Summary
Toplam İç Yansıma Floresans (TIRF) mikroskopi yakın yüksek kontrast ve zamansal çözünürlükte hücre yüzeyine yapıları gözlemlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Biz TIRF hücre duvarı kapalı bakteriyel ve mantar hücreleri kortekste protein dinamiklerini incelemek için istihdam edilebilir göstermek.
Abstract
TIRF mikroskopi in vitro floresan moleküllerin uzay-zamansal dinamiklerini incelemek için güçlü bir görüntüleme teknolojisi olarak ve hücrelerin 1 canlı ortaya çıkmıştır. Hafif karakteristik bir kritik açı (yani yakın sınır paralel olmaya) daha büyük bir açıyla düşük kırılma endeksi ile orta içine yüksek refraktif indeksi ile orta geçerken toplam iç yansıma optik olayı oluşur. Tüm ışık bu koşullar altında geri yansıtılmasına karşın, bir fani dalga oluşturulduğunu genelinde ve mesafe ile katlanarak bozunmaları ve sadece arayüz 2 civarındaki 100-200 nm örnek alanlar nüfuz sınır boyunca yayılır. Üstün aksiyal çözünürlük sağlamasının yanı sıra, odak florofor dışı düşük uyarılma gürültü oranı çok yüksek bir sinyal oluşturur ve 2,3 photobleaching zararlı etkilerini en aza indirir. Geniş açılı bir tekniği olan TIRF da daha hızlı görüntü ac veriyortemelli konfokal kurulumları tarama çoğundan daha quisition.
İlk bakışta, TIRF düşük penetrasyon derinliği genellikle kalın hücre duvarları ile çevrilidir bakteriyel ve mantar hücreleri, görüntüleme ile uyumlu görünmektedir. Aksine, maya ve bakteriyel hücre hücre duvarları aslında TIRF kullanışlılığını iyileştirmek ve gözlemlenebilir yapılar 4-8 aralığında artış olduğunu bulduk. Pek çok hücresel süreçleri bu nedenle doğrudan çoğu zaman güçlü genetik manipulasyon teknikleri sunan küçük, tek hücreli mikroorganizmalar, içinde TIRF tarafından erişilebilir. Bu bize protein etkileşimleri ve faaliyetlerin kinetiği doğrudan canlı hücreler içerisinde değerlendirilebilir vivo biyokimya deneyler, içinde gerçekleştirmenizi sağlar.
Biz burada Saccharomyces cerevisiae veya Bacillus subtilis hücreleri için yüksek kaliteli TIRF görüntüler elde etmek için gerekli adımları tek tek açıklayın. Biz Affe çeşitli sorunlara işaretct TIRF hücrelerinde floresan probların görselleştirme ve çeşitli uygulama örnekleri ile işlem göstermektedir. Son olarak, TIRF görüntüleri daha köklü görüntü restorasyon teknikleri kullanılarak artırılabilir nasıl gösterilmektedir.
Protocol
1. Numune Hazırlama
- Kapak slipleri hazırlanması
TIRF coverslip (Şekil 1A, Movie 1) kaynaklanan arka sinyaller karşı hassas olduğu için lameller toz parçacıkları temizlenmelidir.- Kapaklı bir seramik tutucu forseps yere kapak fişleri kullanma.
- 1 M NaOH (birden çok kez tekrar edilebilir) ile cam kap doldurun.
- Yavaş sürekli dönme (çalkalamalı) altında 2 saat süreyle inkübe edin. Aşırı inkübasyon (> 8 saat) opak kapak kayması yaratacaktır.
- Yavaş sürekli dönme altında 5 dakika için damıtılmış su ile iki kez yıkanır.
- Seramik tutucu Mağaza% 100 etanol kaplı.
- Bacillus subtilis hücreleri hazırlanması
- Uygun büyüme ortamı 5 ml 0.05 ve üstel faz (0,3-0,7 OD 600) büyümek - 0.01 bir OD 600 sulandırınız.
- Su veya orta 1.25% agaroz hazırlayın. Eşiğe azaltmak için sentetik ortam kullanın. 95 az bir 1.5 ml plastik tüp içinde toz Dissolve 72 ° C ve ısıtma bloğu mağaza ° C
- Ikinci bir slayt ile düz bir yastık içine bir slayt ve basın ortasına agaroz küçük bir damla ekleyin. En az 2 dakika sonra veya önce dikkatlice ayrı slaytlar kullanın.
- 1 dakika 12.000 rpm'de santrifüj mikro 500 ul hücreleri aşağı Spin.
- Süpernatant atın ve 50 ul ortamda Pastör pipetiyle pelet.
- Agaroz altlığın merkezine 2-4 ul hücre ekleyin.
- Basınçlı hava ile kuru forseps ile etanol dolu konteyner gelen temizlenmiş bir kapak kayma, alın ve dikkatle örnek yerleştirin.
- Hücrelerin mikroskop önce en az 2 dakika dinlendiriniz.
- VALAP (vazelin, lanolin ve Parafin, ısı altında eşit ağırlık karıştırılır ile lameller kenarları mühür, küçük bir fırça ile uygulamak veya tükürdüuzun vadeli görüntüleme için ula).
- Saccharomyces cerevisiae hücreleri hazırlanması
- Öncesi kültür seyreltilir ve üstel faz (OD 600 0.2-0.8) en az 5 saat uygun ortamda büyür.
- Forseps ve basınçlı hava ile kuru bir kaba bir coverslip atın.
- 5 ul Concanavalin basınçlı hava ile bir pipet ve kuru kapak kuponuna bir çözüm (ConA, distile su ile 2 mikrogram / ml) yayıldı. ConA maya hücre duvarının karbonhidratlar bağlanır ve maya hücreleri durağanlaştırır.
- ConA kaplı lameller bir tarafında 4.5 mikrolitre maya hücre süspansiyonu aktarın. Mikroskop lamı üzerine kapak kayma dikkatlice yerleştirin. Bir kenarı ile başlayın ve hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaş yavaş bırakalım.
- Hücrelerin mikroskop önce en az 2 dakika dinlendiriniz.
- Uzun vadeli görüntüleme için VALAP ile lameller Seal kenarları (yukarıya bakınız).
- Mikroskop kurulum
Biz bir Olympus 100x 1.45 NA amacı ile tamamen otomatik IMIC standı (Fotonik kadar) dayalı özelleştirilmiş TIRF kurulum tüm deneyler yaptı. 488 nm (Coherent Sapphire) ve 561 nm (Cobolt Jive) 75 mW DPSS lazer ışık kaynağı olarak kullanılmıştır. Lazerler bir AOTF ile seçilen ve IMIC geniş bant fiber üzerinden yönlendirildi. A galvanometre odaklı iki eksenli tarayıcı kafa (FRAP) pozisyonu Photobleaching sonra insidansı açıları veya Floresans Kurtarma ayarlamak için kullanılmıştır. Ek bir galvanometre Epifloresans, FRAP ve TIRF arasında geçiş yapmak için kullanılmıştır. Görüntüler bir Andor iXON DU-897 EMCCD kamera ve kamera önünde bir 2x büyütme lens ile toplanmıştır. Toplama Canlı Alma (Fotonik kadar) yazılım paketi ile kontrol edildi.
Aşağıdaki noktalar dikkate alınmalıdır:- Işık kaynağı üzerinde programlanabilir kumanda (lazer line) ve TIRF açısı tekrarlanabilir sonuçlar ve özellikle insidans açıları yiten dalgaların eşit nüfuz sağlamak için her eksitasyon dalga boyu için ayarlanması gerekebilir çok renkli TIRF için önemlidir. Bizim kurulum TIRF açısı doğrudan Canlı Toplama yazılım paketi denetlenir iki galvanometreler üzerinden anında ayarlanabilir.
- Özelleştirilmiş kurulum ayrıca TIRF izlenir nesneler için yerelleştirme kinetiği basit ölçüm sağlayan üçüncü bir galvanometre aracılığıyla Epifloresans, TIRF ve FRAP arasında hızlı geçiş sağlar.
- Amaç tipi TIRF NA> 1.4 yüksek sayısal açıklık gerektirir. Biz bir Olympus 100x NA 1.45 objektif kullanılır.
- EMMCD kameralar gürültü oranı yüksek sinyal nedeniyle TIRF ile çok iyi çalışıyoruz. Uygun duyarlılık ile görüntüleme sağlamak için biz geri 16 mikron piksel boyutu ile aydınlatılmış bir EMCCD kamera 512x512 piksel kullanılır. Maksimum çözünürlüğü korumak için bir 2x MAGN yerleştirilirkamera önünde ification objektif.
- TIRF Bir Geniş açılı, tekniği, lazer ışını yoğunluğu gibi serilir. Güçlü lazerler bu nedenle sık sık görüntüleme geliştirmek. Biz 75 mW diyot 488 nm ve 561 nm (DPSS) lazerler katı hal pompalı kullanılır.
- Görüntüleme sırasında optimum üreme koşulları altında, hücrelerde tutmak için, uygun çevresel denetimleri kullanabilirsiniz. Biz maya ısıya duyarlı mutantlar okumak için (Şekil 1B) bir ölçüye ısıtma odası kullanılır. Taşıyıcı değişimi için satın alma sırasında biz ya kolayca inverted mikroskop yukarıdaki ulaşılabilir basit bir akış odaları veya cam-alt kültür kaplarına kullanılır.
- Parametreleri ayarlama
- Aydınlık alan aydınlatma kullanılarak hücrelerin konumu belirleyin. Bunlar önemli fotoğraf hasarına neden yok gibi Kırmızı LED'ler özellikle iyi.
- En florofor heyecanlandırmak için lazer aydınlatma geçin ve uygun lazerler ve filtre kombinasyonları seçinseçim. TIRF açısı subkritik olduğunu veya GFP füzyon proteinleri kaynaklanan herhangi bir sinyal tespit etmek mümkün olmayacaktır emin olun. Şüphe dik bir lazer ışını elde etmek için 0 ° TIRF açısını ayarlayın. Hücre (coverslip bakan hücre yan) üst bölümüne ara. Sinyalleri kayboluncaya kadar lazer ışınının olay açısı Alter sonra yavaş yavaş noktaya kadar açısını artırmaktadır nerede hücre yüzeyinde yeniden görünür (Movie 2) floresans. Ayarlayın yüzeyde en uygun pozisyonu yine z-odaklanır. Kabul edilebilir TIRF açıları hücre (Şekil 1C) kenarında hiçbir bulanık halo oluşturun. Ağartma önemli fotoğraf kurulum sırasında oluşursa, TIRF açısı kaydetmek ve satın alma başlamadan önce bir ağartılmamış sahne konuma taşıyın.
- Lazer yoğunluğu ve dinamik aralık (doyurarak piksel olmadan gürültü oranı yüksek sinyal) maksimize etmek için kamera kazanç ayarlayın. Tipik EMCCD kameralar gürültü fareye yüksek sinyal çok düşük sinyalleri algılamak için optimum olanios. Güçlü sinyaller düzenli CCD kameralar daha az gürültü üretmek ve daha geniş dinamik aralık sunuyor.
- TIRF mikroskobu aynı zamanda (Şekil 1D) de yansıması sadece birkaç hücre elde lameller küçük yükseklik farklılıkları, çok duyarlıdır. Küçük hücreler için toplama bölgesi (ilgi alanı, ROI) bu nedenle sıklıkla tercih edilen nesnenin içeren bir alt bölge için azaltılabilir. Bu aynı zamanda sabit diske çip veri, yüksek kare hızında genellikle hız kısıtlayıcı adım aktarmak için gereken süreyi azaltır.
- Çift renk için TIRF deneyler florofor yoluyla kanama en aza indirmek için emin olun. RFP / GFP için çiftleri zayıf 488 nm ışık (Şekil 2A) tarafından heyecanlı TÇD gibi ayrı emisyon filtresi kullanın. Çoğu filtre mükemmel birbirleriyle uyumlu değildir. Filtre ofset hücreleri ile karışık floresan boncuklar kullanılarak düzeltilebilir. Karşılaştırılabilir penetrasyon derinliği elde etmek için, fo ayrı TIRF açıları ayarlamakr Her bir lazer çizgisi. Tipik bir akışı Şekil 'de gösterilmiştir. 2B.
- Görüntü kalitesini etkileyen kritik bir parametre lazer hizalama ve temiz bir hedeftir. TIRF görüntüleme için kullanılan z konumda lazer, ilk odak hizalamak için. Sonra örneği kaldırmak ve tüm petrol hedefi (kalan yağ ışın profili lazer ışığı ve benekler kırınımı yol açacaktır) temizleyin. TIRF modunda tavana lazer Proje ve lazer hedefi (her zaman lazer güvenlik gözlük ve ışın yolu tüm yansımaları önlemek, referans nokta kullanın) düz bir çizgi olduğu gibi 0 ° konumuna kalibre. Minimal bir boyuta lazer nokta odaklanın. Bizim kurulum hızlı kalibrasyon kolaylaştırmak için galvos ve mikroskop arasında konumlandırılmış bir lens kaydırma sağlar. Optimal ayarlama sonra, lazer profili iyi kabaca yuvarlak spot tanımlamak oluşturmalıdır. En iyi görüntü kalitesini elde etmek için her seanstan önce kalibrasyon gerçekleştirin.
3. Temsilcisi Sonuçlar
- Bacillus subtilis aktin homologları ve hücre duvarı enzimlerin dağılımı. Biz aktin homologu MBL veya TIRF ve düzenli Epifloresans tarafından transpeptidaz PbpH arasında GFP füzyon salgılayan hücrelerin görüntülendi. TIRF in penetrasyon derinliği açık bir şekilde azalır ve coverslip bakan yüzeyi (Şekil 3A, B) ile sınırlandırılmıştır. Zayıf ifade transpeptidaz PbpH Epifloresans tarafından zor görünür ama açıkça TIRF (Şekil 3B) ile ayırt edilebilir kortikal yamalar da bulunmaktadır. Düşük penetrasyon iyi Epifloresans çizgiler olarak değil TIRF noktalar (Şekil 3B, ok) olarak görünür septa az PbpHGFP sinyal için görülebilir.
- Yeast Protein plazma membranında etki. Maya plazma zar proteinleri tarafından oluşturulan ağ-benzeri örnekler için örnekler zaten Şekil verilmiştir. 1C ve2. Bu ağ-benzeri kalıpların net ayrım olanak TIRF in geliştirilmiş kontrast ek olarak, zayıf sinyaller bazen TIRF mikroskopi tarafından özel olarak tespit edilebilir. Örnek olarak, Saccharomyces cerevisiae gelen TORC2 kompleksi bileşeni Bit61 bir GFP füzyon görüntülenmiştir. Bu protein zayıf ifade ve yama 9 başına sadece birkaç protein kopya ile küçük kortikal yamalar oluşturur. Yamalar TIRF gürültü oranı (Şekil 3C) çok iyi bir sinyal ile görüntülenebilir ise Epifloresans sadece birkaç yama, güçlü bir arka plan üzerinde görülebilir. Bu nedenle TIRF, özellikle de hücre yüzeyinde zayıf flüoresan yapıları ve proteinler incelemek için son derece uygundur. TIRF tarafından sağlanan yüksek aksiyal çözünürlük zaten arka floresan azaltır. Görüntü kontrastını ek iyileştirme çeşitli görüntü işleme adımları ile elde edilebilir. Basit bir standart teknik bir bulanık görüntü çıkarılır yerel arka denkleştirme olduğuorijinal. Bulanıklık medyan veya Gauss filtreler (Şekil 3D) dahil olmak üzere alçak geçiren filtreler çeşitli yapılabilir. Yerel arka plan çıkarma gürültü kaldırır ve yüksek yoğunluklu yapılar keskinleştirir. Ancak, bu genellikle ince yapıları ve yüksek yoğunluklu bölgelerin abartılı amplifikasyon (Şekil 3D, ok) bir kaybı fiyata geliyor. Üstün bir prosedür gibi ImageJ, Matlab veya Huygens (Bilimsel Cilt Görüntüleme bv) gibi ücretsiz veya ticari yazılım paketleri ile yapılabilir 2D Dekonvolüsyonun vardır. TIRF görüntüleri çok iyi aksiyal çözünürlük ve bu nedenle yaklaşık iki boyutlu noktayı yayılma fonksiyonu (PSF) sağlar. Biz deneysel deneysel PSF sonra klasik bir maksimum olabilirlik algoritması ile Dekonvolüsyonun için kullanılan gerçek görüntüleme (objektif, kamera, eksitasyon ve emisyon dalga boyu) için kullanılan aynı ayarları ile 40 nm floresan boncuk görüntüleri alarak bu PSF belirlenen Huygens. ZamanGFPRas2 veya Fet3GFP ve Pma1RFP filmlerini (Filmler 3 ve 4) Dekonvolüsyonun sonra kontrast artış gösterdik sukut. Çift renkli görüntüler yılında kolokalizasyon değerleri (Movie 4) ölçmek için edebilmek için, kontrast en üst düzeye çıkarmak için çok önemlidir.
- Hücre kortekste protein ciro analizi. TIRF ve FRAP kortikal protein dinamikleri çalışma için güçlü bir kombinasyon sunuyor. Bununla birlikte, bu teknikler etkin kullanımını sağlamak için, lazer açılarda ve pozisyonlarda hızlı bir şekilde kontrol gereklidir. TIRF, geniş bir alanda teknikte, lazer arka odak düzlemi üzerinde duruldu gereken ve istenen yansıma elde etmek için sığ bir geliş açısı izleyin gerekiyor. Buna karşılık, FRAP örnek doğrudan odaklanmış ve tanımlanan yapıları veya bölge beyazlatma sağlamak için yüksek mekansal hassasiyetle konacak lazer gerektirir. Bizim Deneylerde kullanılan fotonik kadar gelen kurulum th üzerinde çok hızlı ve sezgisel kontrol sağlarese parametreleri. İki galvanometreden kontrollü bir ayna x, y FRAP konumunu ayarlamak için veya TIRF in geliş açısı ayarlamak için kullanılır. Üçüncü bir ayna TIRF ve FRAP aydınlatma (lazer TIRF yolunu ek lensler ile genişletmiştir edilir) için ayrı ışın yolları arasında geçiş yapmak için kullanılır. Tüm ayarlar LA (canlı kazanım) yazılım ve kalibrasyonları hızla en uygun koşulları sağlamak için her bir deney için yapılabilir tarafından kontrol edilir. Bu yazılım aynı zamanda hareketli yapıları FRAP deneyler için gerekli olan görüntü alma sırasında çamaşır suyu pozisyonların tanımı sağlar.
Bu özelliği kullanarak biz MBL içeren yamalar gözlenen hareketlilik (Şekil 3E) için kaynak olarak MBL filamentler treadmilling dışarıda olabilir. Bu gözlem alternatif motilite mekanizmaları için arama motive ve nihayet hücre içi protein kompleksleri (MBL dahil) aktiviteler aracılığıyla taşınır motilite, ve tamamen beklenmedik bir tip bizim tespit ettikhücre duvarı ty hücre 4 dışına bulunan enzimler sentezleme. Benzer bir şekilde, biz (Şekil 3F) tüm hücre yüzeyini kaplayan etki benzeri ağ içine dağıtmak maya plazma membran proteinlerinin yavaş düzenlenmeleri, gözlemlemek mümkün olmuştur.
Bu örnekler dinamikleri ve kortikal protein desenlendirme doğrudan TIRF ve FRAP tekniklerini birleştirerek değerlendirilebilir gösteriyoruz.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1.. Parametreleri ayarlama. A. Kirli vs temizlenmiş işbirliğiverslip. Coverslip toz kaynaklanan Arka sinyal potansiyel bir GFP / TÇD sinyali müdahale, temizlenmiş coverslip az geçmişe sahiptir. B. elektrikli ısıtma kontrol, (a) prob sıcaklık (b) ve numune tutucu (c) ayarlanan sıcaklık gösteren özel olarak yapılan . C. Maya protein Pma1GFP azalan insidansı açıları (altta soldan sağa yukarıdan) ile görüntülendi. Görüntüler kritik açıyla sinyal ani kaybı ve gürültü oranı yapısal bilgi ve sinyal ilerleyici azalma göstermektedir. Görünümü D. Dengesiz alanı. Floresan boncuk Yoğun bir süspansiyon görüş alanının sadece bir parçasıdır odak olduğunu gösteren görüntülenmektedir. Bir Ölçek bar, B: C 2 mikron, 10 mikron.
Şekil 2. Çift renkli görüntüleme. A. Pil1RFP içerisinden, havasını alın. Pil1RFP heyecanlı488 nm ve 561 nm lazer ve floresan ile bir çift bant geçiren filtre ile kaydedilir. Pil1RFP Signal GFP kanalda zayıf görünür. Çift renkli görüntüleme yoluyla sızdırma önlemek için Ölçek çubuğu 2 mikron B. Tipik adımları. Görüntüleme ayrı filtre setleri ile hücreleri sonra, analizi için birleştirildi edilmeden önce deconvolved ve (flüoresan boncuklar kullanılarak) hizalanır.
Şekil 3. Temsilcisi Sonuçları. B. GFPMbl dağıtım A. Karşılaştırılması TIRF veya düzenli Epifloresans (Epi) mikroskopi kullanılarak subtilis. Mavi: parlak bir alan görüntüden Hücre sınır. Görüntüler farklı görüntüleme modları ile izlenen hareketli MreB yamalar kapsadığı alanı göstermek için bir zaman serisinin ortalaması projeksiyonlar temsil eder. B. aksiyel çözünürlük ve TIRF görüntü kontrastını Geliştirildis B. transpeptidaz PbpHGFP çekilen subtilis. Oklar Epifloresans yılında halka olarak ve TIRF yamalar gibi görünür septal boyanma gösterir. Pozlama süresi:.. Epifloresans ve S cerevisiae'de TOR karmaşık bileşen Bit61 arasında TIRF aydınlatma arasında 100 ms C. karşılaştırılması. Bit61 çok zayıf 9 ifade edilir. Pozlama süresi: 250 ms farklı görüntü işleme yöntemlerinin D. karşılaştırılması.. Pma1GFP ham TIRF görüntü gösteren Serisi, Gaussian veya Medyan bulanık görüntülerin yanı sıra Dekonvolüsyonun çıkarma Huygens, maksimum olabilirlik algoritması ile. Bir B. hareket eden bir tek GFPMbl yama (yıldız üzeri) E. TIRF-FRAP subtilis hücresi. Hareket kaynağı olarak treadmilling dışarı kymograph boyunca olmayan iyileşme ve yama yoğunluğu profili (noktalı çizgi) kuralının kymograph. Pma1GFP eksprese eden, bir maya hücresi F. TIRF-FRAP. Bir yayılma kapanış Notkortikal boyama desen boşluğu. Ölçek çubukları: 2 mikron. Zaman saniye cinsindendir.
Film 1. B. gösteren Film subtilis hücreleri kirli bir coverslip bir RFP füzyon proteini ifade. TÇD sinyal arka plan gürültü zorlukla ayırt olduğunu unutmayın. Çevrim süresi 100 ms. filmi görmek için buraya tıklayın .
Film 2. Farklı insidans açıları ile Pma1GFP Movie. Sinyal kaybolana kadar Açı, subkritik kritik açı ile değişir. Not subkritik açılı iç sinyal kritik açıyla PM sadece protein görünür oluncaya kadar gürültülü görüntülere yol görünür. Çevrim süresi 200 ms. Ölçek çubuğu: 2 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .
Film 3. Maya GFPRas2 Movie, ALTERNAT gösterening RAW ve deconvolved TIRF görüntüler. GFPRas2 hızlı hareket eden bir protein (2s yayınlanmamış veri T1 / 2), hızlı toplama zamanı dinamik davranışı gidermek için önemlidir. Çevrim süresi 150 ms. Ölçek çubuğu: 2 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .
Film 4. Maya proteinleri Fet3GFP ve Pma1RFP Double renkli film. İlk 10 kare RAW görüntüler temsil ve son kareye deconvolved edilir. Bu film kolokalizasyon analiz için görüntü işleme önemini göstermektedir. Bulanık RAW görüntü analizi mümkün kılan bilenmiş olur. Çevrim süresi 5 s. Ölçek çubuğu: 2 mikron. filmi görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIRF mikroskopi görüntü periferik proteinleri tercih edilen tekniktir. Yiten alan düşük penetrasyon derinliği gürültü oranı çok iyi bir sinyal yol açar ve yüksek kare hızları, ya da çok zayıf ifade proteinlerin görüntüleme ile veri toplama sağlar odaklanma ışık, dışı en aza indirir. Yüksek kontrast ve yüksek kare oranı ile TIRF mikroskopi kortikal lokalize proteinlerin görüntüleme uzay-zamansal dinamiği için mükemmel bir araçtır. İlginçtir bir çok mikroorganizma çevreleyen kalın hücre duvarı TIRF periferik proteinler görüntüleme engel değildir. Aslında, kaybolan gerçek üretim çok muhtemeldir hücre duvarı ve plazma zarının 5,10 arasındaki kesişme noktasında oluşur. Çıkar hücre bile 8 maya hücreleri yansıması olabilir geniş yüzey alanı açıklayabilir hücre duvarı boyunca ışığın yayılımı yol açabileceği ışık yansıması.
TIRF im optimum kalite içinyaşları iyi ayarlanmış bir mikroskop sistemi için çok önemlidir. Lazer, her görüntüleme oturumundan önce odaklanmış ve aynı hizada olmalıdır. Lamelleri temizlenmiş (Şekil 1) ve hücreler düzgün immobilize gerekir edilmelidir. Çift renk görüntüleme spektral söğüş aracılığıyla hesaba veya filtre setleri filtreler ayrı emisyon aralığı kullanılarak ortadan kaldırılmalıdır. Bu tabii ki mekanik filtre değişikliği nedeniyle yavaş satın kez fiyata gelecek. Gerekirse Hızlı filtre çarklarını veya galvanometre odaklı aydınlatma kaynakları bu gecikme asabilirsiniz. Alternatif olarak, kritik fluorofor (RFP) sinyal parazit seviyesi en aza, bir çift zayıf ifade edilmiş protein kullanılabilir.
Yüksek kontrast rağmen, bir TIRF mikroskop ile çekilen resimlerin önemli gürültü içerir. Bu gürültü kaldırmak için ve daha fazla artış görüntü kontrastlı görüntüler çeşitli filtreleme adımlar ile işlenebilir. Bizim en iyi sonuçlar ile yöntemideneyim 2D Dekonvolüsyonun olduğunu. Bu, her örnek ve mikroskop durum için PSF deneysel ölçüm gerektirir. Bununla birlikte, bu örnek, ilgili karıştırılarak flüoresan boncuklar kullanılarak kolayca ve hızla oldukça gerçekleştirilebilir. Iki-renkli deneyler için, bu boncuklar ilave kanalı uyum için kullanılabilir.
Biz mikroorganizmalar kortikal protein görüntüleme için TIRF mikroskop kullanmanın avantajları göstermiştir. TIRF ve görüntü işleme kombinasyonu yüksek kare hızı (<50 ms) ve kontrasta sahip görüntüler elde etme imkanı sağlar ve bu Bit61 gibi zayıf ifade proteinlerin görselleştirme sağlar. Mikroorganizma üzerinde TIRF görüntüleme yapan bir diğer avantajı, bu hücrelerdeki turgor basıncı düz plazma membranları yol açar ve TIRF sinyallere topolojik etkilerini en aza indirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Max Planck toplum tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
