Summary
총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경 가까이 높은 콘트라스트와 시간적 해상도의 세포 표면 구조를 관찰하기위한 강력한 방법입니다. 우리는 TIRF은 세포 벽 - 동봉된 세균과 곰팡이 세포의 피질에서 단백질 역학을 공부 고용 수있는 방법을 보여줍니다.
Abstract
TIRF 현미경은 체외에서 형광 분자의 spatio-현세의 역학을 연구하는 강력한 이미징 기술로와 세포에게 1 생활에서 등장했다. 빛이 특성 중요한 각도 (즉 가까이 경계와 평행하게있는 위하여)보다 큰 각도로 낮은 굴절률을 가진 중간에 높은 굴절률을 가진 매체에서 전달했을 때 총 내부 반사의 광학 현상이 발생합니다. 모든 표시등이 같은 상황에서 다시 반사되어 있지만, 지극히 미미한 파도가 만들어지고 그 전체 거리와 함께 기하 급수적으로 붕괴하고, 전용 인터페이스를이 근처 100-200 nm의있는 샘플 영역을 침투 경계를 따라 전파합니다. 우수 축 해상도를 제공하는 이외에 초점 fluorophores의 밖으로의 감소 여기는 잡음 비율로 매우 높은 신호를 생성하고 2,3을 photobleaching의 유해한 영향을 최소화합니다. widefield 기술이기 때문에, TIRF 또한 빠르게 이미지를 교류 할 수 있습니다기반 공촛점 설정을 스캔 가장 이상 quisition.
언뜻 TIRF의 낮은 침투 깊이는 종종 두꺼운 세포 벽에 둘러싸인 세균과 곰팡이 세포의 이미징과 호환되지 않는 것 같습니다. 반대로, 우리는 효모와 박테리아 세포의 세포 벽 실제로 TIRF의 가용성을 개선하고 관찰할 수있는 구조 4-8의 범위를 늘릴 것으로 나타났습니다. 많은 세포 과정에 따라서 직접적으로 종종 강력한 유전자 조작 기술을 제공하고 소규모, 단일 셀 미생물에 TIRF 액세스할 수 있습니다. 이것은 우리가 단백질 상호 작용과 활동의 속도론 직접 살아있는 세포에서 평가 수있는 생체내 생화학 실험에서 수행할 수 있습니다.
우리는 여기서 Saccharomyces cerevisiae의 또는 바실러스 subtilis 세포에 대한 고품질의 TIRF 이미지를 얻기 위해 필요한 각 단계를 설명합니다. 우리는 affe 수있는 다양한 문제점을 지적중부 표준시 TIRF 세포의 형광 프로브의 시각화와 여러 응용 예제와 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 TIRF 이미지가 더욱 안정적인 영상 복원 기법을 사용하여 향상시킬 수있는 방법을 보여줍니다.
Protocol
1. 샘플 준비
- 커버 전표 준비
TIRF는 coverslip (그림 1A, 영화 1)에서 발생하는 배경 신호에 민감으로 Coverslips는 먼지 입자에서 청소해야합니다.- 뚜껑과 세라믹 홀더에 포셉 장소 커버 전표를 사용.
- 1 M NaOH (여러 번 재사 용할 수)와 함께 유리 컨테이너를 채웁니다.
- 느린 연속 회전 (궤도 흔드는)에서 2 시인데 위해 품어. 과도한 부화가 (> 8 H) 불투명 커버 전표를 생성합니다.
- 느린 연속 회전 미만 5 분 동안 증류수로 두 번 씻는다.
- 세라믹 홀더의 상점은 100 % 에탄올로 덮여.
- 바실러스 subtilis 세포 준비
- 적절한 성장 미디어의 5 ML에서 0.05 및 지수 상 (0.3-0.7의 OD 600)로 성장 - 0.01의 OD 600으로 희석.
- 물 또는 매체에서 1.25 % 아가로 오스를 준비합니다. 배경 형광을 줄이기 위해 합성 미디어를 사용합니다. 95에서 1.5 ML 플라스틱 튜브에 분말을 용해 72시 ° C와 가열 블록의 매장 ° C.
- 두 번째 슬라이드가있는 평평한 패드로 슬라이드와 언론의 중간에 아가로 오스의 작은 방울을 추가합니다. 최소 2 분 후 또는 그 이전에 조심스럽게 별도의 슬라이드를 사용하십시오.
- 1 분 12.000 rpm으로 마이크로 원심 분리기 500 μl 세포를 내려 봐.
- 뜨는 취소, 50 μl 매체 resuspend 펠릿.
- 아가로 오스 패드의 중심에 2-4 μl 세포를 추가합니다.
- 가압 공기 건조 포셉와 에탄올 채워진 컨테이너에서 청소 커버 슬립을 가지고 신중하게 샘플을 놓으십시오.
- 세포가 현미경으로 갔다 최소한 2 분 동안 기다려야 해.
- VALAP (바셀린, 라놀린과 Parafin, 열 아래에 동등한 무게로 섞어 함께 coverslip의 가장자리를 밀봉, 작은 브러시에 적용하거나 때렸다고장기 이미징을위한 울라).
- Saccharomyces cerevisiae의 세포 준비
- 사전 문화를 희석하며 지수 상 (OD 600 0.2-0.8)으로 최소 5 H에 대한 적절한 미디어로 성장.
- 포셉 및 가압 공기 건조와 컨테이너에서 coverslip을 가져가라.
- 5 μl Concanavalin 가압 공기 피펫 건조와 커버 슬립의 솔루션을 (ConA, 증류수 2 μg / ml) 쇼핑 퍼졌다. ConA은 효모 세포 벽 탄수화물에 바인딩와 효모 세포를 움직이게.
- ConA 코팅 coverslip의 한쪽으로 4.5 μl 효모 세포 현탁액을 전송합니다. 현미경 슬라이드에 커버 전표를 조심스럽게 넣으십시오. 한쪽 가장자리로부터 시작하여 기포 형성을 피하기 위해 천천히 떨어뜨려 보자.
- 세포가 현미경으로 갔다 최소한 2 분 동안 기다려야 해.
- 장기 이미징을위한 VALAP있는 coverslip의 인감 가장자리 (위 참조).
- 현미경 설정
우리는 올림푸스 100x 1.45 NA 목표와 완전 자동화된 iMIC 스탠드 (Photonics까지)을 기반으로 한 사용자 정의 TIRF 설정에서 모든 실험을 수행했습니다. 488 nm의 (일관된 사파이어)과 561 nm의 (Cobolt 멍청한) 75 MW의 DPSS 레이저가 광원으로 사용되었다. 레이저는 AOTF를 통해 선택되고 iMIC에 광대역 광섬유를 통해 지시했다. 검류계 중심의 두 축 스캐너 헤드 (FRAP) 자리를 Photobleaching 후 입사 각도 또는 형광 복구를 조정하는 데 사용되었다. 추가 검류계는 epifluorescence, FRAP 및 TIRF 사이를 전환하는 데 사용되었습니다. 이미지 Andor iXON DU-897 EMCCD 카메라와 카메라 앞에서 2X 배율 렌즈로 수집되었다. 인수는 라이브 수집 (Photonics까지) 소프트웨어 패키지에 의해 통제되었다.
다음 사항이 고려되어야합니다 :- 조명원 이상의 프로그램 가능한 제어 (레이저 리터오프라인) 및 TIRF 각도 재현성 결과를 얻기 위해 특히 입사 각도가 지극히 미미한 파도 동등 침투력을 보장하기 위해 각각의 여기 파장에 따라 조정해야하는 멀티 컬러 TIRF위한 필수적입니다. 저희 설치 TIRF 각도에서 직접 라이브 수집 소프트웨어 패키지에서 제어되는 두 galvanometers를 통해 즉각 조정할 수 있습니다.
- 저희의 맞춤 설정 추가 TIRF에 추적 개체에 대한 현지화 동력학의 간단한 측정을 허용, 제 3 검류계 통해 epifluorescence, TIRF와 FRAP 사이의 빠른 전환이 가능합니다.
- 대상 유형 TIRF은 NA> 1.4의 높은 수치 apertures이 필요합니다. 우리는 올림푸스 100x NA 1.45 객관적를 사용했습니다.
- EMMCD 카메라는 노이즈 비율 높은 신호로 인해 TIRF와 함께 잘 작동합니다. 최적의 감도와 이미징을 허용하기 위해 우리는 다시 16 μm의의 픽셀 크기로 EMCCD 카메라가 켜지지 512x512 화소를 사용합니다. 최대 해상도를 유지하기 위해 우리는 2X magn을 배치카메라 앞에 ification 렌즈.
- TIRF은 widefield 기술, 레이저 광선의 강도이므로 밖으로 전염됩니다. 강력한 레이저 따라서 자주 이미징을 향상시킵니다. 우리는 75 MW 다이오드는 488 nm의와 561 nm의시 (DPSS) 레이저를 고체 상태로 펌핑 사용됩니다.
- 이미징 동안 최적의 성장 조건 하에서 세포를 유지하려면 적절한 환경 제어를 사용합니다. 우리는 효모 온도에 민감한 돌연변이를 공부하고 (그림의 1B) 맞춤 제작한 가열 챔버를 사용했습니다. 매체 교환의 경우 수집하는 동안 우리는 하나 쉽게 거꾸로 현미경에 상기에서 접근할 수있는 간단한 흐름 챔버이나 유리 바닥 문화 요리를 사용했습니다.
- 매개 변수를 조정
- 명시야 조명을 사용하여 세포의 위치를 파악합니다. 그들은 중요한 사진 손상을 유발하지 않으면 적색 LED가 특히 좋다.
- 의 fluorophores들을 흥분시키기 위해 레이저 조명으로 전환하고 적절한 레이저 및 필터 조합을 선택선택. TIRF 각도가 임계이고, 또는 GFP 융합 단백질로부터 발생하는 모든 신호를 감지할 수 없습니다 있는지 확인하십시오. 의심 수직 레이저 광선을 얻기 위해 0 °로 TIRF 각도를 설정합니다. 셀 (coverslip 직면하고있는 세포의 측면)의 상단에 섹션을 찾으십시오. 신호가 사라질 때까지 레이저 광선의 입사 각도를 변경하면 다음 천천히 지점까지 각도를 증가 어디에 세포 표면이 다시 나타납니다 (동영상 2)에서 형광. 조정 표면에 최적의 위치에 대해 다시 Z를 집중. 허용 TIRF 각도는 세포 (그림 1C)의 강가에는 흐린 후광을 만들 않습니다. 표백 중요한 사진은 설치하는 동안 발생하는 경우 TIRF 각도를 저장하고 인수를 시작하기 전에 표백하지 않은 단계 위치로 이동합니다.
- 레이저 농도 및 동적 범위 (포화 픽셀 않고 잡음 비율 높은 신호)를 극대화하기 위해 카메라 게인을 조정합니다. 일반적으로 EMCCD 카메라는 노이즈 쥐에 높은 신호에서 매우 낮은 신호를 감지하여 최적입니다개조. 강한 신호에 대한 일반적인 CCD 카메라는 적은 소음을 생산하고 더 넓은 다이나믹 레인지를 제공합니다.
- TIRF 현미경은 같은 시간 (그림의 1D)에서 몇 군데 할 수있는 몇 가지 세포의 결과로 coverslip의 작은 높이 차이에 매우 민감합니다. 작은 세포가 들어 취득 지역은 (관심있는 지역, 투자 수익) 따라서 종종 선택의 개체를 포함하는 subregion으로 줄일 수 있습니다. 이것은 또한 하드 드라이브에 칩의 데이터, 높은 프레임 속도 종종 속도 - 제한 단계를 전송하는 데 필요한 시간을 줄여줍니다.
- 이중 색상 TIRF 실험은 fluorophores을 통해 출혈을 최소화해야합니다. RFP / GFP 들어 쌍이 약하게 488 nm의 광 (그림 2A)에 의해 흥분되는 RFP와 같은 별도의 방출 필터를 사용합니다. 대부분의 필터는 완벽하게 서로 정렬되어 있지 않습니다. 필터링 오프셋은 세포에 섞인 형광 구슬을 사용하여 해결할 수 있습니다. 비교 침투 깊이를 달성하기 위해, 구경이 별도로 TIRF 각도를 조정R 각 레이저 라인. 전형적인 흐름이 그림에 그림 있습니다. 2B.
- 이미지 품질에 영향을 미치는 중요한 매개 변수는 레이저 정렬하고 깨끗한 목적입니다. TIRF 이미징에 사용되는 Z-위치에 레이저 먼저 초점을 정렬합니다. 다음 예제를 제거하고 모든 오일의 목표 (잔류 기름이 빔 프로파일의 레이저 빛과 speckles의 회절으로 이어질 것입니다)를 청소하십시오. TIRF 모드에서 천장에 레이저를 프로젝트와 레이저 목표는 (항상 레이저 안전 고글을 착용하고 빔 경로의 모든 반사를 방지, 기준 지점을 사용하여)와 직선에 있는지 등 0 ° 위치를 보정. 최소한의 크기로 레이저 스폿을 집중. 우리의 설정은 빠른 교정을 촉진하기 galvos 및 현미경 사이에 위치를 움직일 수있는 렌즈를 제공합니다. 최적 조정 후, 레이저 프로필은 잘 대략 둥근 모양으로 자리를 정의할 형성한다. 최적의 화질을 얻기 위해 모든 세션 이전 보정을 수행합니다.
3. 대표 결과
- 바실러스 subtilis에서 actin의 homologues 및 세포 벽 효소의 분포. 우리는 actin homologue MBL이나 TIRF 일반 epifluorescence 의한 transpeptidase의 PbpH의 GFP의 fusions을 표현 세포를 몇 군데. TIRF의 침투 깊이가 명확하게 감소하고 coverslip 직면하고 표면 (그림 3A, B)로 제한됩니다. 약하게 표현 transpeptidase의 PbpH는 epifluorescence 의해 거의 보이지 않지만 분명히 TIRF (그림 3B)로 구분할 수 피질 패치 localizes. 감소 침투는 최고 epifluorescence의 라인으로하지만 TIRF의 점 (그림 3B, 화살표)로 표시 septa에서 PbpHGFP 신호를 위해 관찰할 수있다.
- 효모 플라즈마 막에있는 단백질 도메인. 효모의 플라즈마 막 단백질에 의해 형성된 네트워크와 같은 패턴에 대한 예제는 이미 그림에 부여됩니다. 1C 및2. 이러한 네트워크와 같은 패턴의 명확한 구별을 허용 TIRF의 향상된 반면 이외에도 약한 신호는 때때로 TIRF 현미경에 의해 독점적으로 감지가 가능하다. 예를 들어, 우리는 Saccharomyces cerevisiae의에서 TORC2 복잡한 컴포넌트 Bit61의 GFP 융합 몇 군데. 이 단백질은 약하게 표현 및 패치 9 당에만 몇 가지 단백질 사본 작은 피질 패치를 형성하고 있습니다. 패치는 TIRF의 잡음 비율 (그림 3C)에 매우 좋은 신호를 몇 군데하실 수 있습니다 반면 epifluorescence에서만 몇 패치가 강한 배경 위에 볼 수 있습니다. 따라서 TIRF은 특히 세포 표면에 약하게 형광 구조와 단백질을 연구하는 데 적합합니다. TIRF가 제공하는 높은 축 해상도는 이미 배경 형광을 줄여줍니다. 이미지 콘트라스트의 추가적인 개선은 다양한 영상 처리 단계를 통해 얻을 수있다. 간단한 표준 기술은 흐리게 이미지에서 빼는되는 지역의 배경 균등화이다원본. 흐리게은 중앙 분리대 또는 가우스 필터 (그림 3D)를 포함 낮은 패스 필터의 다양한 수행할 수 있습니다. 지역 배경 뺄셈 노이즈를 제거하고 높은 강도 구조를 선명. 그러나 이것은 종종 미세 구조와 고휘도 영역의 과장 증폭 (그림 3D, 화살표)의 손실 가격에 온다. 우수한 절차는 ImageJ, Matlab 또는 호이겐스 (과학 볼륨 이미징 BV)와 같은 무료 또는 상용 소프트웨어 패키지와 함께 수행할 수 2D deconvolution입니다. TIRF 이미지는 아주 좋은 축 해상도 때문에 거의 2 차원 점 확산 함수 (PSF)를 제공합니다. 우리는 실험적으로 실험 PSF 그때의 고전 최대 확률 알고리즘과 함께 deconvolution을 위해 사용된 실제 이미징 (목적, 카메라, 여기 및 방출 파장)에 사용했던 동일한 설정으로 40 nm의 형광 구슬의 이미지를 획득하여이 PSF를 결정 호이겐스. 시간GFPRas2 또는 Fet3GFP 및 Pma1RFP의 영화 (영화 3과 4) deconvolution 후 대비 증가를 보여주는가 잘못됐다. 이중 컬러 이미지에서는이 colocalization 값 (영화 4) 정할 수 있도록, 대비를 극대화하는 것이 중요합니다.
- 세포 피질에서 단백질 회전율 분석. TIRF와 FRAP는 외피 단백질의 역학 연구를위한 강력한 조합을 제공합니다. 그러나 이러한 기술의 효율적 사용을 허용하기 위해, 레이저 각도와 위치의 신속한 통제가 필요합니다. TIRF, 다양한 현장 기법에서 레이저 다시 초점 평면에 집중해야하고 원하는 반사를 달성하기 위해 얕은 입사 각도를 따르도록해야합니다. 반대로, FRAP는 샘플에 직접 집중하고 정의된 구조 또는 영역의 표백 수 있도록 높은 공간 정확도로 위치되는 레이저가 필요합니다. 우리가 실험에 사용 photonics까지는에서 설정 회 이상의 매우 빠르고 직관적인 컨트롤을 제공ESE 매개 변수. 두 검류계 제어 거울은 X, Y의 FRAP 위치를 조정하거나 TIRF에 입사 각도를 설정하는 데 사용됩니다. 세 번째 미러는 TIRF 및 FRAP 조명 (레이저가 TIRF 경로에 추가 렌즈에 의해 확대되는)에 대해 별도의 빔 경로 사이를 전환하는 데 사용됩니다. 모든 설정은 라 (라이브 인수) 소프트웨어 및 교정 빠르게 최적의 조건을 달성하기위한 각 실험을 수행할 수에 의해 제어됩니다. 이 소프트웨어는 또한 운동성이있는 구조의 FRAP 실험을 위해 필수적이며, 이미지 수집,시 표백제 위치의 정의를 허용합니다.
이 기능을 사용하여 우리는 MBL 함유 패치 관찰된 운동성 (그림 3E)에 대한 소스로 MBL 필라멘트의 treadmilling을 제외할 수 있습니다. 이 관찰 대안 운동성 메커니즘에 대한 Google 검색을 동기, 마지막 세포내 단백질 단지는 (MBL 포함) activi 통해 이동 운동성의 전혀 예상치 못한 유형의 식별 결과세포 벽 타이 셀 4의 외부에 거주하는 효소를 합성. 유사한 방식으로, 우리는 (그림 3 층) 전체 세포 표면을 덮고 도메인과 같은 네트워크에 배포 효모 플라즈마 막 단백질의 느린 rearrangements을 관찰할 수 있었다.
이러한 예제는 역학과 대뇌 피질의 단백질의 patterning 직접 TIRF 및 FRAP 기법을 결합하여 평가하는 방법을 설명합니다.
4. 대표 결과
1 그림. 매개 변수를 조정. 있습니다. 더티 대 청소 공동verslip. coverslip에 먼지로 인해 발생하는 배경 신호가 잠재 GFP / RFP 신호를 방해, 청소 coverslip 적은 배경을 가지고 있습니다. B. 전기 가열 컨트롤러 () 탐침의 온도 (B)과 샘플 홀더 (C)를 설정 온도를 보여주는 주문 제작된 . C. 효모 단백질 Pma1GFP가 감소 입사 각도 (오른쪽 아래에서 왼쪽 위로부터)가 몇 군데. 이미지는 임계 각도에서 신호의 급격한 손실과 노이즈 비율 구조적 정보와 신호의 진보적인 감소를 보여줍니다. 전망 D. 불규칙적인 분야. 형광 구슬의 밀도 정지 전망 분야의 일부만 초점 것을 보여주는 몇 군데됩니다. 의 스케일 바, B, C : 2 μm의, : 10 μm의.
그림 2. 더블 컬러 이미징. 답변 Pil1RFP을 통해 과누출. Pil1RFP 흥분된다488 nm의와 561 nm의 레이저와 형광으로 이중 밴드 패스 필터로 기록됩니다. Pil1RFP의 신호는 GFP 채널에 약하게 볼 수 있습니다. 이중 컬러 이미징의를 통해 출혈을 방지하기 위해 스케일 바 2 μm의 B. 전형 단계. 이미징 별도의 필터 세트와 전지 후에, 그들은 분석을 위해 합병되기 전에 deconvolved 및 (형광 구슬을 사용하여) 정렬됩니다.
그림 3. 대표 결과. B에 GFPMbl 배포 A. 비교 TIRF 또는 일반 epifluorescence (에피) 현미경을 사용하여 subtilis. 블루 : 명시야 이미지에서 셀 경계. 이미지가 다른 이미지 모드와 감시 운동성이있는 MreB 패치의 적용 영역을 나타내는 시계열의 평균 전망치를 나타냅니다. 하군요 축 해상도와 TIRF 이미지의 대비를 향상S는 B에 transpeptidase의 PbpHGFP 썼 subtilis. 화살표 epifluorescence의 링처럼 TIRF의 패치로서 나타나는 septal 염색법을 나타냅니다. 노출 시간 :.. epifluorescence 및 S cerevisiae의 토르 복잡한 컴포넌트 Bit61의 TIRF 조명 100 사이 MS C. 비교. Bit61 매우 약하게 9를 표현하고 있습니다. 노출 시간 : 250 MS 다양한 영상 처리 방법 D. 비교.. Pma1GFP의 원시 TIRF 이미지를 보여주는 시리즈는 가우시안 또는 중간값 흐린 이미지뿐만 아니라, deconvolution의 뺄셈은 호이겐스에서 최대 확률 알고리즘을 사용합니다. B. 가로질러 움직이는 하나의 GFPMbl 패치 (별표 이상)의 E. TIRF-FRAP subtilis 셀을. 운동의 소스로 treadmilling 아웃 kymograph 따라 비 회복 패치 및 강도 프로파일 (점선)의 규칙 kymograph. Pma1GFP을 표현 효모 세포의 F. TIRF-FRAP. 의 잘 퍼지는 변론을 참고대뇌 피질의 염색법 패턴의 차이. 스케일 바 : 2 μm의. 초 단위 시간.
영화 1. B를 보여주는 영화 subtilis 전지는 더러운 coverslip에 RFP 융합 단백질을 표현. RFP 신호가 배경 잡음으로부터 거의 구별 않습니다. 사이클 타임 100 MS. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 2. 다른 입사 각도와 Pma1GFP의 영화. 신호 손실 때까지 각도는 임계에서 중요한 각도로 변경됩니다. 참고 임계 각도 내부 신호에 중요한 각도시에서 단지 단백질을 볼 때까지 시끄러운 이미지를 초래 볼 수 있습니다. 사이클 타임 200 MS. 스케일 바 : 2 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
동영상 3. 효모 GFPRas2의 영화, alternat를 보여주는ING RAW와 deconvolved TIRF 이미지. GFPRas2가 빠르게 움직이는 단백질 (2s되지 않은 데이터의 T1 / 2)이며, 빠른 획득 시간은 역동적인 동작을 해결하기 위해 중요하다. 사이클 타임 150 MS. 스케일 바 : 2 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 4. 효모 단백질 Fet3GFP 및 Pma1RFP의 더블 컬러 영화. 처음 10 프레임 RAW 이미지를 나타내며 마지막 프레임은 deconvolved됩니다. 이 영화는 colocalization 분석을위한 영상 처리의 중요성을 보여줍니다. 모호한 RAW 이미지 분석이 가능하고, 날카롭게된다. 사이클 타임 5의. 스케일 바 : 2 μm의. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIRF 현미경 이미지 주변 단백질에 대한 선택의 기술입니다. 지극히 미미한 필드의 낮은 침투 깊이 노이즈 비율 매우 좋은 신호로 연결 및 높은 프레임 속도, 또는 아주 약하게 표현 단백질의 영상과 데이터 수집을 허용 초점 광의 밖으로 최소화합니다. 높은 콘트라스트와 높은 프레임 속도의 결합 TIRF 현미경 cortically화된 단백질 이미징 spatio-시간적 역학을위한 완벽한 도구가 있습니다. 흥미롭게도 많은 미생물을 둘러싼 두꺼운 세포 벽이 TIRF에 의해 주변 단백질의 이미징을 방해하지 않습니다. 사실, 지극히 미미한의 실제 생성은 매우 가능성이 세포 벽 및 플라즈마 막 5,10 사이의 인터페이스에서 발생합니다. 비상구가 세포에도 8 효모 세포에서 몇 군데 수있는 넓은 표면적을 설명할 수있는 세포 벽, 함께 빛의 전파으로 이어질 수있는 빛의 반사.
TIRF IM의 최적의 품질에 대한나이는 잘 보정된 현미경 시스템을 가질 중요한 일이다. 레이저는 각 이미징 세션 전에 집중과 정렬되어야합니다. Coverslips은 청소 (그림 1A)과 세포가 제대로 고정해야한다. 이중 컬러 이미징 스펙트럼 출혈의 경우를 통해이 고려 또는 필터 세트 필터에게 별도의 방출 범위를 사용하여 제거되어야한다. 이것은 분명 기계적 필터 변경으로 인해 느린 수집 회 가격에 올 것이다. 필요한 경우 빠른 필터 바퀴 또는 검류계 기반 조명 소스는 이러한 지연을 회피하실 수 있습니다. 또는 중요한 형광단 (RFP)은 신호 간섭의 수준을 최소화 페어에 약한 표현 단백질에 사용할 수 있습니다.
높은 대비에도 불구하고, TIRF 현미경으로 촬영한 이미지는 상당한 소음을 포함합니다. 이러한 노이즈를 제거하고 더욱 증가 이미지 콘트라스트 이미지는 다양한 필터링 단계를 처리할 수 있습니다. 우리의 최고의 결과와 방법경험 2D deconvolution입니다. 이것은 각각의 샘플 및 현미경 조건에 대한 PSF의 실험적 측정이 필요합니다. 그러나, 이것은 각각의 샘플에 섞인 형광 구슬을 사용하여 쉽고 빠르게 공정하게 수행할 수 있습니다. 두 색상 실험이 구슬은 또한 채널 정렬에 사용할 수 있습니다.
우리는 미생물의 외피 단백질의 이미징을위한 TIRF 현미경을 사용의 이점을 증명하고있다. TIRF 및 이미지 프로세싱의 결합은 높은 프레임 속도 (<50 MS) 및 대비와 이미지 획득이 가능하며 또한 Bit61 같은 약하게 표현 단백질의 시각화를 가능하게합니다. 미생물에 TIRF 이미징을 수행하는 추가적인 이점은 이들 세포의 turgor 압력은 평면 플라즈마 점막에 이르게하고, TIRF 신호에 topological 효과를 최소화합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 맥스 플랑크 사회로부터 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
