Summary
Total indre refleksion Fluorescens (TIRF) mikroskopi er en kraftfuld fremgangsmåde til at observere strukturer tæt på celleoverfladen ved høj kontrast og tidsmæssig opløsning. Vi viser, hvordan TIRF kan anvendes til at studere protein dynamik ved cortex af cellevæg-lukkede bakterielle og fungale celler.
Abstract
TIRF mikroskopi har vist sig som en stærk imaging-teknologi til at studere spatio-temporale dynamik i fluorescerende molekyler in vitro og i levende celler 1. Det optiske fænomen af total indre refleksion finder sted, når lys passerer fra et medium med højt brydningsindeks til et medium med lavt brydningsindeks i en vinkel større end en karakteristisk kritisk vinkel (dvs. tættere på at være parallel med grænsen). Selv om alle lys reflekteres tilbage under sådanne forhold, er en kortvarig bølge skabt, udbreder på tværs og langs grænsen, der henfalder eksponentielt med afstanden, og kun trænger prøve områder, der er 100-200 nm nær grænsefladen 2. Ud over at tilvejebringe fremragende aksial opløsning, skaber den reducerede excitation af ude af fokus fluoroforer meget højt signal-støj-forhold og minimerer skadelige virkninger af fotoblegning 2,3. Være en widefield teknik, TIRF også mulighed for hurtigere billedbehandling acKøbet end de fleste scanning baserede konfokal opsætninger.
Ved første øjekast synes lav dækningsgrad dybde TIRF at være uforenelig med scanning af bakterie-og svampe celler, der ofte omgivet af tykke cellevægge. Tværtimod har det vist sig, at cellevæggene af gær-og bakterieceller faktisk forbedre anvendeligheden af TIRF og øge antallet af observerbare strukturer 4-8. Mange cellulære processer kan derfor direkte adgang TIRF i små encellede mikroorganismer, som ofte giver stærke genetiske manipuleringsteknikker. Det giver os mulighed for at udføre in vivo biokemiske forsøg, hvor kinetikken af protein interaktioner og aktiviteter, der direkte kan vurderes i levende celler.
Vi beskriver her de enkelte trin er nødvendige for at opnå en høj kvalitet TIRF billeder i Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi gør opmærksom på forskellige problemer, der kan affect TIRF visualisering af fluorescerende prober i celler og illustrerer proceduren med flere eksempler på anvendelser. Endelig har vi vise, hvordan TIRF billeder kan forbedres yderligere ved anvendelse af etablerede billede restaurering teknikker.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Forberedelse dækglas
Dækglas skal renses støvpartikler, som TIRF er følsom overfor baggrundssignaler som følge af dækglasset (fig. 1A, film 1).- Ved hjælp af tænger sted dækglas i en keramisk holder med låg.
- Fylde glasbeholder med 1 M NaOH (kan genbruges flere gange).
- Inkuber i 2 timer under langsom kontinuerlig rotation (orbitalryster). Overdreven inkubation (> 8 h) vil skabe uigennemsigtige dækglas.
- Vaskes to gange med destilleret vand i 5 minutter under langsom kontinuerlig rotation.
- Opbevares i keramisk holder dækket i 100% ethanol.
- Fremstilling Bacillus subtilis-celler
- Fortyndes til en OD600 på 0,01 - 0,05 i 5 ml af passende vækstmedie og vokse til eksponentielle fase (OD600 på 0,3-0,7).
- Forberede 1,25% agarose i vand eller medium. Anvende syntetiske medier for at reducere baggrundsfluorescens. Opløs pulver i en 1,5 ml plastrør ved 95 ° C og opbevares i varmeblok ved 72 ° C.
- Tilføj en lille dråbe af agarose til midten af et dias, og tryk ind i en flad pude med et andet dias. Adskil forsigtigt dias efter mindst 2 minutter eller før brug.
- Vågeblus 500 ul celler i mikro-centrifuge ved 12.000 rpm i 1 min.
- Bortkast supernatanten og resuspender pelleten i 50 pi medium.
- Tilsættes 2-4 ul celler til midten af agarose puden.
- Tag en renset tildækningsslip fra ethanol fyldt beholderen med pincet, tør med trykluft og anbring forsigtigt på prøve.
- Lad celler nøjes mindst 2 minutter før mikroskopi.
- Forsegl kanter dækglas med VALAP (vaseline, lanolin og paraffin, blandet med lige vægt under varme, anvendes med lille børste eller spyttedeUla) til langvarig billeddannelse.
- Fremstilling Saccharomyces cerevisiae-celler
- Fortyndes præ-kultur og vokse i passende medier for mindst 5 timer til eksponentiel fase (OD600 0,2-0,8).
- Tag et dækglas fra beholderen med pincet og tørre med trykluft.
- Spredes 5 ul Concanavalin A opløsning (ConA, 2 ug / ml i destilleret vand) på dækglas med en pipette og tør med komprimeret luft. ConA binder til carbohydrater af gærcellevæggen og immobiliserer gærceller.
- Overfør 4,5 ul gær celle suspension til den ene side af ConA-overtrukne dækglas. Placer forsigtigt låget slip på objektglas. Starte med en kant, så falde langsomt for at undgå dannelse af luftbobler.
- Lad celler nøjes mindst 2 minutter før mikroskopi.
- Seal kanter dækglas med VALAP (se ovenfor) for langsigtet billeddannelse.
- Microscope opsætning
Vi har udført alle forsøg på en tilpasset TIRF setup baseret på et fuldt automatiseret iMic fod (Till Photonics) med en Olympus 100x 1,45 NA mål. 75 mW DPSS lasere ved 488 nm (Coherent Sapphire) og 561 nm (Cobolt Jive) blev anvendt som lyskilder. Lasere blev udvalgt gennem en AOTF og ledes gennem en bredbåndsforbindelse fiber til iMic. En galvanometer-drevet to-aksen scanner hoved blev brugt til at justere indfaldsvinkler eller fluorescens Recovery efter Fotoblegning (FRAP) position. En yderligere galvanometer blev anvendt til at skifte mellem epifluorescens, FRAP og TIRF. Billeder blev opsamlet med en Andor iXON DU-897 EMCCD kamera og en 2x forstørrelse linse foran kameraet. Anskaffelse blev kontrolleret af Live Acquisition (Till Photonics) softwarepakke.
Følgende punkter bør overvejes:- Programmerbar kontrol over lyskilde (laser lIne) og TIRF vinkel er afgørende for reproducerbare resultater, og især for multi-farve TIRF, hvor indfaldsvinkler skal justeres for hvert excitation bølgelængde for at sikre lige indtrængning af flygtige bølger. I vores setup TIRF vinklen kan justeres øjeblikkeligt via to galvanometre, der kontrolleres direkte fra Live Overtagelsen softwarepakke.
- Vores skræddersyet setup desuden gør det muligt hurtigt skift mellem epifluorescens, TIRF og FRAP via tredjedel galvanometer, så simpel måling af lokaliserings-kinetik for objekter spores i TIRF.
- Formålet-type TIRF kræver høje numeriske åbninger NA> 1,4. Vi brugte en Olympus 100x NA 1,45 mål.
- EMMCD kameraer fungerer meget godt med TIRF grund af deres høje signal-støj-forholdet. For at muliggøre billeddannelse med optimal følsomhed har vi brugt en 512x512 pixel tilbage belyst EMCCD kamera med en pixelstørrelse på 16 um. For at bevare maksimal opløsning vi placeret en 2x MAGNverifikationsprogrammet linse foran kameraet.
- Som TIRF er en widefield teknik, intensiteten af laserstråler er spredt ud. Stærke lasere derfor ofte forbedre billeddannelse. Vi anvendte 75 mW diode pumpes faststof (DPSS) lasere ved 488 nm og 561 nm.
- For at holde cellerne under optimale vækstbetingelser under billedbehandling at anvende de relevante miljøkontrol. Vi anvendte en skræddersyet varmekammer (fig. 1B) til at undersøge gær temperaturfølsomme mutanter. For mellemstore udveksling i købet har vi enten brugt simple strømningskamre eller glas-bund kultur retter, der kan let tilgængelige fra oven omvendt mikroskop.
- Justering af parametre
- Identificere placering af celler ved hjælp af lys feltbelysning. Røde LED er særligt gode som de ikke inducere signifikant billede skade.
- Skift til laser belysning og vælge passende lasere og filter kombinationer til at hidse fluoroforerne afvalg. Sørg for, at TIRF vinklen er underkritiske, eller vil du ikke være i stand til at opdage ethvert signal som følge af GFP-fusionsproteinerne. Hvis der er tvivl indstillet TIRF vinkel til 0 ° til opnåelse af en vinkelret laserstråle. Finde den øverste del af cellen (side af cellen vendende dækglasset). Ændre indfaldsvinklen af laserstrålen, indtil signalerne forsvinder langsomt forøge vinklen indtil det punkt, hvor fluorescens på celleoverfladen igen (film 2). Justere z-fokus igen for optimal position på overfladen. Acceptable TIRF vinkler skabe nogen sløret halogen ved kanten af cellen (fig. 1C). Hvis betydelig fotoblegning opstår under opsætningen, gemme TIRF vinkel og flytte til en ubleget etape stilling før overtagelsen.
- Justere laser intensiteter og kameraet forstærkning for at maksimere dynamikområde (højt signal-støj-forhold uden at mætte pixels). Typisk EMCCD kameraer er optimale til at påvise meget lave signaler ved høje signallstøj rotteIos. For stærkere signaler almindelige CCD-kameraer producerer mindre støj og tilbyde et bredere dynamikområde.
- TIRF mikroskopi er meget følsom overfor små højdeforskelle af dækglasset, hvilket resulterer i kun få celler, som kan afbildes samtidigt (Fig. 1D). For små celler opnåelse region (område af interesse, ROI) kan derfor ofte reduceres til et underområde indeholdende genstanden foretrukne. Dette reducerer også den nødvendige tid til at overføre data fra chippen til harddisken, ofte det hastighedsbegrænsende trin ved høje frame rates.
- For dobbelt farve TIRF eksperimenter sørge for at minimere bløder igennem af fluoroforer. For RFP / GFP par bruge separate emissions-filtre som RFP svagt begejstret ved 488 nm lys (Fig. 2A). De fleste filtre er ikke perfekt på linie med hinanden. Filtrere offset kan korrigeres ved anvendelse af fluorescerende perler blandet med cellerne. For at opnå sammenlignelige indtrængningsdybde, justere TIRF vinkler separat for hver laser linje. En typisk arbejdsgang er illustreret i fig. 2B.
- En kritisk parameter påvirker billedkvaliteten er laser opretning og en ren objektiv. Hvis du vil justere laseren, først fokus på z-position anvendes til TIRF billeddannelse. Derefter fjerne prøven og rense det formål al olie (residual olie vil føre til diffraktion af laserlyset og prikker i bjælken profil). Projekt laseren på loftet i TIRF tilstand og kalibrere 0 ° position, således at laseren er i en lige linje med målet (brug henvisning spot, altid bære laser beskyttelsesbriller og undgå alle refleksioner i strålegangen). Fokusere laserpletten på en minimal størrelse. Vores setup giver en bevægelig linse placeret mellem galvos og mikroskop for at lette hurtig kalibrering. Efter optimal justering, skal laseren profil danner et godt definere sted med nogenlunde rund form. Udfør kalibrering før hver session for at opnå optimal billedkvalitet.
3. Repræsentative resultater
- Fordelingen af actin homologer og cellevægskomponenter enzymer i Bacillus subtilis. Vi afbildes celler, der udtrykker GFP-fusioner af actin homolog MBL eller transpeptidase PbpH ved TIRF og regelmæssig epifluorescens. Indtrængningsdybden i TIRF er tydeligt reduceret, og er begrænset til overfladen, der vender mod dækglas (fig. 3A, B). Den svagt udtrykte transpeptidase PbpH lokaliseres til kortikale patches, der er næsten ikke synlig ved epifluorescens, men klart kan skelnes ved TIRF (fig. 3B). Den reducerede penetration kan bedst observeres for PbpHGFP signal ved septa, der vises som linjer i epifluorescens, men som prikker i TIRF (Fig. 3B, pil).
- Proteindomæner i gær plasmamembranen Eksempler til netværk-lignende mønstre dannet ved plasmamembran proteiner i gær er allerede angivet i fig. 1C og2. Ud over den bedre kontrast i TIRF der tillader klar skelnen af disse net-lignende mønstre, kan svage signaler undertiden blive detekteret udelukkende TIRF mikroskopi. Som eksempel afbildes vi en GFP-fusion af TORC2 komplekset komponent Bit61 fra Saccharomyces cerevisiae. Dette protein er svagt udtrykkes og danner små kortikale pletter med kun få protein kopier pr patch 9. I epifluorescens kun få pletter er synlig over stærk baggrund, mens plastre kan afbildes med meget godt signal-støj-forholdet i TIRF (fig. 3C). Derfor TIRF er særlig velegnet til at studere svagt fluorescerende strukturer og proteiner på celleoverfladen. Den høje aksiale opløsning, som TIRF allerede reducerer baggrundsfluorescens. Yderligere forbedring af billedets kontrast kan opnås ved hjælp af forskellige billeder bearbejdningstrin. En simpel standard teknik er lokal baggrund udligning et sløret billede subtraheres fraoriginal. Sløring kan udføres med en række lavpasfiltre herunder median eller gaussisk filtre (fig. 3D). Lokal baggrundssubtraktion fjerner støj og skærper højintensitets strukturer. Men dette kommer ofte på bekostning af et tab af fine strukturer og overdreven forstærkning af høj intensitet regioner (Fig. 3D, pil). En overlegen procedure er 2D dekonvolvering, som kan udføres med gratis eller kommercielt tilgængelige softwarepakker såsom ImageJ, Matlab eller Huygens (Scientific Volume Imaging bv). TIRF billeder giver meget god aksial opløsning, og derfor en næsten to-dimensionel punktspredningsfunktionen (PSF). Vi eksperimentelt bestemt denne PSF ved at erhverve billeder af 40 nm fluorescerende perler med de samme indstillinger, der blev brugt til den egentlige billedbehandling (mål, kamera, excitation og emission bølgelængde) Den eksperimentelle polyesterfibre blev derefter brugt til udfoldning med en klassisk maksimum likelihood algoritme i Huygens. Tidbortfalder film af GFPRas2 eller Fet3GFP og Pma1RFP (Film 3 og 4) viser en forøgelse af kontrasten efter udfoldning. I dobbelte farvebilleder er det vigtigt at maksimere kontrast, for at kunne kvantificere colokalisering værdier (Movie 4).
- Analyse af protein omsætning ved cellen cortex. TIRF og FRAP giver en kraftig kombinationsvirkning til undersøgelse af dynamikken i corticale proteiner. For at give en effektiv udnyttelse af disse teknikker er hurtig kontrol af laser vinkler og positioner påkrævet. I TIRF, et bredt område teknik, skal laseren at være fokuseret på bagsiden brændplanet og skal følge en flad indfaldsvinklen for at opnå den ønskede refleksion. I modsætning hertil kræver FRAP laseren skal fokuseres direkte på prøven og placeres med høj rumlig nøjagtighed for at tillade blegning af definerede strukturer eller regioner. Opsætningen fra Till Photonics vi har brugt i vores eksperimenter giver meget hurtig og intuitiv kontrol over thEse parametre. To galvanometer-kontrollerede spejle anvendes til at justere FRAP position i X, Y eller for at indstille indfaldsvinklen i TIRF. En tredje spejl bruges til at skifte mellem forskellige strålebaner for TIRF og FRAP belysning (laseren er udvidet med ekstra linser i TIRF sti). Alle indstillinger styres af LA (live erhvervelse) software og kalibreringer kan hurtigt udføres for hvert forsøg på at opnå optimale betingelser. Denne software giver også mulighed for definition af blegemiddel positioner under billedet erhvervelse, der er afgørende for FRAP forsøg på bevægelige konstruktioner.
Ved hjælp af denne funktion kan vi udelukker treadmilling MBL filamenter som kilde for den observerede motilitet af MBL-holdige plastre (fig. 3E). Denne observation motiverede vores søgning efter alternative motilitets mekanismer, og endelig resulterede i vores identifikation af en helt uventet type motilitet, hvor intracellulære protein-komplekser (herunder MBL) bevæges gennem aktiviteTy af cellevæg-syntetiserende enzymer, der er bosiddende på ydersiden af cellen 4. På en lignende måde var vi i stand til at observere de langsomme omlejringer i gær plasma membranproteiner, som fordeles i netværket-lignende domæner, der dækker hele celleoverfladen (fig. 3F).
Disse eksempler illustrerer, hvordan den dynamik og mønsterdannelse af kortikale proteiner kan direkte vurderes ved at kombinere TIRF og FRAP teknikker.
4. Repræsentative resultater
Figur 1. Justering parametre. A. Dirty vs rengøres samarbejdeverslip. Baggrundssignal følge af støv på dækglasset interfererer med et potentiale GFP / RFP signal, renses dækglas har mindre baggrund. B. skræddersyet elektrisk opvarmning styreenhed viser indstillet temperatur (a), temperatur-probe (b) og prøveholderen (c) . C. Gær protein Pma1GFP afbildet med faldende hyppighed vinkler (fra øverst venstre til nederst til højre). Billederne viser et pludseligt tab af signal ved den kritiske vinkel og progressivt fald i strukturel information og signal-støjforholdet. D. Uensartet synsfelt. En tæt suspension af fluorescerende perler afbildes, viser, at kun en del af synsfeltet, er i fokus. Målestoksforhold i A, B: 2 um, i C: 10 um.
Figur 2. Dobbelt farvebilleder. A. bløder igennem af Pil1RFP. Pil1RFP er begejstretmed 488 nm og en 561 nm laser og fluorescens registreres med en dobbelt båndpasfilter. Signal Pil1RFP er svagt synligt i GFP kanalen. Målestokken 2 um B. Typiske foranstaltninger for at undgå gennemblødning i dobbelt farvebilledbehandlingsområdet. Efter billeddannelse af cellerne med forskellige filtersæt, er de udfoldede og tilpasset (under anvendelse af fluorescerende perler), før de fusioneres til analyse.
Figur 3. Repræsentative resultater. A. Sammenligning af GFPMbl distribution i B. subtilis med TIRF eller regelmæssig epifluorescens (EPI) mikroskopi. Blå: Cell grænsen fra lyse felt billede. Billeder repræsentere gennemsnitlige fremskrivninger af en tidsserie for at angive det område, der er dækket af bevægelige MreB pletter overvåges med forskellige billedbehandlingstyper. B. Forbedret aksial opløsning og kontrast TIRF billedes hensyn til transpeptidase PbpHGFP i B. subtilis. Pile viser septal farvning, der vises som ring i epifluorescens og som pletter i TIRF. Eksponering tid:. 100 ms C. Sammenligning mellem epifluorescens og TIRF belysning af TOR komplekse komponent Bit61 i S cerevisiae.. Bit61 meget svagt udtrykt 9. Eksponering tid: 250 ms D. Sammenligning af forskellige billed forarbejdningsmetoder.. Række viser rå TIRF billede af Pma1GFP, subtraktion af gaussisk eller medianen slørede billeder, såvel som dekonvolution anvendelse af maksimum algoritmen i Huygens. E. TIRF-FRAP af en enkelt GFPMbl plaster (ovenfor asterisk) bevæger sig på tværs en B. subtilis celle. Den kymograph af den ikke-udvinding plaster og intensiteten profil langs kymograph (punkteret linie) bestemmelse ud treadmilling som kilde bevægelse. F. TIRF-FRAP en gærcelle udtrykker Pma1GFP. Bemærk den diffusive lukning afhul i det kortikale farvningsmønster. Målestoksforhold: 2 um. Tid i sekunder.
Movie 1. Movie viser B. subtilis-celler udtrykker en RFP fusionsprotein på en snavset dækglas. Bemærk, at RFP signal næppe kan skelnes fra baggrundsstøj. Cyklus tid 100 ms. Klik her for at se filmen .
Movie 2. Movie af Pma1GFP med forskellige indfaldsvinkler. Vinklen ændres fra underkritisk til kritiske vinkel, indtil signalet er tabt. Bemærk, ved underkritisk vinkel interne signal er synligt, hvilket støjende billeder indtil kritiske vinkel lige proteinet ved PM er synlig. Cyklus tid 200 ms. Målestok: 2 um. Klik her for at se filmen .
Film 3. Film af gær GFPRas2, der viser skifIng RAW og udfoldede TIRF billeder. GFPRas2 er en hurtig bevægelse protein (T1 / 2 af 2S-offentliggjorte data), hurtig opnåelse gange er vigtigt at løse den dynamiske opførsel. Cyklus tid 150 ms. Målestok: 2 um. Klik her for at se filmen .
Movie 4. Dobbelt farve film af gær proteiner Fet3GFP og Pma1RFP. Første 10 frames repræsenterer RAW-billeder, og det sidste billede er udfoldede. Denne film viser betydningen af billedbehandling til colokalisering analyse. De slørede RAW-billeder er blevet skærpet, hvilket gør en analyse mulig. Cyklustid 5 sek. Målestok: 2 um. Klik her for at se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIRF mikroskopi er den teknik, valg til billede perifere proteiner. Den lave indtrængningsdybden af udklingende felt minimerer ude af fokus lys, hvilket fører til et meget godt signal-støj-forholdet og tillader dataopsamling med høje rammehastigheder eller billeddannende meget svagt udtrykte proteiner. Kombinationen af høj kontrast og høj frame rates gør TIRF mikroskopi et perfekt værktøj til billedbehandling spatio-temporale dynamik cortically lokaliserede proteiner. Interessant den tykke cellevægge omgiver mange mikroorganismer som ikke hindrer billeddannelse af perifere proteiner ved TIRF. Faktisk meget sandsynligt faktiske produktion af udklingende forekommer ved grænsefladen mellem cellevæggen og plasmamembran 5,10. Refleksion af lys, der forlader cellen kan endog føre til spredning af lys langs cellevæggen, hvilket kan forklare det store overfladeareal, der kan afbildes i gærceller 8.
For at opnå optimal kvalitet af TIRF IMaldre, er det afgørende at have et godt kalibreret mikroskopi system. Laseren skal være fokuseret og tilpasset før hver scanning session. Dækglas skal renses (fig. 1A), og cellerne skal korrekt immobiliseret. For dobbelt farvebilledteknologier spektrale blødning gennem skal tages i betragtning eller elimineres ved anvendelse af filter sæt filtre separat udledning rækkevidde. Dette vil naturligvis komme til en pris af langsommere køb gange på grund af mekanisk filter forandring. Hurtige filter hjul eller galvanometer drevne Belysningskilderne kan omgå denne forsinkelse, hvis nødvendigt. Alternativt kan den kritiske fluorophor (RFP) anvendes på svagere udtrykte protein i et par, minimere niveauet af interferens.
På trods af den høje kontrast, indeholder billeder taget med et TIRF mikroskop betydelig støj. For at fjerne denne støj og yderligere øge kontrasten i billedet billeder kan behandles med forskellige filtrering trin. Fremgangsmåden med de bedste resultater i voreserfaring er 2D udfoldning. Dette kræver den eksperimentelle måling af PSF for hver prøve og mikroskop tilstand. Imidlertid kan dette udføres forholdsvis let og hurtigt ved hjælp af fluorescerende perler blandes i de respektive prøve. For to-farve eksperimenter disse perler kan yderligere anvendes til kanal justering.
Vi har vist fordelene ved at anvende TIRF mikroskopi til billeddannelse af kortikale proteiner i mikroorganismer. Kombination af TIRF og billedbehandling giver mulighed for erhvervelse af billeder med høj frame rates (<50 ms) og kontrast og giver også mulighed for visualisering af svagt udtrykte proteiner såsom Bit61. En yderligere fordel ved at udføre TIRF billeddannelse på mikroorganismen er der saftspændingen i disse celler fører til flade plasmamembraner, og minimerer topologiske virkninger TIRF signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af Max Planck samfundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
