In TIRF een breed techniek de laser moet worden besteed aan de achterzijde brandvlak en moet een ondiepe invalshoek volgen de gewenste reflectie bereiken. In tegenstelling, FRAP vereist dat de laser direct gericht zijn op het monster en gepositioneerd met een hoge ruimtelijke nauwkeurigheid te laten bleken van gedefinieerde structuren of regio's. De setup van Till fotonica die we in onze experimenten biedt een zeer snelle en intuïtieve controle over eese parameters. Twee galvanometer gestuurde spiegel worden gebruikt om de FRAP positie x, y passen of de invalshoek in TIRF. Een derde spiegel wordt gebruikt om tussen afzonderlijke bundel paden te schakelen voor TIRF en FRAP verlichting (de laser wordt verbreed met extra lenzen in de TIRF pad). Alle instellingen worden gecontroleerd door de LA (live acquisitie) software en kalibraties snel kunnen worden uitgevoerd voor elke experiment om optimale omstandigheden te bereiken. Met deze software kunnen ook de definitie van bleekwater standpunten tijdens beeldacquisitie, die essentieel is voor FRAP experimenten op beweeglijke structuren.
Met deze functie we sluiten treadmilling van Mbl filamenten als bron voor de waargenomen beweeglijkheid van Mbl bevattende platen (Fig. 3E). Deze observatie gemotiveerd onze zoektocht naar alternatieve motiliteit mechanismen, en heeft uiteindelijk geresulteerd in onze identificatie van een totaal onverwachte vorm van beweeglijkheid, waar intracellulaire eiwit complexen (met inbegrip van MBL) worden verplaatst door middel van de activiteitenty van celwand synthetiseren enzymen die op het buiten de cel 4. Op soortgelijke wijze, konden we de langzame herschikkingen van gist plasmamembraaneiwitten die verdeel netwerk-achtige domeinen die de gehele celoppervlak (figuur 3f) waarnemen.
Deze voorbeelden illustreren hoe de dynamiek en de patronen van corticale eiwitten kunnen direct worden beoordeeld door het combineren van TIRF en FRAP technieken.
4. Representatieve resultaten
Figuur 1. Bepaalde parameters. Een. Dirty vs schoongemaakt coverslip. Achtergrond signaal als gevolg van stof op het dekglaasje interfereren met mogelijke GFP / RFP signaal gereinigd dekglaasje minder achtergrond. B. maat gemaakt elektrische verwarmingsregelaar met de ingestelde temperatuur (a), temperatuur probe (b) monsterhouder (c) . C. Gist eiwit Pma1GFP afgebeeld met afnemend voorkomen hoeken (van linksboven naar rechtsonder). Afbeeldingen tonen een plotseling verlies van signaal op de kritische hoek en progressieve daling van de structurele informatie-en signaal-ruisverhouding. D. Ongelijke gezichtsveld. Een dikke suspensie van fluorescerende korrels wordt afgebeeld, waaruit blijkt dat slechts een deel van het gezichtsveld is gericht. Schaalbalken in A, B: 2 pm, in C: 10 urn.
Figuur 2. Dubbele kleur beeldvorming. A. kleurdoorloop van Pil1RFP. Pil1RFP is enthousiastmet 488 nm en een 561 nm laser en fluorescentie is opgenomen met een dubbele band pass filter. Signaal van Pil1RFP is zwak zichtbaar in het GFP-kanaal. Schaal bar 2 micrometer B. Typische stappen om bloeden te voorkomen door in dubbele kleur beeldvorming. Na de beeldvorming van de cellen met aparte filter sets, worden ze deconvolved en uitgelijnd (met behulp van fluorescerende kralen) alvorens te worden samengevoegd voor analyse.
Figuur 3. Representatieve resultaten. A. Vergelijking van GFPMbl distributie in B. subtilis met TIRF of reguliere epifluorescentie (Epi) microscopie. Blauw: Cell grens van helderveld beeld. Afbeeldingen zijn gemiddelde projecties van een tijdreeks om het gebied onder de beweeglijke MreB vlekken bewaakt met verschillende beeldvormende modi aan te geven. B. Verbeterde axiale resolutie en het contrast van TIRF beelds gehouden met de transpeptidase PbpHGFP in B. subtilis. Pijlen geven septum vlekken die verschijnt als ring in epifluorescentie en als patches in TIRF. Sluitertijd:. 100 ms C. Vergelijking tussen epifluorescentie en TIRF verlichting van de TOR complexe component Bit61 in de S-cerevisiae.. Bit61 zeer zwak tot expressie 9. Sluitertijd: 250 ms D. Vergelijking van de verschillende beelden verwerkingsmethoden.. Series met rauwe TIRF beeld van Pma1GFP, aftrekken van Gauss of de mediaan onscherpe foto's, maar ook deconvolutie het gebruik van de maximum likelihood-algoritme in Huygens. E. TIRF-FRAP van een enkele GFPMbl patch (boven sterretje) bewegen over een B. subtilis cel. De kymograaf van de niet-herstellende patch en de intensiteit profiel langs de kymograaf (stippellijn) uitsluiten treadmilling als bron van de beweging. F. TIRF-FRAP van een gistcel uiten Pma1GFP. Let op de diffusieve sluiten van degat in de corticale kleuringspatroon. Schaal bars: 2 micrometer. Tijd in seconden.
Movie 1. Film toont B. subtilis cellen die een RFP fusie-eiwit op een vuile dekglaasje aan. Merk op dat RFP signaal is nauwelijks te onderscheiden van achtergrondruis. Cyclustijd 100 ms. Klik hier om de film te bekijken .
Movie 2. Filmpje van Pma1GFP met verschillende invalshoeken. Hoek is veranderd van subkritische om kritische hoek, totdat het signaal verloren gaat. Merk op subkritische hoek interne signaal zichtbaar, waardoor vage beelden totdat grenshoek alleen het eiwit op het PM zichtbaar. Cyclustijd 200 ms. Schaal bar: 2 micrometer. Klik hier om de film te bekijken .
Movie 3. Movie van gist GFPRas2, met wisING RAW en deconvolved TIRF beelden. GFPRas2 is een snel bewegend eiwit (T1 / 2 van 2s niet gepubliceerde gegevens), snelle acquisitie tijden zijn belangrijk voor het dynamisch gedrag op te lossen. Cyclustijd 150 ms. Schaal bar: 2 micrometer. Klik hier om de film te bekijken .
Movie 4. Dubbele kleur film van gist eiwitten Fet3GFP en Pma1RFP. Eerste 10 frames vertegenwoordigen RAW-beelden en het laatste frame zijn deconvolved. Deze film toont het belang van beeldverwerking voor colokalisatie analyse. De wazige RAW-beelden worden aangescherpt, het maken van een analyse mogelijk te maken. Cyclustijd 5 s. Schaal bar: 2 micrometer. Klik hier om de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIRF microscopie is de techniek bij uitstek om beeld perifere eiwitten. De lage penetratie diepte van de evanescente veld minimaliseert van onscherpe licht, wat leidt tot een zeer goede signaal-ruisverhouding en maakt het mogelijk data-acquisitie met een hoge frame rates, of beeldvorming van heel zwak tot expressie gebrachte eiwitten. De combinatie van hoog contrast en hoge frame rates maakt TIRF-microscopie een perfect hulpmiddel voor beeldvorming van spatio-temporele dynamiek van cortically gelokaliseerde eiwitten. Interessant is dat de dikke celwand omgeving veel micro-organismen heeft beeldvorming van perifere eiwitten niet in de weg door TIRF. In feite is de huidige generatie van de vluchtige waarschijnlijk optreedt bij het grensvlak tussen celwand en plasmamembraan 5,10. Lichtreflectie die uit de cel die kan leiden tot lichtvoortplanting aan de celwand, die de grote oppervlakte kon worden afgebeeld in gistcellen 8 zou kunnen verklaren.
Voor een optimale kwaliteit van de TIRF imleeftijden is het cruciaal om een goed gekalibreerd microscopie systeem. De laser moet worden gericht en uitgelijnd voor elke opnamesessie. Dekglaasjes worden schoongemaakt (afb. 1A) en de cellen moeten goed worden geïmmobiliseerd. Voor de dubbele kleur imaging spectrale bloeden door moet rekening worden gehouden of geëlimineerd door gebruik te maken filtersets filters aparte emissie-bereik. Dit zal uiteraard komen op de prijs van tragere overname tijden als gevolg van mechanische filter. Snel filter wielen of galvanometer aangedreven verlichting bronnen kunnen omzeilen deze vertraging indien nodig. Alternatief kan de kritische fluorofoor (RFP) worden de zwakkere expressie gebrachte proteïne in een paar minimaliseren het signaalniveau interferentie.
Ondanks het hoge contrast, beelden die met een microscoop TIRF bevatten veel lawaai. Om deze ruis en verder te verhogen beeldcontrast beelden kunnen worden verwerkt met verschillende filters stappen. De werkwijze met de beste resultaten inervaring is 2D deconvolutie. Dit vereist de meting van de experimentele PSF voor elk monster en microscoop toestand. Dit kan echter vrij gemakkelijk en snel wordt uitgevoerd met fluorescerende korrels gemengd in de respectieve monster. Voor twee-kleuren experimenten deze kralen kan bovendien worden gebruikt voor kanaal uitlijning.
We hebben aangetoond dat de voordelen van TIRF microscopie voor beeldvorming van corticale eiwitten in micro-organismen. Combinatie van TIRF en beeldverwerking mogelijk overname van beelden met een hoge frame rates (<50 ms) en contrast en maakt het ook mogelijk visualisatie van zwak uitgedrukt eiwitten zoals Bit61. Een bijkomend voordeel van het uitvoeren TIRF beeldvorming op micro-organisme dat turgor in deze cellen tot stagnatie plasmamembranen, en minimaliseert topologische effecten TIRF signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door het Max Planck Instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
