Summary
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopia è un approccio efficace per osservare le strutture in prossimità della superficie cellulare ad elevato contrasto e risoluzione temporale. Abbiamo dimostrato come TIRF può essere utilizzato per studiare dinamica della proteina alla corteccia di cellule di cellule batteriche e fungine parete chiusi.
Abstract
Microscopia TIRF è emerso come una tecnologia di imaging potente per studiare spazio-temporali dinamica delle molecole fluorescenti in vitro e in cellule viventi 1. Il fenomeno ottico di riflessione interna totale si verifica quando la luce passa da un mezzo con alto indice di rifrazione in un mezzo con indice di rifrazione basso ad un angolo maggiore di un angolo caratteristica critica (cioè più vicino ad essere parallelo al confine). Sebbene tutta la luce viene riflessa in tali condizioni, una onda evanescente viene creato attraverso e che si propaga lungo il confine, che decade esponenzialmente con la distanza, e penetra solo aree campione che sono 100-200 nm prossimità dell'interfaccia 2. Oltre ad assicurare un'elevata risoluzione assiale, l'eccitazione ridotta di fluorofori fuoco crea un segnale molto alti rapporti di rumore e minimizza gli effetti dannosi di photobleaching 2,3. Essendo una tecnica widefield, TIRF permette anche più veloce di immagini acquisizione rispetto alla maggior parte di scansione in base configurazioni confocale.
A prima vista, la profondità di penetrazione basso TIRF sembra essere incompatibile con imaging di cellule batteriche e fungine, spesso circondati da pareti cellulari spesse. Al contrario, abbiamo scoperto che le pareti cellulari del lievito e cellule batteriche effettivamente migliorare la utilizzabilità di TIRF e aumentare la gamma di strutture osservabili 4-8. Molti processi cellulari possono quindi accedere direttamente TIRF in piccoli microrganismi unicellulari, che spesso offrono potenti tecniche di manipolazione genetica. Questo ci permette di eseguire esperimenti in biochimica in vivo, dove la cinetica delle interazioni proteiche e delle attività può essere valutato direttamente in cellule viventi.
Descriviamo qui le singole fasi necessarie per ottenere immagini di alta qualità per TIRF Saccharomyces cerevisiae o cellule di Bacillus subtilis. Segnaliamo vari problemi che possono Affect visualizzazione TIRF di sonde fluorescenti in cellule ed illustrare la procedura con esempi di applicazione diversi. Infine, abbiamo dimostrato come le immagini TIRF può essere ulteriormente migliorata utilizzando consolidate tecniche di restauro delle immagini.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Preparazione di vetrini coprioggetto
Coprivetrini deve essere pulito dalle particelle di polvere, come TIRF è sensibile ai segnali di fondo derivanti dalla coprioggetto (Fig. 1A, Movie 1).- Utilizzando pinze vetrini coprioggetto posto in un contenitore in ceramica con coperchio.
- Riempire il contenitore di vetro con 1 M NaOH (possono essere riutilizzati più volte).
- Incubare per 2 h in lenta rotazione continua (orbitale). Incubazione eccessiva (> 8 h) creerà scivola copertura opaca.
- Lavare due volte con acqua distillata per 5 minuti sotto lenta rotazione continua.
- Conservare in supporto ceramico ricoperto in 100% di etanolo.
- Preparazione Bacillus subtilis cellule
- Diluire ad una OD 600 di 0,01-0,05 in 5 ml di terreni di crescita appropriati e crescere alla fase esponenziale (OD 600 dello 0,3-0,7).
- Preparare 1,25% agarosio in acqua o media. Utilizzare mezzi di sintesi per ridurre fluorescenza di fondo. Sciogliere la polvere in un tubo di plastica da 1,5 ml a 95 ° C e conservare in blocco di riscaldamento a 72 ° C.
- Aggiungere una piccola goccia di agarosio al centro di una diapositiva e stampa in un tampone piatto con una seconda slitta. Attentamente diapositive separate dopo almeno 2 minuti o prima dell'uso.
- Spin down 500 cellule pl in micro centrifuga a 12.000 rpm per 1 min.
- Gettare il surnatante, e risospendere pellet in 50 microlitri di media.
- Aggiungere 2-4 pl cellule al centro del tampone agarosio.
- Prendete un vetrino pulito etanolo dal contenitore riempito con le pinze, asciugare con aria compressa e sistemarla su campione.
- Lasciate che le cellule riposare per almeno 2 minuti prima della microscopia.
- Sigillare i bordi del coprioggetto con VALAP (vaselina, lanolina e paraffina, mixato presso lo stesso peso a caldo, si applica con un pennello piccolo o sputatoula) per l'imaging lungo termine.
- Preparazione di cellule di Saccharomyces cerevisiae
- Diluire pre-cultura e crescere in mezzi adeguati per almeno 5 ore alla fase esponenziale (OD 600 0,2-0,8).
- Prendete un vetrino dal contenitore con una pinza a secco e con aria compressa.
- Distribuire 5 Concanavalina pl Una soluzione (ConA, 2 ug / ml in acqua distillata) su vetrino con una pipetta e asciugare con aria pressurizzata. ConA lega ai carboidrati della parete del lievito e immobilizza cellule di lievito.
- Trasferire 4,5 pl sospensione di cellule di lievito ad un lato del ConA rivestita coprioggetto. Posizionare con cura coprioggetto sul vetrino da microscopio. Inizia con un bordo e lasciare cadere lentamente per evitare la formazione di bolle d'aria.
- Lasciate che le cellule riposare per almeno 2 minuti prima della microscopia.
- Sigillare i bordi del coprioggetto con VALAP (vedi sopra) per l'imaging a lungo termine.
- Microscopio di installazione
Abbiamo eseguito tutti gli esperimenti su una configurazione personalizzata TIRF basato su un supporto IMIC completamente automatizzato (Till Photonics) con un obiettivo 100x Olympus 1,45 NA. 75 laser DPSS mW a 488 nm (Coherent Sapphire) e 561 nm (Cobolt Jive) sono stati utilizzati come sorgenti di luce. I laser sono stati selezionati attraverso un AOTF e diretto attraverso una fibra a banda larga per iMic. Un galvanometro-driven due assi testa scanner è stato usato per regolare gli angoli di incidenza o di recupero di fluorescenza dopo Photobleaching (FRAP) posizione. Un ulteriore galvanometro è stato utilizzato per passare da epifluorescenza, FRAP e TIRF. Le immagini sono state raccolte con uno IXON Andor DU-897 EMCCD fotocamera e una lente di ingrandimento 2x di fronte alla telecamera. L'acquisizione è stata controllata con l'acquisizione live (Till Photonics), pacchetto software.
I punti seguenti dovrebbero essere considerati:- Controllo programmabile sulla sorgente di illuminazione (laser line) e TIRF angolo è essenziale per ottenere risultati riproducibili e soprattutto per il multi-color TIRF, dove angoli di incidenza devono essere adeguate per ogni lunghezza d'onda di eccitazione per garantire la parità di penetrazione delle onde evanescenti. Nel nostro angolo di installazione TIRF può essere regolato istantaneamente attraverso due galvanometri, che sono direttamente controllati dal pacchetto software di acquisizione dal vivo.
- La nostra configurazione personalizzata consente inoltre il passaggio rapido tra epifluorescenza, TIRF e FRAP attraverso un galvanometro terzi, ai fini semplice misurazione della cinetica di localizzazione per gli oggetti tracciati in TIRF.
- Obiettivo di tipo TIRF richiede alte aperture numeriche di NA> 1.4. Abbiamo usato una Olympus 100x NA obiettivo 1,45.
- EMMCD telecamere funzionano molto bene con TIRF a causa del loro elevato rapporto segnale-rumore. Per consentire l'imaging con una sensibilità ottimale abbiamo usato un 512x512 pixel retroilluminato EMCCD fotocamera con una dimensione del pixel di 16 um. Per mantenere la massima risoluzione abbiamo messo un magn 2xificazione lente di fronte alla telecamera.
- Come TIRF widefield è una tecnica, l'intensità di raggi laser si sviluppa. Laser forti quindi spesso migliorare l'imaging. Abbiamo usato 75 mW pompato a diodi a stato solido (DPSS) laser a 488 nm e 561 nm.
- Per mantenere le cellule in condizioni di crescita ottimali durante l'imaging, l'uso di adeguati controlli ambientali. Abbiamo usato una camera di misura riscaldante costituito (Fig. 1B) per studiare mutanti sensibili alla temperatura di lievito. Per lo scambio di media durante l'acquisizione si sia utilizzato delle camere a flusso semplici o con fondo di vetro piatti della cultura che può essere facilmente accessibili dall'alto sul microscopio invertito.
- Regolazione dei parametri
- Identificare la posizione di celle usando un'illuminazione brillante campo. I LED rossi sono particolarmente buone in quanto non provocare danni significativi foto.
- Passare alla illuminazione laser e selezionare laser appropriate e combinazioni di filtri per eccitare i fluorofori discelta. Assicurarsi che l'angolo TIRF è sottocritico, o non sarà in grado di rilevare qualsiasi segnale derivante da proteine di fusione GFP. In caso di dubbio impostare l'angolo TIRF a 0 ° per ottenere un fascio laser perpendicolare. Trova la sezione superiore della cella (lato della cella di fronte al vetrino). Modificare l'angolo incidente del fascio laser fino segnali scomparire quindi aumentare lentamente angolo fino al punto in cui fluorescenza a riappare superficie cellulare (Film 2). Regolare z-fuoco nuovamente per la posizione ottimale in superficie. Accettabili angoli TIRF creare alcun alone sfocato al bordo della cella (fig. 1C). Se photo significativa sbiancamento si verifica durante l'installazione, salvare l'angolo di TIRF e passare ad una posizione prima di iniziare la fase di greggi di acquisizione.
- Regolare l'intensità laser e guadagno della telecamera per massimizzare la gamma dinamica (elevato rapporto segnale-rumore senza pixel saturazione). Tipicamente EMCCD telecamere sono ottimali per rilevare i segnali molto bassi a segnale alto a rat rumoreios. Per i più forti segnali regolari telecamere CCD producono meno rumore e offrono una gamma dinamica più ampia.
- Microscopia TIRF è molto sensibile a piccole differenze di altezza del vetrino, risultante in cellule pochi, che possono essere esposte al tempo stesso (Fig. 1D). Per piccole celle della regione di acquisizione (regione di interesse, ROI) può quindi essere ridotta a una sottoarea contenente l'oggetto di scelta. Ciò riduce anche il tempo necessario per trasferire i dati dal chip al disco rigido, spesso il fattore limitante a frame rate elevati.
- Per doppio colore esperimenti TIRF assicurarsi per ridurre al minimo spurgo attraverso di fluorofori. Per RFP / GFP coppie di utilizzare filtri di emissione separate come RFP è debolmente eccitati dalla luce 488 nm (Fig. 2A). La maggior parte dei filtri non sono perfettamente allineate tra loro. Filtrare offset può essere corretto utilizzando perle fluorescenti mescolate con cellule. Per ottenere la profondità di penetrazione comparabile, regolare gli angoli TIRF separatamente for ciascuna riga laser. Un flusso di lavoro tipico è illustrato in Fig. 2B.
- Un parametro fondamentale che influenza la qualità delle immagini è l'allineamento laser e un obiettivo pulito. Per allineare il, primo obiettivo del laser sulla posizione z usato per TIRF imaging. Quindi rimuovere il campione e pulire l'obiettivo di tutto l'olio (olio residuo porterà alla diffrazione della luce laser e chiazze nel profilo del fascio). Proiettare il laser sul soffitto in modo TIRF e calibrare la posizione 0 ° in modo che il laser è in linea retta con l'obiettivo (utilizzare punto di riferimento, indossare sempre occhiali di protezione laser e di evitare tutti i riflessi del percorso del fascio). Mettere a fuoco il punto laser a una dimensione minima. La configurazione offre una lente mobile posizionato tra galvanometri e microscopio per facilitare una rapida calibrazione. Dopo la regolazione ottimale, il profilo di laser dovrebbe formare un ben definire la posizione di forma approssimativamente circolare. Eseguire la calibrazione prima di ogni sessione per ottenere una qualità ottimale dell'immagine.
3. Risultati rappresentativi
- Distribuzione di omologhi di actina e di enzimi della parete cellulare in Bacillus subtilis. Abbiamo ripreso le cellule che esprimono GFP fusioni del omologo actina Mbl o PbpH transpeptidasi da TIRF epifluorescenza e regolare. La profondità di penetrazione nel TIRF è chiaramente ridotta e limitata alla superficie rivolta verso il coprioggetto (Fig. 3A, B). Il PbpH transpeptidasi debolmente espresso localizza patch corticali che sono difficilmente visibili da epifluorescenza, ma possono essere chiaramente distinti da TIRF (Fig. 3B). La penetrazione ridotta può essere meglio osservata per il segnale PbpHGFP a setti, che appaiono come linee in epifluorescenza, ma come punti in TIRF (Fig. 3B, freccia).
- Domini proteici nella membrana plasmatica lievito. Esempi di rete come modelli formate dalle proteine di membrana plasmatica nel lievito sono già dato in fig. 1C e2. Oltre al contrasto migliore in TIRF che consente chiara distinzione di questi rete come modelli, segnali deboli possono talvolta essere rilevata esclusivamente mediante microscopia TIRF. Come esempio, abbiamo ripreso una fusione GFP del Bit61 TORC2 componente complesso da Saccharomyces cerevisiae. Questa proteina è espressa debolmente e forma piccole macchie corticali con copie solo poche proteine per patch 9. In epifluorescenza solo poche macchie sono visibili al di sopra della forte background, mentre le patch possono essere ripreso con segnale molto buon rapporto rumore TIRF (Fig. 3C). Pertanto TIRF è particolarmente adatto per studiare le strutture debolmente fluorescenti e le proteine sulla superficie cellulare. La risoluzione assiale ad alta fornito da TIRF riduce già fluorescenza di fondo. Ulteriore miglioramento del contrasto dell'immagine può essere ottenuta attraverso varie fasi di elaborazione delle immagini. Una tecnica semplice sfondo standard è di equalizzazione locale in cui viene sottratta una immagine sfocata daloriginale. Sfocatura può essere eseguita con una varietà di filtri passa basso tra filtri mediani o Gaussiana (Fig. 3D). Local sottrazione del fondo elimina il rumore e acuisce le strutture ad alta intensità. Tuttavia, questo viene spesso al prezzo di una perdita di strutture fini e amplificazione esagerata delle regioni ad alta intensità (Fig. 3D, freccia). Una procedura superiore è deconvoluzione in 2D, che può essere eseguita con i pacchetti di software libero o disponibile in commercio come ImageJ, Matlab o Huygens (Scientific Imaging Volume bv). Immagini TIRF provvedono ad una buona risoluzione assiale e quindi una quasi bidimensionale funzione di diffusione del punto (PSF). Abbiamo determinato sperimentalmente questa PSF con l'acquisizione di immagini di 40 nm perline fluorescenti con le stesse impostazioni che sono stati utilizzati per l'imaging reale (obiettivo, macchina fotografica, di eccitazione e lunghezza d'onda di emissione) La PSF sperimentale è stato quindi utilizzato per deconvoluzione con un algoritmo classico di massima verosimiglianza in Huygens. Tempoestingue film di GFPRas2 o di Fet3GFP e Pma1RFP Film di 3 e 4) dimostrano l'aumento di contrasto dopo la deconvoluzione. In doppie immagini a colori è fondamentale per massimizzare contrasto, per essere in grado di quantificare valori colocalizzazione (Film 4).
- Analisi del turnover proteico alla corteccia cellulare. TIRF FRAP e offrono una potente combinazione per lo studio della dinamica delle proteine corticali. Tuttavia, per consentire l'uso efficiente di queste tecniche, il controllo rapido angoli laser e posizioni è necessaria. In TIRF, una tecnica ampio campo, il laser deve essere focalizzato sul piano focale posteriore e deve seguire un piccolo angolo di incidenza per ottenere la riflessione desiderata. Al contrario, FRAP richiede il laser deve essere focalizzato direttamente sul campione e posizionata con elevata precisione spaziale per consentire sbianca di strutture definite o regioni. La messa a punto da fino a fotonica che abbiamo usato nei nostri esperimenti fornisce un controllo molto veloce e intuitivo nel thEse parametri. Due galvanometro controllati specchi sono utilizzati per regolare la posizione FRAP in x, y o per impostare l'angolo di incidenza in TIRF. Un terzo specchio viene utilizzata per passare da percorsi ottici separati per TIRF FRAP e illuminazione (il laser è ampliato da lenti addizionali nel percorso TIRF). Tutte le impostazioni sono controllati dal (sull'acquisizione) software LA e calibrazioni può essere rapidamente eseguita per ogni esperimento per ottenere condizioni ottimali. Questo software permette anche la definizione delle posizioni di candeggina durante l'acquisizione dell'immagine, che è essenziale per esperimenti di FRAP su strutture mobili.
Utilizzando questa funzione si potrebbe escludere treadmilling di filamenti MBL come fonte per la motilità osservato di Mbl contenenti patch (Fig. 3E). Questa osservazione motivato nostra ricerca di meccanismi alternativi motilità, e infine portato nella nostra identificazione di un tipo completamente inaspettato di motilità, dove vengono spostati complessi proteina intracellulare (anche Mbl) attraverso l'attivitàtà di parete cellulare sintetizzare enzimi che risiedono all'esterno della cella 4. In modo simile, siamo stati in grado di osservare le lenti riarrangiamenti di proteine plasmatiche di lievito di membrana, che distribuiscono in rete, come i domini che coprono l'intera superficie delle cellule (Fig. 3F).
Questi esempi illustrano come le dinamiche e il patterning di proteine corticali può essere valutato direttamente combinando TIRF e tecniche di FRAP.
4. Risultati rappresentativi
Figura 1. Regolazione parametri. A. Co sporco vs pulitoverslip. Segnale di fondo derivante dalla polvere sul vetrino interferire con un potenziale di GFP / RFP segnale coprioggetto pulito ha meno di fondo. B. Su misura regolatore di riscaldamento elettrico che mostra la temperatura impostata (a), porta la temperatura a sonda (b) e del campione (c) . C. Pma1GFP proteina di lievito ripreso con angoli di incidenza decrescente (da sinistra a destra in basso). Le immagini mostrano una improvvisa perdita di segnale con l'angolo critico e progressiva diminuzione informazioni strutturali e rapporto segnale-rumore. Campo D. irregolare di vista. Una sospensione densa di perline fluorescenti viene esposta, mostra che solo una parte del campo di vista è a fuoco. Barre di scala in A, B: 2 pm, in C: 10 micron.
Figura 2. Immagini a colori doppio. A. Bleed attraverso di Pil1RFP. Pil1RFP è entusiastacon 488 nm e 561 nm laser e fluorescenza viene registrato con un doppio filtro passa banda. Segnale di Pil1RFP è debolmente visibile nel canale GFP. Scala grafica 2 micron passi B. tipici per evitare di spurgo attraverso immagini a colori in doppia. Dopo imaging delle cellule con set di filtri separati, essi sono allineati e deconvolved (usando perline fluorescenti) prima di essere fuso per l'analisi.
Figura 3. Risultati rappresentativi. A. Confronto della distribuzione GFPMbl in B. subtilis utilizzano TIRF o regolare epifluorescenza (Epi) microscopia. Blue: confine cella dall'immagine campo chiaro. Le immagini rappresentano proiezioni media di una serie di tempo per indicare l'area coperta da macchie MreB motili monitorati con diverse modalità di imaging. B. Miglioramento della risoluzione assiale e il contrasto dell'immagine TIRFs conto del PbpHGFP transpeptidasi in B. subtilis. frecce indicano la colorazione del setto che appare come anello in epifluorescenza e come patch in TIRF. Tempo di esposizione:. 100 ms C. Confronto tra epifluorescenza e l'illuminazione TIRF del Bit61 TOR componente complesso in S cerevisiae.. Bit61 è molto debolmente espresso 9. Tempo di esposizione: 250 ms D. Confronto dei diversi metodi di elaborazione delle immagini.. Serie che mostra l'immagine raw TIRF di Pma1GFP, sottrazione di Gaussian o mediana immagini sfocate, così come deconvoluzione utilizzando l'algoritmo di massima verosimiglianza in Huygens. E. TIRF-FRAP di una singola patch GFPMbl (sopra asterisco) che si muove attraverso una B. subtilis cellulari. La chimografo del cerotto non recupero e il profilo di intensità lungo la chimografo (linea tratteggiata) escludere treadmilling come sorgente di moto. F. TIRF-FRAP di una cellula di lievito che esprime Pma1GFP. Nota la chiusura diffusiva dellacuna nel pattern di colorazione corticale. Barre di scala: 2 pm. Tempo in secondi.
Movie 1. Filmato che mostra B. subtilis cellule esprimono una proteina di fusione RFP su un vetrino sporco. Si noti che il segnale RFP è difficilmente distinguibile dal rumore di fondo. Tempo di ciclo di 100 ms. Clicca qui per vedere il film .
Movie 2. Movie di Pma1GFP con diversi angoli di incidenza. Angle è alterato da subcritica all'angolo critico, fino a quando il segnale viene perso. Si noti, a subcritica segnale angolo interno è visibile, provocando immagini rumorose fino a quando angolo critico solo la proteina al PM è visibile. Tempo di ciclo 200 ms. Bar Scala: 2 micron. Clicca qui per vedere il film .
Movie 3. Movie di lievito GFPRas2, mostrando alternatazione delle immagini RAW e deconvolved TIRF. GFPRas2 è una proteina in rapido movimento (T1 / 2 2s dei dati non pubblicati), tempi di acquisizione veloci sono importanti per risolvere il comportamento dinamico. Tempo di ciclo 150 ms. Bar Scala: 2 micron. Clicca qui per vedere il film .
Movie 4. Movie doppio colore di lievito e proteine Fet3GFP Pma1RFP. Primi 10 fotogrammi rappresentare le immagini RAW e ultimi fotogrammi sono deconvolved. Questo filmato mostra l'importanza della elaborazione di immagini per l'analisi colocalizzazione. Le immagini sfocate RAW diventare affilato, facendo un'analisi possibile. Tempo di ciclo 5 s. Bar Scala: 2 micron. Clicca qui per vedere il film .
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Discussion
Microscopia TIRF è la tecnica di scelta per proteine di immagine periferici. La profondità bassa penetrazione del campo evanescente minimizza di luce fuori fuoco, che porta ad un ottimo segnale rispetto al rumore e consente di acquisizione dati con un frame rate elevati, o immagini di proteine espresse molto debolmente. La combinazione di un elevato contrasto e frame rate elevati microscopia TIRF rende uno strumento ideale per immagini dinamiche spazio-temporali di proteine localizzate corticale. È interessante notare la parete cellulare spessa che circonda molti microrganismi non ostacola l'imaging di proteine periferici TIRF. Infatti, la generazione effettiva del evanescente molto probabilmente si verifica all'interfaccia tra parete cellulare e 5,10 membrana plasmatica. Riflessione di luce che esce dalla cella potrebbe anche portare alla propagazione della luce lungo la parete cellulare, che potrebbe spiegare la grande area superficiale che potrebbero essere esposte in cellule di lievito 8.
Per una qualità ottimale delle TIRF imetà è fondamentale avere un sistema di microscopia ben calibrato. Il laser deve essere focalizzato ed allineati prima di ogni sessione di imaging. Copri deve essere pulito (Fig. 1A) e le cellule devono essere opportunamente immobilizzato. Per spurgo doppie immagini a colori spettrali attraverso deve essere preso in considerazione o eliminato utilizzando filtri di filtri insiemi gamma separata emissione. Ciò, ovviamente, sono al prezzo di tempi di acquisizione più lenti a causa della sostituzione del filtro meccanico. Veloci ruote portafiltri o fonti di illuminazione basati su galvanometro può aggirare questo ritardo, se necessario. In alternativa, il fluoroforo critica (RFP) può essere utilizzato sulla proteina espressa debole in una coppia, minimizzando il livello di interferenza tra segnali.
Nonostante l'elevato contrasto, le immagini scattate con un microscopio TIRF contenere il rumore significativo. Per rimuovere questo rumore e aumentare ulteriormente le immagini di contrasto delle immagini possono essere elaborate con vari passaggi filtranti. Il metodo con i migliori risultati nelesperienza è deconvoluzione in 2D. Ciò richiede la misura sperimentale del PSF per ciascun campione e condizione microscopio. Tuttavia, questo può essere eseguito abbastanza facilmente e rapidamente usando perline fluorescenti mescolati nel campione rispettivo. Per due colori esperimenti queste perle Inoltre può essere utilizzato per l'allineamento canale.
Abbiamo dimostrato il vantaggio di utilizzare microscopia TIRF per l'imaging di proteine corticali nei microrganismi. Combinazione di TIRF e di elaborazione delle immagini consente l'acquisizione di immagini con frame rate elevati (<50 ms) e contrasto e permette anche la visualizzazione di proteine debolmente espresse come Bit61. Un ulteriore vantaggio di eseguire immagini TIRF sul microrganismo è che turgore in queste cellule porta alle membrane plasmatiche piane, e minimizza gli effetti topologiche in segnali TIRF.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Max Planck Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
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