Summary
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.
Abstract
TIRF-Mikroskopie hat sich als leistungsfähige Imaging-Technologie, um raum-zeitliche Dynamik der fluoreszierenden Moleküle in vitro zu untersuchen und in lebenden Zellen 1 entstanden. Die optische Erscheinung der Totalreflexion auftritt, wenn Licht von einem Medium mit hohem Brechungsindex zu einem Medium mit niedrigem Brechungsindex unter einem Winkel größer als eine charakteristische kritische Winkel (dh näher an parallelen wobei mit der Grenze). Obwohl alle Licht wird unter solchen Bedingungen widerspiegelt, wird eine abklingende Welle erzeugt, breitet sich über und entlang der Grenze, die mit Abstand exponentiell abklingt, und dringt nur Bereiche, die Probe 100-200 nm in der Nähe der Schnittstelle 2 sind. Neben der Bereitstellung überlegener axiale Auflösung, erstellt der reduzierten Anregung aus dem Fokus Fluorophore ein sehr hohes Signal-Rausch-Verhältnis und minimiert schädliche Auswirkungen von Photobleaching 2,3. Als Weitfeld-Technik, TIRF erlaubt auch schnellere Bild acErwerb als die meisten Scan-basierte konfokale Setups.
Auf den ersten Blick scheint die geringe Eindringtiefe der TIRF für unvereinbar mit Bildgebung von Zellen von Bakterien und Pilzen, die häufig mit dicken Zellwänden umgeben sind. Im Gegenteil haben wir festgestellt, dass die Zellwände von Hefe-und Bakterienzellen tatsächlich verbessern die Nutzbarkeit von TIRF und erhöhen die Reichweite von beobachtbaren Strukturen 4-8. Viele zelluläre Prozesse können somit direkt von TIRF werden in kleine, einzellige Mikroorganismen, die häufig bieten starke genetische Manipulation Techniken abgerufen. Dies ermöglicht uns, In-vivo-Experimente Biochemie, wo Kinetik von Protein-Interaktionen und Aktivitäten, die direkt in lebenden Zellen beurteilt werden durchführen können.
Wir beschreiben hier die einzelnen Schritte erforderlich, um qualitativ hochwertige Bilder für TIRF Saccharomyces cerevisiae oder Bacillus subtilis-Zellen zu erhalten. Wir weisen darauf hin verschiedene Probleme, die kann affect TIRF Visualisierung von fluoreszierenden Sonden in Zellen und illustrieren das Verfahren mit mehreren Anwendungsbeispielen. Schließlich zeigen wir, wie TIRF Bilder weiter verbessert werden kann mit etablierten Techniken Bildrestaurierung.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Vorbereiten Deckgläser
Deckgläser sollten von Staubpartikeln gereinigt werden wie TIRF ist durch Hintergrundgeräusche Signale aus dem Deckglas (Abb. 1A, Movie 1).- Mit einer Pinzette Ort Deckgläser in einer Keramik mit Deckel.
- Füllen Glasbehälter, der mit 1 M NaOH (kann wiederverwendet werden mehrere Male).
- Inkubieren für 2 h unter langsamer kontinuierlicher Rotation (Orbitalschüttler). Übermäßige Inkubation (> 8 h) schafft undurchsichtig Deckgläser.
- Waschen zweimal mit destilliertem Wasser für 5 min unter langsamer kontinuierlicher Rotation.
- Shop in Keramikhalter abgedeckt in 100% Ethanol.
- Vorbereiten von Bacillus subtilis-Zellen
- Verdünnen, um eine OD 600 von 0,01 bis 0,05 in 5 ml geeigneten Nährmedien wachsen und zu exponentiellen Phase (OD 600 von 0,3 bis 0,7).
- Bereiten 1,25% Agarose in Wasser oder Medium. Verwenden Sie synthetische Medien, den Hintergrund zu reduzieren. Das Pulver in einem 1,5 ml Plastikröhrchen bei 95 ° C und Speicher in Heizblock bei 72 ° C.
- Fügen Sie einen kleinen Tropfen Agarose auf der Mitte einer Folie und drücken Sie in eine flache Unterlage mit einer zweiten Folie. Sorgfältig separaten Folien nach mindestens 2 min vor oder zu verwenden.
- Spin-Down 500 ul Zellen in der Mikro-Zentrifuge bei 12.000 rpm für 1 min.
- Überstand verwerfen und Pellet in 50 ul Medium.
- In 2-4 ul Zellen an die Mitte der Agarose-Pad.
- Werfen Sie einen gereinigten Deckglas aus dem Ethanol gefüllten Behälter mit einer Pinzette, mit Druckluft trocken und sorgfältig auf Probe zu stellen.
- Lassen Zellen für mindestens 2 min vor der Mikroskopie zu begleichen.
- Die Ränder des Deckglases mit VALAP (Vaseline, Lanolin und Parafin, gemischt mit gleichem Gewicht in der Wärme, mit kleinen Pinsel oder spuckteola) für die langfristige Bildgebung.
- Vorbereiten Saccharomyces cerevisiae-Zellen
- Verdünnen Sie Vorkultur und wachsen in geeigneten Medien für mindestens 5 h bis exponentiellen Phase (OD 600 von 0,2 bis 0,8).
- Nehmen Sie ein Deckglas aus dem Behälter mit einer Pinzette und mit Druckluft trocken.
- Verbreiten Sie 5 ul Concanavalin A-Lösung (ConA, 2 pg / ml in destilliertem Wasser) auf Deckgläschen mit einer Pipette und mit Druckluft trocken. ConA bindet an Kohlenhydraten der Hefezellwand und immobilisiert Hefezellen.
- Übertragen 4,5 ul Hefezelle Suspension auf einer Seite der ConA-beschichteten Deckgläschen. Setzen Sie vorsichtig Deckglas auf Objektträger. Beginnen Sie mit einem Rand und lassen Sie fallen langsam, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
- Lassen Zellen für mindestens 2 min vor der Mikroskopie zu begleichen.
- Die Ränder des Deckglases mit VALAP (siehe oben) für die langfristige Bildgebung.
- Mikroskop-Setup
Wir führten alle Versuche an einer maßgeschneiderten TIRF Setup auf einer vollautomatischen iMIC Stand (Till Photonics) mit einer Olympus 100x NA 1,45 objektive Basis. 75 mW DPSS-Laser bei 488 nm (Coherent Sapphire) und 561 nm (Cobolt Jive) wurden als Lichtquellen eingesetzt. Laser wurden durch einen AOTF ausgewählt und über einen Breitband-Faser zur iMIC. Ein Galvanometer-getriebenen Zwei-Achsen-Scanner Kopf wurde zur Einfallswinkeln oder Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Position einzustellen. Eine zusätzliche Galvanometer wurde verwendet, um zwischen Epifluoreszenz, FRAP und TIRF wechseln. Die Bilder wurden mit einem Andor Ixon DU-897 EMCCD-Kamera und ein 2-facher Vergrößerung Linse vor der Kamera gesammelt. Übernahme wurde von der Live-Akquisition (TILL Photonics) Softwarepaket gesteuert.
Die folgenden Punkte sollten beachtet werden:- Programmierbare Kontrolle über Beleuchtungsquelle (Laser-line) und TIRF-Winkel ist für reproduzierbare Ergebnisse und vor allem für Multi-Color TIRF, wo Einfallswinkeln müssen für jede Anregungswellenlänge eingestellt werden, um gleich das Eindringen von abklingenden Wellen gewährleistet werden soll. In unserem Aufbau TIRF Winkel kann sofort über zwei Galvanometer, die direkt aus dem Live-Acquisition Softwarepaket gesteuert eingestellt werden.
- Unsere maßgeschneiderten Setup zusätzlich für schnelles Umschalten zwischen Epifluoreszenz, FRAP TIRF und über eine dritte Galvanometer, so dass einfache Messung der Kinetik-Lokalisierung für Objekte in TIRF zurückzuführen.
- Objective-Typ TIRF erfordert eine hohe numerische Apertur von NA> 1.4. Wir verwendeten eine Olympus 100x NA 1,45 Ziel.
- EMMCD Kameras arbeiten sehr gut mit TIRF aufgrund ihrer hohen Signal-Rausch-Verhältnis. Zur Bildgebung mit optimaler Empfindlichkeit erlauben verwendeten wir ein 512x512 Pixel hinten beleuchtet EMCCD-Kamera mit einer Pixelgröße von 16 um. Um eine maximale Auflösung beizubehalten legten wir ein 2x magnifizierung Linse vor der Kamera.
- Als TIRF ist eine Weitfeld-Technik, Intensität der Laserstrahlen wird ausgebreitet. Starke Laser daher oft Abbildung verbessern. Wir verwendeten 75 mW diodengepumpten Festkörperlaser (DPSS) bei 488 nm und 561 nm.
- Um Zellen unter optimalen Wachstumsbedingungen während der Bildgebung zu halten, verwenden Sie geeignete umweltpolitische Steuerung. Wir verwendeten eine maßgeschneiderte Heizkammer (Abb. 1B), um Hefe temperatursensitiven Mutanten zu studieren. Für mittlere Austausch während der Akquisition haben wir entweder einfach Strömungskammern oder Glasboden-Kulturschalen, die leicht von oben auf dem inversen Mikroskop kann zugegriffen werden.
- Einstellen der Parameter
- Identifizieren Position von Zellen unter Verwendung Hellfeldbeleuchtung. Rote LEDs sind besonders gut, da sie nicht induzieren kann erhebliche Schäden Foto.
- Wechseln Sie zu Laserbeleuchtung und Auswahl geeigneter Laser und Filter-Kombinationen, um die Fluorophore anregenWahl. Stellen Sie sicher, dass die TIRF Winkel unterkritischen ist, oder Sie nicht in der Lage, jedes Signal aus GFP-Fusionsproteine zu detektieren. Im Zweifelsfall TIRF Winkel auf 0 ° eingestellt, um einen Laserstrahl senkrecht zu erhalten. Finden Sie den oberen Teil der Zelle (Seite der Zelle gegenüber dem Deckglas). Ändern Sie den Einfallswinkel des Laserstrahls, bis Signale verschwinden dann langsam steigern, bis Winkel der Stelle, wo Fluoreszenz an der Zelloberfläche erscheint wieder (Film 2). Stellen Sie erneut z-Fokus für eine optimale Position an der Oberfläche. Akzeptable TIRF Winkeln zu erstellen keine unscharfen Halogen am Rand der Zelle (1C). Wenn bedeutende Foto Bleichen tritt während des Setups, speichern Sie die TIRF-Winkel weg-und an einem ungebleichten Bühne Position vor Beginn der Akquisition.
- Stellen Intensitäten und Videoverstärkung auf Dynamikbereich (hohes Signal-Rausch-Verhältnis ohne Sättigung Pixel) zu maximieren. Typischerweise EMCCD-Kameras sind optimal auf sehr niedrige Signale bei hohem Signal-Rausch-Ratte erkennenIos. Für stärkere Signale regelmäßige CCD-Kameras produzieren weniger Lärm und bieten einen größeren Dynamikumfang.
- TIRF-Mikroskopie ist sehr empfindlich gegenüber kleinen Höhenunterschiede des Deckglases, was nur wenige Zellen, die zur gleichen Zeit (1D) abgebildet werden kann. Für kleine Zellen der Aufnahmebereich (region of interest, ROI) kann daher oft als Teilbereich mit dem Objekt der Wahl verringert werden. Dies reduziert auch die benötigte Zeit, um Daten aus dem Chip auf der Festplatte, oft der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei hohen Frame-Raten zu übertragen.
- Für Doppel-Color TIRF Experimente stellen Sie sicher, das Durchscheinen von Fluorophoren zu minimieren. Für RFP / GFP-Paare verwenden separate Emissionsfilter als RFP wird schwach von 488 nm Licht (Abb. 2A) aufgeregt. Die meisten Filter sind nicht perfekt zueinander ausgerichtet sind. Filtern Offset kann durch Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen gemischt mit Zellen korrigiert werden. Um vergleichbare Eindringtiefe zu erzielen, stellen Sie TIRF Winkel getrennt for jede Laserlinie. Ein typischer Workflow ist in Abb.. 2B.
- Ein kritischer Parameter beeinflussen die Bildqualität ist Laser-Ausrichtung und ein sauberes Ziel. Um den Laser, zunächst auf die z-Position für TIRF Bildgebung anzugleichen. Dann entfernen Sie die Probe und reinigen Sie das Ziel aller Öl (Restöl wird die Beugung des Laserlichts und Flecken, im Strahlprofil führen). Projizieren Sie den Laser an der Decke im TIRF-Modus und Kalibrierung des 0 °-Stellung, so dass der Laser in einer geraden Linie mit dem Ziel (Referenzpunkt verwenden, tragen Sie immer Laserschutzbrillen und vermeiden Sie alle Reflexionen in den Strahlengang) ist. Fokussieren Sie die Laserpunkt auf eine minimale Größe. Unsere Einrichtung bietet eine bewegliche Linse zwischen Galvos und Mikroskop positioniert, um eine schnelle Kalibrierung zu erleichtern. Nach optimaler Einstellung sollte die Laser-Profil bilden ein gut definieren Spot mit rund runde Form. Führen Sie eine Kalibrierung vor jeder Sitzung, um eine optimale Bildqualität zu erhalten.
3. Repräsentative Ergebnisse
- Verteilung von Aktin-Homologen und Zellwand Enzyme in Bacillus subtilis. Wir abgebildet Zellen, die GFP-Fusionen des Aktin-Homolog MBL oder der Transpeptidase PbpH von TIRF und regelmäßige Epifluoreszenz. Die Eindringtiefe in TIRF wird deutlich reduziert und beschränkt auf die Oberfläche, die dem Deckglas (Abb. 3a, b). Die schwach ausgeprägt Transpeptidase PbpH lokalisiert kortikalen Flecken, die kaum sichtbar durch Epifluoreszenz sind, aber eindeutig von TIRF (Abb. 3B) unterschieden werden. Die reduzierte Penetration am besten für PbpHGFP Signal an Septen, die als Linien im Auflicht, sondern als Punkte in TIRF (3B, Pfeil) angezeigt beobachtet werden.
- Protein-Domänen in der Hefe Plasmamembran. Beispiele für netzartige Muster der Plasmamembran Proteine in Hefe ausgebildet sind bereits in Fig. 1C und2. Neben der verbesserten Kontrast in TIRF die klare Unterscheidung dieser netzartige Muster ermöglicht, können schwache Signale manchmal ausschließlich durch TIRF Mikroskopie nachgewiesen werden. Als Beispiel, abgebildet wir ein GFP-Fusionsprotein der TORC2 komplexe Komponente Bit61 aus Saccharomyces cerevisiae. Dieses Protein ist schwach ausgeprägt und bildet kleine kortikale Patches Protein mit nur wenigen Kopien pro Patch-9. In Epifluoreszenz nur einige Flecken sichtbar über dem starken Hintergrund, während Patches mit sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis in TIRF (Abb. 3C) abgebildet werden können. Deshalb TIRF ist besonders gut geeignet, um schwach fluoreszierende Strukturen und Proteine an der Zelloberfläche zu studieren. Die hohe axiale Auflösung von TIRF vorausgesetzt bereits reduziert Hintergrundfluoreszenz. Zusätzliche Verbesserung der Bildkontrast kann durch verschiedene Bildverarbeitungs-Schritten erreicht werden. Eine einfache Technik ist Standard lokalen Hintergrund Entzerrung, wo sich ein unscharfes Bild von der abgezogen wirdOriginalbild. Unschärfe kann mit einer Vielzahl von Tiefpassfiltern einschließlich Median oder Gauß-Filter (Abb. 3D) durchgeführt werden. Lokale Hintergrundabzug entfernt Rauschen und schärft hoher Intensität Strukturen. Doch dies kommt oft zum Preis von einem Verlust von feinen Strukturen und übertriebene Verstärkung von hoher Intensität Regionen (Abb. 3D, Pfeil). Ein überlegenes Verfahren ist 2D Dekonvolution, die mit frei oder kommerziell verfügbare Software-Pakete wie ImageJ, Matlab oder Huygens (Scientific Volume Imaging BV) durchgeführt werden können. TIRF-Bilder liefern sehr gute axiale Auflösung und somit eine nahezu zweidimensionale Point Spread Function (PSF). Wir experimentell bestimmt diese PSF durch den Erwerb von Bildern von 40 nm fluoreszierende Kügelchen mit den gleichen Einstellungen, die für die eigentliche Bildgebung (Ziel, Kamera, Anregung und Emission Wellenlänge) verwendet wurden die experimentellen PSF wurde dann für Dekonvolution mit einem klassischen Maximum-Likelihood-Algorithmus verwendet, in Huygens. ZeitFilme von GFPRas2 verfallen oder von Fet3GFP und Pma1RFP (Filme 3 und 4) zeigen die Erhöhung des Kontrastes nach Entfaltung. Bei zwei Farbbilder ist es wichtig, um den Kontrast zu maximieren, um in der Lage, Kolokalisation Werte (Film 4) zu quantifizieren.
- Analyse von Protein-Turnover in der Zelle Kortex. TIRF FRAP und bieten eine leistungsstarke Kombination für das Studium der Dynamik kortikaler Proteine. Um jedoch die effiziente Nutzung dieser Techniken zu ermöglichen, ist eine schnelle Kontrolle der Laser-Winkeln und Positionen erforderlich. In TIRF, ein weites Feld Technik muss der Laser auf der hinteren Brennebene fokussiert werden und müssen in einer flachen Einfallswinkel folgen, um die gewünschte Reflexion zu erzielen. Im Gegensatz dazu erfordert FRAP den Laser direkt auf die Probe fokussiert und positioniert werden mit hoher räumlicher Genauigkeit zu ermöglichen Bleichen von bestimmten Strukturen oder Regionen. Das Setup von TILL Photonics wir in unseren Experimenten verwendet, bietet eine sehr schnelle und intuitive Kontrolle über thESE-Parameter. Zwei Galvanometer-gesteuerte Spiegel verwendet, um die FRAP in x, y anzupassen oder den Einfallswinkel in TIRF eingestellt. Ein dritter Spiegel wird verwendet, um zwischen getrennten Strahlengänge für TIRF-Beleuchtung und FRAP (der Laser wird durch zusätzliche Linsen in der TIRF Weg verbreitert) zu wechseln. Alle Einstellungen werden von der LA (Live-Akquisition)-Software und Kalibrierungen können schnell für jedes Experiment, um optimale Bedingungen zu erreichen durchgeführt werden kontrolliert. Diese Software ermöglicht außerdem Definition der Bleiche Positionen während der Bildaufnahme, die essentiell für FRAP-Experimente auf bewegliche Strukturen ist.
Mit dieser Funktion können wir Treadmilling von MBL Filamente als Quelle für die beobachtete Motilität von MBL-Pflastern (3E) auszuschließen. Diese Beobachtung motiviert unserer Suche nach alternativen Mechanismen Motilität und schließlich in die Identifikation eines völlig unerwarteten Art der Motilität, wobei intrazelluläre Protein-Komplexe (einschließlich MBL) durch die Aktivitäten in Folge bewegt werdenty der Zellwand synthetisierende Enzyme, die sich auf der Außenseite der Zelle 4. In ähnlicher Weise konnten wir die langsame Umlagerung von Hefeplasmamembran Proteine, die in Netzwerk-ähnlichen Domänen für die gesamte Zelloberfläche (3F) zu verteilen beobachten.
Diese Beispiele zeigen, wie die Dynamik und Strukturieren der kortikalen Proteine direkt durch Kombinieren TIRF und FRAP Techniken bewertet werden.
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Einstellen der Parameter. A. Schmutzige vs gereinigt Zusammenarbeitverslip. Hintergrund-Signal aus Staub auf dem Deckglas mit einem potenziellen GFP / RFP-Signal stören, muss gereinigt Deckglas weniger Hintergrund. B. Maßgeschneidert elektrischen Heizungsregler zeigt die eingestellte Temperatur (a), Temperatur, bei der Sonde (b) und Probenhalter (c) . C. Hefe-Protein Pma1GFP mit abnehmendem Einfallswinkel (von links oben nach rechts unten) abgebildet. Bilder zeigen einen plötzlichen Verlust des Signals am kritischen Winkel und fortschreitende Abnahme der strukturellen Informationen und Signal-Rausch-Verhältnis. D. Ungleichmäßige Sichtfeld. Eine dichte Suspension von fluoreszierenden Kügelchen abgebildet wird, zeigen, dass nur ein Teil des Sichtfeldes im Fokus ist. Maßstabsbalken in A, B: 2 pm, C: 10 um.
Abbildung 2. Doppel-Farb-Imaging. A. durch von Pil1RFP bluten. Pil1RFP ist begeistertmit 488 nm und 561 nm einer Laser und Fluoreszenz wird mit einem Doppel-Bandpassfilter aufgezeichnet. Signal von Pil1RFP ist schwach sichtbar in der GFP-Kanal. Maßstab 2 &mgr; B. Typische Schritte, um das Durchscheinen in Doppel-Farb-Imaging zu vermeiden. Nach der Bebilderung werden die Zellen mit separaten Filter-Sets, werden sie entfaltet und ausgerichtet (unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen), bevor sie zur Analyse zusammengeführt.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse. A. Vergleich von GFPMbl Verteilung in B. subtilis mit TIRF oder regelmäßige Epifluoreszenz (Epi) Mikroskopie. Blau: Zellgrenze aus Hellfeldbild. Bilder repräsentieren durchschnittliche Projektionen einer Zeitreihe, um den Bereich von beweglichen MreB Patches mit unterschiedlichen Bildgebungsmodi überwacht fallen, zeigen. B. verbesserte axiale Auflösung und Kontrast des Bildes TIRFs der Transpeptidase PbpHGFP in B. genommen subtilis. Die Pfeile zeigen die septalen Färbung, die als Ring in Epifluoreszenz und als Patches in TIRF erscheint. Belichtungszeit:. 100 ms C. Vergleich zwischen Epifluoreszenz und TIRF-Beleuchtung des TOR komplexes Bauteil Bit61 in S cerevisiae.. Bit61 ist sehr schwach 9 ausgedrückt. Belichtungszeit: 250 ms D. Vergleich verschiedener Methoden der Bildverarbeitung.. Serie zeigt rohe TIRF Bild Pma1GFP, mit Abzug des Gauß-oder Median unscharfen Bildern sowie Dekonvolution die Maximum-Likelihood-Algorithmus in Huygens. E. TIRF-FRAP eines einzelnen GFPMbl Patch (oben Sternchen) bewegt über ein B. subtilis-Zelle. Die Kymographion des nicht-Gewinnung Patch und der Intensität entlang des Kymographion (gepunktete Linie) ausschließen, Treadmilling als Quelle der Bewegung. F. TIRF-FRAP einer Hefezelle exprimiert Pma1GFP. Beachten Sie die diffusive Schließen derLücke in der kortikalen Färbemuster. Maßstabsbalken: 2 um. Zeit in Sekunden.
Movie 1. Film zeigt B. subtilis-Zellen, die ein RFP-Fusionsprotein auf einem schmutzigen Deckglas. Beachten Sie, dass RFP Signal kaum zu unterscheiden von Hintergrundgeräuschen ist. Zykluszeit von 100 ms. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Movie 2. Film von Pma1GFP mit verschiedenen Einfallswinkeln. Angle wird von unterkritischen auf kritische Winkel verändert, bis das Signal verloren geht. Beachten Sie, bei subkritischen Winkel interne Signal sichtbar ist, wodurch verrauschten Bildern, bis am kritischen Winkel nur das Protein an der Uhr sichtbar ist. Zykluszeit von 200 ms. Maßstabsbalken: 2 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Movie 3. Film von Hefe GFPRas2, zeigt alternatIng. RAW und entfalteten TIRF Bilder. GFPRas2 ist eine sich schnell bewegende Protein (T1 / 2 von 2s unveröffentlichte Daten), sind schnelle Erfassung mal wichtig, das dynamische Verhalten zu beheben. Zykluszeit 150 ms. Maßstabsbalken: 2 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Movie 4. Doppel-Farbfilm von Hefe-Proteine Fet3GFP und Pma1RFP. Die ersten 10 Frames darstellen RAW-Bilder und letzten Frames werden entfaltet. Dieser Film zeigt die Bedeutung der Bildverarbeitung für Kolokalisationsanalyse. Die RAW-Bilder unscharf werden geschärft, so dass eine Analyse möglich. Zykluszeit 5 s. Maßstabsbalken: 2 um. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
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Discussion
TIRF-Mikroskopie ist die Technik der Wahl, um Bild peripheren Proteinen. Die geringe Eindringtiefe der abklingenden Feldes minimiert von außerhalb des Fokus Licht, das zu einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis führt und ermöglicht die Datenerfassung mit hoher Frame-Raten, oder Abbildung von sehr schwach exprimierte Proteine. Die Kombination aus hohem Kontrast und hoher Bildraten TIRF-Mikroskopie macht ein perfektes Werkzeug für die Abbildung raum-zeitliche Dynamik von kortikal lokalisierte Proteine. Interessanterweise ist die dicke Zellwand umgibt viele Mikroorganismen nicht behindert Bildgebung von peripheren Proteine, die von TIRF. In der Tat, die tatsächliche Erzeugung des evaneszenten sehr wahrscheinlich an der Grenzfläche zwischen Zellwand und Zellmembran 5,10. Reflexion von Licht, daß verlässt die Zelle könnte sogar zu Ausbreitung von Licht entlang der Zellwand, die die große Oberfläche, die in Hefezellen 8 abgebildet werden könnte erklären, führen könnte.
Für eine optimale Qualität der TIRF imAlter ist es wichtig, eine gut kalibrierte Mikroskopie-System haben. Der Laser sollte konzentriert und vor jeder Sitzung Bildgebung ausgerichtet werden. Deckgläser gereinigt werden (1A) und die Zellen müssen richtig immobilisiert werden. Für Doppel-Farb-Imaging spektrale Durchscheinen muss berücksichtigt werden, oder eliminiert durch Filter Sets Filter separaten Emissionsbereich. Dies wird sich natürlich um den Preis der Akquisition mal langsamer durch mechanische Filter Veränderung kommen. Schnelle Filterräder oder Galvanometer gesteuerter Lichtquellen können diese Verzögerung zu umgehen, wenn nötig. Alternativ kann die kritische Fluorophor (RFP) auf den schwächeren exprimierten Proteins in einem Paar verwendet werden, möglichst tiefen Signalinterferenz.
Trotz des hohen Kontrast, enthalten Bilder mit einer TIRF-Mikroskop aufgenommen erhebliches Rauschen. Um dieses Rauschen zu entfernen und eine weitere Erhöhung Bildkontrast Bilder können mit verschiedenen Filter-Stufen verarbeitet werden. Die Methode mit den besten Ergebnissen in unseremErfahrung ist 2D Dekonvolution. Dies erfordert die experimentelle Messung der PSF für jede Probe und Mikroskop Zustand. Dies kann jedoch relativ leicht und schnell durchgeführt werden unter Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen in den jeweiligen Probe vermischt. Für Zwei-Farben-Experimente diese Perlen können zusätzlich für Kanal Ausrichtung eingesetzt werden.
Wir haben die Vorteile der Verwendung von TIRF-Mikroskopie für die Bildgebung der kortikalen Proteine in Mikroorganismen nachgewiesen. Kombination von TIRF und Bildverarbeitung ermöglicht die Erfassung von Bildern mit hoher Bildrate (<50 ms) und den Kontrast und ermöglicht auch Visualisierung von schwach exprimierten Proteine wie Bit61. Ein zusätzlicher Vorteil der Durchführung TIRF Abbildung auf Mikroorganismus ist, dass Turgordruck in diesen Zellen führt zu flachen Plasmamembranen und minimiert topologischen Effekte TIRF Signale.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
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