Summary
Fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie est une approche puissante pour observer des structures à proximité de la surface de la cellule au contraste élevé et une résolution temporelle. Nous montrons comment la FRBR peut être utilisée pour étudier la dynamique des protéines au niveau du cortex des parois cellulaires fermés cellules bactériennes et fongiques.
Abstract
Microscopie TIRF a émergé comme une technologie d'imagerie puissant pour étudier la dynamique spatio-temporelles de molécules fluorescentes in vitro et dans des cellules vivantes 1. Le phénomène optique de réflexion interne totale se produit lorsque la lumière passe à partir d'un milieu d'indice de réfraction élevé dans un milieu à indice de réfraction faible à un angle plus grand qu'un angle caractéristique critique (plus près d'être parallèle à la limite). Bien que toute la lumière est réfléchie dans de telles conditions, une onde évanescente est créée qui se propage à travers et le long de la frontière, ce qui diminue de façon exponentielle avec la distance, et ne pénètre que les zones d'échantillonnage qui sont près de 100-200 nm de l'interface 2. En plus de fournir supérieure résolution axiale, l'excitation réduit de sortir de fluorophores de discussion crée un signal très élevé des ratios de bruit et minimise les effets néfastes de photoblanchiment 2,3. Être une technique widefield, la FRBR permet également d'image plus rapide en courant alternatifquisition que la plupart des configurations basées sur la numérisation confocale.
À première vue, la faible profondeur de pénétration de la FRBR semble être incompatible avec l'imagerie de cellules bactériennes et fongiques, qui sont souvent entourés de parois cellulaires épaisses. Au contraire, nous avons constaté que les parois cellulaires des levures et des cellules bactériennes réellement améliorer la convivialité de la FRBR et d'accroître l'éventail des structures observables 4-8. De nombreux processus cellulaires peuvent donc être directement accessible par la FRBR dans de petits micro-organismes monocellulaires, qui offrent souvent de puissantes techniques de manipulation génétique. Cela nous permet d'effectuer des expériences in vivo biochimie, où la cinétique des interactions entre protéines et les activités peuvent être évaluées directement dans les cellules vivantes.
Nous décrivons ici les différentes étapes nécessaires à l'obtention des images de grande qualité pour TIRF Saccharomyces cerevisiae ou des cellules de Bacillus subtilis. Nous signaler des problèmes divers qui peuvent affect FRBR visualisation des sondes fluorescentes dans les cellules et d'illustrer la procédure avec plusieurs exemples d'applications. Enfin, nous démontrons comment les images TIRF peut encore être améliorée en utilisant des techniques de restauration d'image.
Protocol
1. Préparation de l'échantillon
- Préparation des lamelles
Lamelles doivent être nettoyés des particules de poussière que la FRBR est sensible aux signaux de fond découlant de la lamelle (fig. 1A, Film 1).- Utilisation de bordereaux de pinces de couverture placer dans un support en céramique avec couvercle.
- Remplissez le récipient en verre avec NaOH 1 M (peut être réutilisé plusieurs fois).
- Incuber pendant 2 h sous une rotation continue lente (agitateur orbital). D'incubation excessive (> 8 h) permettra de créer des lamelles opaques.
- Laver deux fois avec de l'eau distillée pendant 5 min en rotation lente et continue.
- Magasin dans le support en céramique recouvert de l'éthanol à 100%.
- Préparation des cellules de Bacillus subtilis
- Diluer à une DO 600 de 0,01 à 0,05 dans 5 ml de milieux de croissance appropriés et de grandir à la phase exponentielle (DO 600 de 0,3-0,7).
- Préparer 1,25% d'agarose dans l'eau ou à moyen terme. Utiliser les médias synthétiques pour réduire la fluorescence de fond. Dissoudre la poudre dans un tube en plastique 1,5 ml à 95 ° C et stocker dans le bloc chauffant à 72 ° C.
- Ajouter une petite goutte d'agarose au milieu d'une diapositive et appuyez sur un pad en plat avec une deuxième lame. Soigneusement diapositives séparées après au moins 2 min ou de l'utiliser.
- Centrifuger à 500 cellules pl dans une centrifugeuse à micro 12.000 tpm pendant 1 min.
- Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 50 moyennes ul.
- Ajouter 2-4 cellules pi au centre de la plaquette d'agarose.
- Prenez une lamelle nettoyés à partir du conteneur rempli d'éthanol avec une pince, sécher à l'air et placer soigneusement sur un échantillon.
- Laissez cellules reposer pendant au moins 2 min avant à la microscopie.
- Sceller les bords de la lamelle avec VALAP (vaseline, la lanoline et de paraffine, mélangé à poids égal à la chaleur, s'appliquent, avec une petite brosse ou crachéula) pour l'imagerie à long terme.
- Préparation des cellules de Saccharomyces cerevisiae
- Diluer pré-culture et de grandir dans des milieux appropriés pendant au moins 5 h à la phase exponentielle (DO 600 0.2 à 0,8).
- Prenez une lamelle à partir du conteneur avec une pince et secs à l'air comprimé.
- Écart de 5 pi concanavaline Une solution (ConA, 2 ug / ml dans de l'eau distillée) sur le feuillet de couverture avec une pipette et sécher à l'air. Se lie à la ConA glucides de la paroi cellulaire de levure et immobilise les cellules de levure.
- Transférer la suspension 4,5 pi cellule de levure à un côté de la lamelle couvre-ConA-revêtu. Placez délicatement lamelle sur lame de microscope. Commencez avec un bord et de laisser tomber lentement pour éviter la formation de bulles d'air.
- Laissez cellules reposer pendant au moins 2 min avant à la microscopie.
- Sceller les bords de la lamelle avec VALAP (voir ci-dessus) pour l'imagerie à long terme.
- Configuration Microscope
Nous avons effectué toutes les expériences sur une configuration personnalisée en fonction de la FRBR sur un stand IMIC entièrement automatisé (Till Photonics) avec un Olympus 100x 1,45 objectif NA. 75 lasers DPSS mW à 488 nm (cohérente Sapphire) et 561 nm (Cobolt Jive) ont été utilisés comme sources de lumière. Lasers ont été choisis par un AOTF et dirigée à travers une fibre à large bande pour l'iMic. Une tête de galvanomètre axée sur deux axes du scanner a été utilisé pour ajuster les angles d'incidence ou de récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) position. Un galvanomètre supplémentaire a été utilisé pour basculer entre les épifluorescence, le FRAP et la FRBR. Les images ont été recueillies avec un Andor IXON DU-897 caméra EMCCD et une lentille de grossissement 2x en face de la caméra. L'acquisition a été contrôlée par l'acquisition en direct (Till Photonics) logiciel.
Les points suivants doivent être considérés:- Commande programmable sur la source d'éclairage (laser line) et la FRBR angle est essentielle pour des résultats reproductibles et surtout pour le multi-couleur FRBR, où les angles d'incidence doivent être ajustés pour chaque longueur d'onde d'excitation pour assurer une pénétration égale des ondes évanescentes. Dans notre configuration FRBR angle peut être ajusté instantanément au moyen de deux galvanomètres, qui sont directement contrôlés par le logiciel d'acquisition en direct.
- Notre installation personnalisée permet en outre de commutation rapide entre épifluorescence, la FRBR et FRAP via un galvanomètre troisième, permettant une simple mesure de la cinétique de localisation pour les objets tracés dans la FRBR.
- Objectif de type FRBR nécessite grandes ouvertures numériques de NA> 1,4. Nous avons utilisé un Olympus 100x NA 1,45 objectif.
- Caméras EMMCD fonctionnent très bien avec la FRBR en raison de leur grand rapport signal bruit. Pour permettre l'imagerie avec une sensibilité optimale, nous avons utilisé un pixel 512x512 rétroéclairé caméra EMCCD avec une taille de pixel de 16 microns. Pour maintenir la résolution maximale, nous avons placé un paquet de MAGN 2xLentille ification en face de l'appareil.
- Comme la FRBR est une technique widefield, l'intensité des faisceaux laser est étalée. Lasers solides donc souvent d'améliorer l'imagerie. Nous avons utilisé 75 mW diode pompé à l'état solide (DPSS) lasers à 488 nm et 561 nm.
- Pour garder les cellules dans des conditions optimales de croissance lors de l'imagerie, l'utilisation des contrôles environnementaux appropriés. Nous avons utilisé une chambre de chauffage sur mesure (Fig. 1B) pour étudier les mutants de levure de température sensibles. Pour l'échange de moyenne lors de l'acquisition que nous soit utilisé des chambres à flux simples ou boîtes de culture à fond de verre qui peuvent être facilement accessibles par le dessus sur le microscope inversé.
- Réglage des paramètres
- Identifier la position de cellules en utilisant un éclairage sur fond clair. LED rouge sont particulièrement bonnes, car ils ne pas provoquer de dégâts importants photo.
- Mettez à l'illumination laser et sélectionner des lasers et des mélanges appropriés de filtrage pour exciter les fluorophores dechoix. Assurez-vous que l'angle FRBR est sous-critique, ou vous ne serez pas en mesure de détecter tout signal provenant de protéines de fusion GFP. En cas de doute définir l'angle FRBR à 0 ° pour obtenir un faisceau laser perpendiculaire. Trouvez la section supérieure de la cellule (du côté de la cellule en face de la lamelle). Modifier l'angle d'incidence du faisceau laser jusqu'à ce que les signaux disparaissent lentement augmenter l'angle jusqu'à ce que le point où la fluorescence à des réapparaît surface cellulaire (Film 2). Réglez-z se concentrer à nouveau pour la position optimale à la surface. Acceptables angles TIRF créer aucun halo flou sur le bord de la cellule (Fig. 1C). Si photo significative de blanchiment se produit lors de l'installation, à l'exception de l'angle FRBR et de passer à une position stade écru avant de commencer l'acquisition.
- Ajuster l'intensité laser et le gain de la caméra afin de maximiser la plage dynamique (signal élevé par rapport bruit sans saturer pixels). Typiquement caméras EMCCD sont optimales pour détecter des signaux très faibles au signal élevé chez le rat le bruitios. Pour des signaux plus forts réguliers des caméras CCD produisent moins de bruit et offrent une plage dynamique plus large.
- Microscopie TIRF est très sensible aux différences de hauteur des petits de la lamelle, résultant dans des cellules seulement quelques, qui peuvent être imagées dans le même temps (Fig. 1D). Pour de petites cellules de la région d'acquisition (région d'intérêt, le retour sur investissement) peuvent donc souvent être réduite à une sous-région contenant l'objet de choix. Cela réduit également le temps nécessaire pour transférer les données de la puce sur le disque dur, souvent l'étape limitante à des cadences élevées.
- Pour la double couleur expériences TIRF assurez-vous de réduire au minimum par le biais de purge de fluorophores. Pour DP / GFP paires d'utiliser des filtres d'émission distincts que DP est faiblement excité par la lumière 488 nm (Fig. 2A). La plupart des filtres sont pas parfaitement alignées les unes avec les autres. Filtrez décalage peut être corrigé en utilisant des perles fluorescentes mélangées avec des cellules. Pour atteindre la profondeur de pénétration comparable, ajuster les angles de la FRBR séparément for chaque ligne laser. Un flux de travail typique est illustré à la figure. 2B.
- Un paramètre critique qui influe sur la qualité d'image est d'alignement au laser et un objectif propre. Pour aligner le laser, l'accent d'abord sur la position z utilisé pour la FRBR imagerie. Puis retirer l'échantillon et nettoyer l'objectif de l'ensemble d'huile (huile résiduelle conduira à la diffraction de la lumière laser et mouchetures dans le profil de faisceau). Projetez le laser sur le plafond en mode TIRF et de calibrer la position 0 ° de telle sorte que le laser est en ligne droite avec l'objectif (utiliser de points de référence, toujours porter des lunettes de sécurité laser et d'éviter toutes les réflexions dans la trajectoire du faisceau). La mise au point laser à une taille minimale. Notre installation fournit une lentille mobile placée entre galvos et microscope pour faciliter l'étalonnage rapide. Après un ajustement optimal, le profil laser doit former un puits de définir tache avec la forme à peu près ronde. Effectuer le calibrage avant chaque séance afin d'obtenir une qualité d'image optimale.
3. Les résultats représentatifs
- La distribution d'homologues d'actine et enzymes de la paroi cellulaire dans Bacillus subtilis. On imagé cellules exprimant fusion GFP, de la MBL actine homologue ou l'PbpH transpeptidase par FRBR et épifluorescence régulière. La profondeur de pénétration dans les FRBR est nettement réduite et limitée à la surface face à la lamelle (figure 3A, B). Le PbpH transpeptidase faiblement exprimé localise aux correctifs corticales qui sont à peine visibles par épifluorescence, mais peuvent être clairement distingués par la FRBR (Fig. 3B). Le taux de pénétration réduite peut être mieux observé pour le signal PbpHGFP à cloisons, qui apparaissent comme des lignes à épifluorescence, mais sous forme de points dans la FRBR (figure 3B, flèche).
- Domaines protéiques dans la membrane plasmique de la levure. Exemples pour le réseau comme motifs formés par des protéines membranaires de la levure sont déjà donné dans la figure. 1C et2. En plus de l'amélioration du contraste dans les FRBR, qui permet la distinction claire de ces modèles de type réseau, des signaux faibles peuvent parfois être détectée exclusivement par microscopie TIRF. A titre d'exemple, on imager une fusion GFP du Bit61 TORC2 composant complexe de Saccharomyces cerevisiae. Cette protéine est faiblement exprimé et forme de petites taches corticales avec des copies de protéines par seulement quelques patch 9. En épifluorescence quelques paquets sont visibles au-dessus du solide, tandis que les patchs peuvent être imagées avec très bon signal à bruit dans la FRBR (Fig. 3C). Par conséquent FRBR est particulièrement bien adapté pour étudier les structures faiblement fluorescentes et des protéines à la surface cellulaire. La résolution axiale élevée fournie par la FRBR réduit déjà la fluorescence de fond. Amélioration supplémentaire de contraste de l'image peut être obtenue grâce aux différentes étapes de traitement d'image. Une technique simple standard est de péréquation de fond local, où une image floue est soustraite de laoriginale. Le flou peut être réalisée avec une variété de filtres passe-bas, y compris filtres médians ou courbe de Gauss (Fig. 3D). Local de soustraction de fond élimine le bruit et aiguise les structures de haute intensité. Toutefois, cela vient souvent au prix d'une perte de structures fines et d'amplification exagérée des régions de haute intensité (Fig. 3D, flèche). Une procédure est supérieure déconvolution 2D, qui peut être réalisé avec des logiciels gratuits ou disponibles dans le commerce tels que ImageJ, Matlab ou Huygens (scientifique Volume Imaging bv). Images TIRF fournir une très bonne résolution axiale et donc une fonction de point près de deux dimensions propagation (PSF). Nous déterminée expérimentalement cette PSF par l'acquisition d'images de 40 nm perles fluorescentes avec les mêmes paramètres qui ont été utilisés pour l'imagerie réelle (objectif, appareil photo, d'excitation et de longueur d'onde d'émission) Le PSF expérimentale a ensuite été utilisé pour la déconvolution avec un algorithme du maximum de vraisemblance classique Huygens. Tempscaduque films de GFPRas2 ou de Fet3GFP et Pma1RFP (Films 3 et 4) montrent l'augmentation de contraste après déconvolution. Dans les images en couleur doubles, il est essentiel pour optimiser le contraste, pour être en mesure de quantifier les valeurs de colocalisation (Film 4).
- Analyse du chiffre d'affaires de protéines au niveau du cortex cellulaire. FRBR et FRAP offrent une puissante combinaison pour l'étude de la dynamique des protéines corticales. Toutefois, afin de permettre l'utilisation efficace de ces techniques, le contrôle rapide des angles du laser et des positions est nécessaire. Dans la FRBR, une technique large champ, le laser doit être focalisé sur le plan focal arrière et doit suivre un angle d'incidence faible profondeur pour atteindre le reflet désiré. En revanche, le FRAP le laser nécessite de se concentrer directement sur l'échantillon et positionné avec précision spatiale élevée pour permettre le blanchiment de structures définies ou des régions. La configuration de à la photonique, nous avons utilisé dans nos expériences permet un contrôle très rapide et intuitif sur eparamètres ESE. Deux galvanomètre contrôlées miroirs sont utilisés pour ajuster la position du PAF en x, y ou pour régler l'angle d'incidence de la FRBR. Un troisième miroir est utilisé pour basculer entre les chemins optiques séparés pour la FRBR et FRAP éclairage (le laser est élargi par des lentilles supplémentaires dans le chemin de la FRBR). Tous les paramètres sont contrôlés par le LA (acquisition en direct) des logiciels et des étalonnages peut être rapidement effectuée pour chaque expérience pour atteindre les conditions optimales. Ce logiciel permet également la définition des positions de blanchiment lors de l'acquisition d'image, ce qui est essentiel pour les expériences sur les structures mobiles du PAF.
Grâce à cette fonction que nous pourrions exclure treadmilling de filaments MBL en tant que source pour la motilité observée Mbl contenant des correctifs (Fig. 3E). Cette observation a motivé notre recherche de mécanismes alternatifs de motilité, et a finalement abouti dans notre identification d'un type tout à fait inattendu de la motilité, où des complexes de protéines intracellulaires (y compris les Mbl) sont déplacés à travers les activité de paroi cellulaire de synthèse des enzymes résidant à l'extérieur de la cellule 4. De la même façon, nous avons pu observer les réarrangements lents de protéines de levure membrane plasmique, qui distribuent en réseau couvrant des domaines comme la surface de la cellule entière (Fig. 3F).
Ces exemples illustrent la façon dont la dynamique et la structuration des protéines corticales peuvent être directement évaluée en combinant la FRBR et les techniques du PAF.
4. Les résultats représentatifs
Figure 1. Réglage des paramètres. Une. Co sale vs nettoyéverslip. Signal de fond provenant de la poussière sur la lamelle interférer avec un potentiel GFP / DP signal lamelle nettoyé a moins de fond. B. personnalisé-rendu de commande de chauffage électrique indiquant la température réglée (a), porte la température à la sonde (b) et de l'échantillon (c) . C. Pma1GFP protéines de levure imagé avec des angles d'incidence en baisse (de haut à gauche au bas à droite). Les images montrent une perte soudaine de signal à l'angle critique et une diminution progressive de l'information structurelle et rapport signal sur bruit. D. champ inégale de vue. Une suspension dense de billes fluorescentes est imagée, montrant que seule une partie du champ de vue est mis au point. Barres d'échelle en A, B: 2 pm, dans C: 10 pm.
Figure 2. L'imagerie en couleur double. A. saigner à travers des Pil1RFP. Pil1RFP est excitéavec 488 nm et un laser 561 nm et la fluorescence est enregistré avec un filtre passe-bande double. Signal de Pil1RFP est faiblement visible dans le canal GFP. Échelle de la barre 2 um étapes B. typiques pour éviter de purge par le biais de l'imagerie double couleur. Après l'imagerie des cellules séparées avec des jeux de filtres, ils sont déconvolué et alignés (en utilisant des billes fluorescentes) avant d'être fusionnés pour l'analyse.
Figure 3. Des résultats représentatifs. A. Comparaison de la distribution GFPMbl dans B. subtilis en utilisant la FRBR ou régulier à épifluorescence (Epi) microscopie. Bleu: limite de la cellule de l'image en champ clair. Images représentent les projections moyennes des séries de données pour indiquer la zone couverte par des correctifs MreB mobiles surveillés avec des modes d'imagerie différents. B. Amélioration résolution axiale et le contraste de l'image FRBRs tenir compte de la PbpHGFP transpeptidase dans B. subtilis. flèches indiquent la coloration du septum, qui apparaît comme anneau en épifluorescence et sous forme de taches dans la FRBR. Temps d'exposition:. 100 ms C. Comparaison entre épifluorescence et l'illumination de la FRBR Bit61 composant complexe TOR dans S cerevisiae.. Bit61 est très faiblement exprimé 9. Temps d'exposition: 250 ms D. Comparaison des différentes méthodes de traitement d'image.. Série affichant l'image de la FRBR première Pma1GFP, soustraction de Gauss ou médians images floues, ainsi que de déconvolution en utilisant l'algorithme de maximum de vraisemblance dans Huygens. E. FRBR-PAF d'un seul timbre GFPMbl (ci-dessus astérisque) se déplaçant à travers une B. subtilis cellules. Le kymographe du patch non-récupération et le profil d'intensité le long de la kymographe (ligne pointillée) à la règle treadmilling en tant que source de mouvement. F. FRBR-FRAP d'une cellule de levure exprimant Pma1GFP. Notez la clôture de diffusion de l'lacune dans le schéma de coloration corticale. Barres d'échelle: 2 um. Temps en secondes.
Film 1. Film montrant B. cellules exprimant subtilis une protéine de fusion DP sur une lamelle sale. Notez que le signal DP ne se distingue guère du bruit de fond. 100 du temps de cycle ms. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 2. Film de Pma1GFP avec différents angles d'incidence. Angle est modifié de sous-critique à l'angle critique, jusqu'à ce que le signal est perdu. Note, à sous-critique signal interne angle est visible, provoquant images bruitées jusqu'à ce que l'angle critique à l'protéine h est visible. Le temps de cycle de 200 ms. La barre d'échelle: 2 um. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 3. Film de la levure GFPRas2, montrant alternatIng RAW et déconvolué images FRBR. GFPRas2 est une protéine qui évolue rapidement (T1 / 2 de données non publiées 2s), temps d'acquisition rapide sont importantes pour résoudre le comportement dynamique. 150 du temps de cycle ms. La barre d'échelle: 2 um. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 4. Film couleur double de la levure de protéines Fet3GFP et Pma1RFP. Les 10 premières images représentent des images RAW et dernières images sont déconvolué. Ce film montre l'importance du traitement d'image pour l'analyse colocalisation. Les images floues RAW deviennent aiguisé, faire une analyse possible. Le temps de cycle de 5 s. La barre d'échelle: 2 um. Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
Microscopie TIRF est la technique de choix aux protéines d'image périphériques. La profondeur de pénétration faible du champ évanescent minimise de sortir de la lumière mise au point, ce qui conduit à un signal de très bonne à bruit et permet l'acquisition de données à des vitesses élevées, ou d'imagerie de protéines exprimées très faiblement. La combinaison de contraste élevé et taux de rafraîchissement élevé rend microscopie TIRF un outil parfait pour l'imagerie dynamique spatio-temporelle des protéines corticale localisées. Il est intéressant de la paroi cellulaire épaisse qui entoure de nombreux microorganismes ne pas entraver l'imagerie des protéines périphériques par la FRBR. En fait, la génération actuelle de l'évanescente très probablement se produit à l'interface entre la paroi cellulaire et la membrane plasmique 5,10. Réflexion de la lumière qui sort de la cellule pourrait même conduire à la propagation de la lumière le long de la paroi cellulaire, ce qui pourrait expliquer la grande surface qui pourrait être visualisées dans des cellules de levure 8.
Pour une qualité optimale de la FRBR imâges, il est crucial d'avoir un système de microscopie bien calibré. Le laser doit être focalisé et aligné avant chaque séance d'imagerie. Lamelles doit être nettoyé (fig. 1A) et les cellules doivent être correctement immobilisé. Pour doubles purge d'imagerie spectrale de couleur par le biais doit être pris en compte ou éliminés à l'aide de filtres filtres ensembles plage d'émission séparée. Ce sera bien évidemment se faire au prix de temps d'acquisition plus lente en raison de changement de filtre mécanique. Rapides roues à filtres ou des sources d'éclairage axées sur galvanomètre peut contourner ce délai si nécessaire. En variante, le fluorophore critique (DP) peut être utilisé sur la plus faible protéine exprimée dans une paire, en minimisant le niveau d'interférence de signal.
Malgré le contraste élevé, des images prises avec un microscope TIRF contiennent un bruit important. Pour supprimer ce bruit et d'autres images de contraste d'image augmentation peuvent être traitées avec différentes étapes de filtration. La méthode avec les meilleurs résultats dans notrel'expérience est déconvolution 2D. Cela nécessite la mesure expérimentale de la PSF pour chaque échantillon et de l'état microscope. Cependant, ceci peut être réalisé assez facilement et rapidement en utilisant des billes fluorescentes mélangées dans l'échantillon concerné. Pour deux couleurs expériences de ces perles peut en outre être utilisé pour l'alignement du canal.
Nous avons démontré les avantages de l'utilisation microscopie TIRF pour l'imagerie des protéines corticales dans les micro-organismes. Combinaison de la FRBR et de traitement d'image permet l'acquisition d'images à des vitesses élevées (<50 ms) et de contraste et permet également la visualisation des protéines faiblement exprimées comme Bit61. Un avantage supplémentaire de réaliser l'imagerie TIRF sur micro-organisme est que la pression de turgescence dans ces cellules conduit à membranes plasmiques plats, et minimise les effets topologiques à signaux TIRF.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par la société Max Planck.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
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