Summary
השתקפות פנימית מוחלטת פלואורסצנטי (TIRF) מיקרוסקופיה היא גישה חזקה כדי לבחון מבנים סמוך לפני השטח של התא על ניגודיות גבוהה ורזולוציה הזמני. אנו מדגימים כיצד TIRF יכול להיות מועסק על מנת ללמוד על הדינמיקה חלבונים בקליפת המוח של קיר סגורים תאים תאים חיידקיים פטרייתי.
Abstract
מיקרוסקופיה TIRF התפתחה טכנולוגיית ההדמיה עוצמה ללמוד במרחב ובזמן בדינמיקה של מולקולות ניאון במבחנה בתאים חיים 1. תופעה אופטית של השתקפות פנימית מוחלטת מתרחשת כאשר האור עובר מתווך בעל מקדם שבירה גבוה לתוך בינוני עם מקדם שבירה נמוך בזווית גדולה יותר מזווית ביקורתית אופייני (כלומר קרוב יותר להיות במקביל הגבול). למרות כל האור משתקף בחזרה בתנאים כאלה, גל חולף נוצר כי תנועתו ברחבי ולאורך הגבול, אשר דועך אקספוננציאלית עם המרחק, ורק חודר אזורים מדגם כי הם 100-200 ננומטר ליד ממשק 2. בנוסף למתן החלטה צירית מעולה, עירור מופחת מתוך fluorophores מיקוד יוצר אות גבוהה מאוד יחסי רעש ממזער ההשפעות המזיקות של photobleaching 2,3. להיות טכניקה widefield, TIRF גם מאפשר תמונה AC מהר יותרquisition יותר מרוב סריקה setups confocal מבוססות.
במבט ראשון, את עומק החדירה הנמוכה של TIRF נראה עולה בקנה אחד עם הדמיה של תאים חיידקיים פטרייתי, אשר מוקף בדרך כלל על ידי קירות התא עבה. נהפוך הוא, מצאנו כי דופן התא של שמרים תאים חיידקיים למעשה לשפר את השימושיות של TIRF ולהגדיל את טווח מבנים נצפים 4-8. תהליכים תאיים רבים ולכן ניתן לגשת ישירות קטנים, תאיים, אשר לעיתים קרובות מציעים עוצמה טכניקות מניפולציה גנטית של TIRF. זה מאפשר לנו לבצע ניסויים ביוכימיה vivo, שבו קינטיקה של אינטראקציות חלבון ופעילות ניתן להעריך באופן ישיר בתאים חיים.
נתאר כאן את הצעדים הנדרשים כדי להשיג בודדים TIRF תמונות באיכות גבוהה עבור cerevisiae Saccharomyces או תאים subtilis Bacillus. אנו להצביע על בעיות שונות שיכולות affeCT TIRF ויזואליזציה של בדיקות ניאון בתאים וכן להמחיש את הליך עם דוגמאות של יישומים שונים. לבסוף, אנו מראים כיצד תמונות TIRF ניתן לשפר עוד יותר באמצעות טכניקות מבוססות שיקום התמונה.
Protocol
1. לדוגמא הכנת
- הכנת תלושי כיסוי
Coverslips יש לנקות בין חלקיקי האבק כמו TIRF רגיש אותות רקע הנובעים coverslip (איור 1 א ', סרט 1).- באמצעות מלקחיים כיסוי תלושי מקום בעריסה חרס עם מכסה.
- מילוי מיכל זכוכית עם 1 M NaOH (ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים).
- דגירה של H 2 תחת סיבוב איטי מתמשך (מסלולית שייקר). הדגירה מופרזת (> 8 ח) תיצור תלושי כיסוי אטום.
- שטפו פעמיים עם מים מזוקקים 5 דקות תחת סיבוב איטי מתמשך.
- בעל חנות קרמיקה מכוסה אתנול 100%.
- הכנת תאים subtilis בצילוס
- מדולל ל OD 600 של 0.01-0.05 ב 5 מ"ל של התקשורת צמיחה המתאימים ולצמוח לשלב מעריכי (OD 600 של 0.3-0.7).
- הכן 1.25% agarose במים או בינוני. להשתמש במדיה סינתטיים כדי להפחית את הקרינה רקע. לפזר אבקת בצינור פלסטיק 1.5 מ"ל ב 95 ° C, החנות בבלוק חימום על 72 ° C.
- הוספת טיפה קטנה של agarose לאמצע השקופית ולחץ על משטח שטוח עם שקופית 2. בזהירות שקופיות נפרדים לאחר דקות לפחות 2 או לפני השימוש.
- ספין למטה -500 תאים μl בצנטריפוגה מיקרו בסל"ד 12.000 דקות 1.
- מחק supernatant, ו resuspend גלולה במדיום 50 μl.
- להוסיף 2-4 תאים μl למרכז משטח agarose.
- קחו פיסת כיסוי לנקות ממיכל אתנול מלא מלקחיים, יבש עם אוויר דחוס ובזהירות להניח על מדגם.
- בואו תאים להסתפק דקות לפחות 2 לפני במיקרוסקופ.
- סוגרים קצוות coverslip עם VALAP (וזלין, לנולין ו Parafin, מעורב בכל משקל שווה תחת חום, החל עם מברשת קטנה או ירק אולא) הדמיה לטווח ארוך.
- הכנת תאים Saccharomyces cerevisiae
- לדלל מראש תרבות לגדול התקשורת המתאימים שעות לפחות 5 לשלב מעריכי (OD 600 0.2-0.8).
- קח coverslip ממיכל עם מלקחיים או יבשים עם אוויר דחוס.
- מורחים 5 Concanavalin μl פתרון (ConA, 2 מיקרוגרם / מ"ל מים מזוקקים) על פיסת כיסוי עם פיפטה יבשה עם אוויר דחוס. ConA נקשר פחמימות של הקיר תא שמרים שמגביל בתאי שמרים.
- העברת 4.5 ההשעיה μl תא שמרים לצד אחד של coverslip ConA מצופה. בזהירות להניח פתק כיסוי בשקופית מיקרוסקופ. התחל עם צד אחד ולתת טיפה לאט, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
- בואו תאים להסתפק דקות לפחות 2 לפני במיקרוסקופ.
- חותם בשולי coverslip עם VALAP (ראה לעיל) עבור הדמיה לטווח ארוך.
class = "jove_title"> 2. תמונה רכישה
- מיקרוסקופ ההתקנה
ביצענו את כל הניסויים על ההגדרה TIRF מותאמות אישית, המבוססות על מעמד iMIC אוטומטי לחלוטין (עד Photonics) עם המטרה 100x אולימפוס NA 1.45. 75 מגוואט DPSS לייזרים ב 488 ננומטר (ספיר קוהרנטית) ו -561 ננומטר (Cobolt Jive) שימשו כמקורות אור. לייזרים נבחרו באמצעות AOTF וביים באמצעות סיבים פס רחב iMIC. גלונומטר מונחה 2 ציר הראש הסורק היה בשימוש כדי להתאים את זוויות שכיחות או שחזור Fluorescence לאחר Photobleaching (FRAP) קבוצה. גלונומטר נוסף שימש למעבר בין epifluorescence, FRAP ו TIRF. תמונות שנאספו עם מצלמה iXon אנדור DU-897 EMCCD ואת העדשה הגדלה 2x מול המצלמה. רכישת נשלט על ידי רכישת Live (עד Photonics) חבילת תוכנה.
הנקודות הבאות יש לשקול:- השליטה על לתכנות מקור תאורה (לייזר אניine) ו TIRF זווית חיוני תוצאות לשחזור ובמיוחד רב צבע TIRF, שם זוויות שכיחות צריך להיות מותאם לכל אורך כל גל עירור כדי להבטיח חדירה שווה של גלי חלוף. בזווית שלנו TIRF ההתקנה ניתן להתאים באופן מיידי באמצעות שני galvanometers, אשר נשלטים ישירות רכישת חבילת שידורים חיים התוכנה.
- התקנה מותאמת אישית שלנו בנוסף מאפשר מעבר מהיר בין epifluorescence, TIRF ו FRAP דרך גלונומטר שלישי, המאפשר מדידה פשוטה של קינטיקה לוקליזציה עבור אובייקטים אליהם בכל TIRF.
- המטרה מסוג TIRF דורש פתחים מספריים גבוהות של NA> 1.4. השתמשנו 100x אולימפוס NA 1.45 אובייקטיבי.
- מצלמות EMMCD לעבוד טוב מאוד עם TIRF בשל האות הגבוה יחס רעש. כדי לאפשר הדמיה עם רגישות אופטימלית השתמשנו 512x512 פיקסל האחורי מואר המצלמה EMCCD עם גודל פיקסל של 16 מיקרומטר. כדי לשמור על רזולוציה מקסימלית הנחנו magn 2xification העדשה מול המצלמה.
- כמו TIRF היא טכניקה widefield, עוצמת קרני לייזר פרוש. לייזרים חזקים ולכן לעיתים קרובות לשפר את ההדמיה. היינו 75 mW דיודה שאוב מצב מוצק (DPSS) לייזרים ב 488 ננומטר ו -561 ננומטר.
- כדי לשמור על התאים בתנאים אופטימליים הצמיחה במהלך ההדמיה, השתמש שולטת סביבתיים מתאימים. היינו חדר מותאם אישית חימום עשה (איור 1 ב) ללמוד טמפרטורה שמרים מוטנטים רגישים. לחילופי בינוני במהלך הרכישה השתמשנו גם לתאי זרימה פשוטים או זכוכית התחתונה מנות תרבות שניתן לגשת אליהם בקלות על מיקרוסקופ הפוכה מלמעלה.
- התאמת הפרמטרים
- זיהוי המיקום של תאים באמצעות תאורה בשדה בהיר. נוריות אדומות טובים במיוחד כאשר הם לא לגרום נזק תמונה משמעותית.
- לעבור תאורה לייזר ובחר לייזרים המתאימים ושילובים סינון כדי להלהיב את fluorophores שלהבחירה. לוודא כי זווית TIRF הוא subcritical, אחרת לא תהיה מסוגל לזהות אותות הנובעים חלבונים GFP היתוך. במקרה של ספק להגדיר זווית TIRF ל ° 0 להשיג קרן לייזר בניצב. אתר את החלק העליון של התא (צד של התא מול coverslip). לשנות את זווית באירוע של קרן לייזר עד אותות להיעלם ואז לאט לאט להגביר את זווית עד לנקודה שבה הקרינה על פני שטח התא מופיע שוב (סרט 2). התאם Z-להתמקד שוב לתפקיד אופטימלית על פני השטח. מקובל זוויות TIRF ליצור שום הילה מטושטשת בקצה התא (איור 1 ג). אם תמונה משמעותית הלבנת מתרחשת במהלך ההתקנה, שמור את זווית TIRF ולעבור לתפקיד בשלב מולבן לפני תחילת הרכישה.
- התאם בעוצמות לייזר ולהשיג המצלמה כדי למקסם את הטווח הדינמי (האות גבוה יחס רעש בלי פיקסלים שממלאים). מצלמות EMCCD בדרך כלל הם אופטימליים כדי לזהות אותות נמוכים מאוד אות לרעש גבוה עכברושIOS. עבור אותות חזקים יותר קבועים מצלמות CCD מייצרים פחות רעש ומציעים טווח דינמי רחב יותר.
- מיקרוסקופיה TIRF רגיש מאוד בהפרש גבהים קטנות של coverslip, וכתוצאה מכך התאים ספורים בלבד, אשר ניתן הדמיה בו זמנית (איור 1D). עבור תאים קטנים באזור הרכישה (האזור של עניין, ההחזר על ההשקעה) ולכן יכול להיות לעיתים קרובות לכדי subregion המכיל את האובייקט הנבחר. זה גם מפחית את הזמן הנדרש כדי להעביר נתונים השבב על הכונן הקשיח, לעתים קרובות על תעריף הגבלת צעד מסגרת חליפין גבוה.
- צבע כפול ניסויים TIRF לוודא כדי למזער גלישה דרך של fluorophores. עבור RFP / GFP זוגות להשתמש במסננים פליטה נפרדים כמו RFP מתרגש חלושות על ידי אור 488 ננומטר (איור 2 א). רוב המסננים לא מיושרים באופן מושלם אחד עם השני. סנן לקזז ניתן לתקן באמצעות חרוזי ניאון מעורב עם תאים. כדי להשיג עומק החדירה להשוות, לשנות זוויות TIRF בנפרד FOr כל שורה לייזר. עבודה אופיינית מתוארת באיור. 2B.
- פרמטר קריטי המשפיע על איכות התמונה היא יישור לייזר אובייקטיבית ונקייה. כדי ליישר, לייזר פוקוס 1 על המיקום Z-משמש TIRF הדמיה. לאחר מכן להסיר את המדגם ולנקות את מטרת הנפט הכול (מזוט תוביל עקיפה של אור לייזר speckles בפרופיל קרן). להקרין לייזר על התקרה במצב TIRF ולכייל ° 0 מיקום כזה לייזר הוא בקו ישר עם המטרה (במקום להשתמש התייחסות, תמיד ללבוש משקפי בטיחות לייזר ולמנוע כל השתקפויות נתיב קרן). להתמקד במקום לייזר לגודל מינימלי. ההגדרה שלנו מספק העדשה ניד ממוקם בין galvos ו מיקרוסקופ כדי להקל על כיול מהיר. לאחר התאמה אופטימלית, הפרופיל לייזר צריך להקים גם להגדיר נקודה עם צורה עגולה פחות או יותר. ביצוע כיול לפני כל פגישה כדי לקבל איכות תמונה אופטימלית.
3. נציג תוצאות
- התפלגות homologues אקטין קיר אנזימים תאים subtilis Bacillus. אנחנו צילמו תאים להביע fusions GFP של homologue אקטין MBL או PbpH transpeptidase ידי TIRF ו epifluorescence קבוע. עומק החדירה של TIRF מצטמצם באופן ברור רק על פני השטח מול coverslip (איור 3 א ', ב'). PbpH transpeptidase לידי ביטוי בחולשה localizes אל קליפת המוח טלאים הנראים כמעט על ידי epifluorescence אך ניתן להבחין בבירור TIRF (איור 3 ב). החדירה מופחת ניתן לראות הכי טוב את האות PbpHGFP septa, אשר מופיעות שורות epifluorescence אלא נקודות ב TIRF (איור 3 ב, חץ).
- תחומים חלבון בקרום פלזמה שמרים. דוגמאות רשת דמויי תבניות שנוצרו על ידי חלבונים פלזמה קרום השמרים מקבלים כבר איור. 1 ג ו2. בנוסף ניגודיות משופרת TIRF המאפשר הבחנה ברורה של אלה רשת כמו דפוסים, אותות חלשים לפעמים יכול להתגלות באופן בלעדי על ידי מיקרוסקופ TIRF. לדוגמה, אנו צילמו היתוך של ה-GFP Bit61 TORC2 רכיב מורכב מ cerevisiae Saccharomyces. חלבון זה בא לידי ביטוי בחולשה ויוצר טלאים קטנים בקליפת המוח עם חלבון עותקים ספורים בלבד בכל תיקון 9. ב epifluorescence רק תיקונים מעטים נראים מעל הרקע החזק, תוך תיקונים ניתן הדמיה עם אות טובה מאוד יחס רעש ב TIRF (איור 3 ג). לכן TIRF מתאים במיוחד ללמוד מבנים ניאון בחולשה וחלבונים על פני התא. רזולוציה גבוהה צירית מסופק על ידי TIRF כבר מפחית את הקרינה רקע. שיפור נוסף לעומת זאת התמונה ניתן להשיג באמצעות צעדים שונים עיבוד תמונה. טכניקה פשוטה היא סטנדרטית השוואת רקע המקומי שבו התמונה מטושטשת ונגרעהמקורי. טשטוש יכול להתבצע עם מגוון רחב של מסננים נמוך לעבור כולל מסנני חציון או גאוס (איור 3D). מקומי רקע חיסור מסיר רעש מחדד מבנים בעוצמה גבוהה. עם זאת, זה מגיע לעתים קרובות במחיר של אובדן של מבנים עדינים הגברה מוגזמת של אזורים בעוצמה גבוהה (איור 3D, חץ). הליך מעולה הוא deconvolution 2D, אשר ניתן לבצע באמצעות חבילות תוכנה חופשית או זמינים מסחרית כגון ImageJ, Matlab או הויגנס (מדעי נפח הדמיה BV). תמונות TIRF לספק רזולוציה צירית טובה מאוד ולכן התפשטות כמעט דו מימדי נקודת הפונקציה (כוחות הביטחון הפלסטינים). אנחנו בניסוי זה נקבע על ידי כוחות הביטחון הפלסטינים לרכוש תמונות של 40 ננומטר חרוזי ניאון עם אותן הגדרות ששימשו הדמיה בפועל (, מטרת המצלמה, עירור ואת אורך גל הפליטה) כוחות הביטחון הפלסטינים ניסיוני היה אז בשימוש עם אלגוריתם הסבירות קלאסית המרבי עבור deconvolution הויגנס. זמןלשגות סרטים של GFPRas2 או Fet3GFP ו Pma1RFP סרטים (3 ו -4) מראים עליה של ניגוד לאחר deconvolution. בתמונות צבע פעמיים זה קריטי על מנת למקסם לעומת זאת, להיות מסוגל לכמת ערכים colocalization (סרט 4).
- ניתוח מחזור חלבון קליפת התא. TIRF ו FRAP מציעים שילוב רב עוצמה לחקר הדינמיקה של חלבונים בקליפת המוח. עם זאת, כדי לאפשר שימוש יעיל של שיטות אלו, השליטה המהירה של זוויות לייזר ועמדות נדרש. ב TIRF, טכניקה שדה רחב, הלייזר צריך להיות ממוקד במישור המוקד האחורי צריך לעקוב זווית השכיחות רדודה כדי להשיג את ההשתקפות הרצויה. לעומת זאת, דורש FRAP הלייזר להיות ממוקד ישירות על מדגם וממוקמים בדיוק מרחבית גבוהה כדי לאפשר הלבנה של מבנים או אזורים מוגדרים. ההגדרה עד Photonics השתמשנו בניסויים שלנו מספק שליטה מהר מאוד ואינטואיטיבי על הדרום פרמטרים. שני גלונומטר שבשליטת מראות רגילים להתאים את מיקום FRAP ב x, y או להגדיר את זווית שכיחות ב TIRF. המראה 3 משמש כדי לעבור בין נתיבים נפרדים הקורה TIRF ו FRAP תאורה (לייזר הוא הרחיב על ידי עדשות נוספות בנתיב TIRF). כל ההגדרות נשלטים על ידי תוכנת LA (רכישה חי) וכיולים יכול להתבצע במהירות על כל ניסוי כדי להשיג תנאים אופטימליים. תוכנה זו מאפשרת גם הגדרה של תפקידים אקונומיקה בזמן רכישת התמונה, שהוא חיוני עבור ניסויים FRAP על מבנים ניעתי.
באמצעות תכונה זו נוכל להוציא treadmilling של סיבים MBL כמקור עבור תנועתיות הנצפה של MBL המכילים כתמים (איור 3E). תצפית זו מוטיבציה החיפוש שלנו אחר תנועתיות מנגנונים חלופיים, והובילה בסופו של דבר הזיהוי שלנו מסוג בלתי צפוי לחלוטין של תנועתיות, שם קומפלקסים חלבונים תאיים (כולל MBL) מועברים דרך פעילויותיוty של דופן התא לסנתז אנזימים הנמצאים בצד החיצוני של התא 4. באופן דומה, הצלחנו לשמור על rearrangements איטי של פלזמה חלבונים שמרים קרום, אשר לחלק לרשת כמו תחומים המכסים את שטח פני התא כולו (איור 3 ו).
דוגמאות אלה ממחישות עד כמה הדינמיקה של חלבונים בקליפת המוח דפוסים ניתן להעריך באופן ישיר על ידי שילוב של TIRF וטכניקות FRAP.
4. נציג תוצאות
באיור 1. התאמת הפרמטרים.. Dirty לעומת לנקות שיתוףverslip. האות רקע הנובעים אבק על coverslip להפריע הפוטנציאל GFP / RFP האות, coverslip לנקות יש רקע פחות. ב מחוייט בקר חימום חשמלי מראה הטמפרטורה להגדיר (א), הטמפרטורה בדיקה (ב) ו מדגם בעל (ג) . ג חלבון Pma1GFP שמרים צילמו עם זוויות שכיחות ירידה (מלמעלה למטה משמאל לימין). תמונות להראות אובדן פתאומי של האות בזווית ביקורתית ירידה פרוגרסיבית מידע האות מבניים יחס רעש. שדה ד אחידה של תצוגה. ההשעיה צפופה של חרוזי ניאון הוא צילמו, מראה כי רק חלק בשדה הראייה היא בפוקוס. ברים היקף, B: 2 מיקרומטר, ב-C: 10 מיקרומטר.
איור 2. צבע כפול הדמיה. א לדמם דרך של Pil1RFP. Pil1RFP מתרגשעם 488 ננומטר לייזר 561 ננומטר ו הקרינה נרשם עם מסנן פס כפול לעבור. האות של Pil1RFP נראה חלש בערוץ ה-GFP. בקנה מידה 2 מיקרומטר בר צעדים ב אופייניות כדי למנוע דימום דרך בתחום ההדמיה צבע כפול. לאחר הדמיה תאים נפרדים עם מערכות סינון, הם deconvolved ומיושר (באמצעות חרוזי ניאון), בטרם מוזגה לניתוח.
איור 3. נציג תוצאות. א השוואה בין התפלגות GFPMbl ב B. subtilis באמצעות TIRF או קבוע epifluorescence (Epi) במיקרוסקופ. כחול: הגבול Cell מתוך התמונה בשדה בהיר. תמונות לייצג את התחזיות בממוצע של סדרת זמן כדי לציין את האזור מכוסה כתמים MreB ניעתי פיקוח עם מצבי הדמיה שונים. ב שיפור רזולוציה צירית והחדות של התמונה TIRFזה לקח של PbpHGFP transpeptidase ב ב ' subtilis. חצים מצביעים מכתים במחיצה שמופיע כמו הטבעת epifluorescence ו ככתמים ב TIRF. זמן חשיפה:. 100 ms השוואה בין ג epifluorescence ואת התאורה TIRF של Bit61 מרכיב TOR מורכב cerevisiae S.. Bit61 בא לידי ביטוי בחולשה מאוד 9. זמן חשיפה: 250 ms השוואה ד של שיטות עיבוד תמונה שונות.. הסדרה מראה תמונה TIRF הגלם של Pma1GFP, חיסור של גאוס או תמונות מטושטשות חציון, וכן deconvolution באמצעות אלגוריתם הסיכוי המרבי הויגנס. ה-TIRF FRAP של תיקון GFPMbl אחד (מעל כוכבית) נעה על פני ב ' subtilis סלולריים. רשם גלים של תיקון לא מתאוששת פרופיל עוצמת יחד רשם גלים (קו מקווקו) לשלול treadmilling כמקור התנועה. פ TIRF-FRAP של תא שמרים להביע Pma1GFP. הערה סגירת מתרחב שלהפער דפוס מכתים קליפת המוח. בקנה מידה ברים: 2 מיקרומטר. הזמן בשניות.
סרט 1. סרט המציג ב תאים subtilis ביטוי החלבון היתוך RFP על coverslip מלוכלך. שים לב, האות RFP הוא בקושי להבחין בין רעש רקע. זמן המחזור 100 אלפיות שנייה. לחצו כאן לצפייה בסרט .
סרט 2. סרט של Pma1GFP עם זוויות שכיחות שונות. זווית משתנה בין subcritical לזווית הקריטית, עד האות הולך לאיבוד. שימו לב, על פי אות subcritical זווית פנימית גלוי, גורמת תמונות רועשות עד בזווית קריטית רק חלבון בשעה גלוי. זמן מחזור 200 אלפיות שנייה. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בסרט .
סרט 3. סרט של שמרים GFPRas2, מראה alternatלאינג TIRF תמונות RAW ו deconvolved. GFPRas2 הוא חלבון נע במהירות (T1 / 2 של נתונים שלא פורסמו 2s), פעמים רכישת מהר חשובים כדי לפתור את התנהגות דינמית. זמן המחזור 150 אלפיות שנייה. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בסרט .
סרט 4. הסרט צבע כפולה של חלבונים שמרים Fet3GFP ו Pma1RFP. הראשון 10 פריימים מייצגים תמונות RAW ו מסגרות האחרונות הם deconvolved. סרט זה מראה את החשיבות של עיבוד תמונה לניתוח colocalization. התמונות מטושטשות הגלם להיות מחודד, ביצוע ניתוח אפשרי. מחזור 5 של זמן. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר. לחצו כאן לצפייה בסרט .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מיקרוסקופיה TIRF היא הטכניקה של בחירה לחלבונים תמונה הפריפריה. עומק החדירה הנמוך של תחום חלוף ממזער את האור של המוקד, אשר מוביל אות טובה מאוד יחס רעש ומאפשר רכישת נתונים עם מסגרת חליפין גבוה, או הדמיה של חלבונים ביטוי מאוד חלש. שילוב של ניגודיות גבוהה מסגרת חליפין גבוה עושה מיקרוסקופיה TIRF הכלי המושלם ביותר עבור הדמיה במרחב ובזמן הדינמיקה של חלבונים מקומיים cortically. מעניין לציין את דופן התא עבה סביב מיקרואורגניזמים רבים לא לעכב הדמיה של חלבונים הפריפריה על ידי TIRF. למעשה, הדור האמיתי של חלוף סביר מאוד מתרחשת בממשק שבין הקיר התא 5,10 פלזמה הממברנה. השתקפות של אור יוצא תא אולי אפילו להוביל התפשטות האור לאורך קיר התא, אשר עשוי להסביר את שטח פנים גדול שיכול להיות צילמו בתאי שמרים 8.
לקבלת איכות אופטימלית של TIRF imגיל חשוב שתהיה לנו מערכת מיקרוסקופיה מכויל היטב. לייזר צריך להיות ממוקד בציר לפני כל פגישה הדמיה. Coverslips יש לנקות (איור 1 א) והתאים צריך להיות משותקת כמו שצריך. עבור כפולים הדמיה דימום צבע רפאים דרך יש לקחת בחשבון או בוטלו באמצעות מסנן מסננים סטים טווח פליטה נפרד. זה כמובן בא במחיר של פעמים הרכישה איטי בשל שינוי מסנן מכני. גלגלי סינון מהיר או גורשו גלונומטר מקורות תאורה יכול לעקוף את העיכוב במידת הצורך. לחלופין, fluorophore קריטי (RFP) ניתן להשתמש חלבון לידי ביטוי חלש יותר בזוג, למזער את רמת ההפרעה האות.
למרות הניגוד גבוהה, תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ TIRF להכיל רעש משמעותי. כדי להסיר רעש נוספים תמונה להגדיל תמונות בניגוד ניתן לעבד בצעדים סינון שונות. השיטה עם התוצאות הטובות ביותר שלנוניסיון הוא deconvolution 2D. זה דורש מידה ניסיוני של כוחות הביטחון הפלסטינים למדגם כל מצב מיקרוסקופ. עם זאת, ניתן לבצע בקלות יחסית ובמהירות באמצעות חרוזי ניאון מעורב לתוך המדגם בהתאמה. עבור שני ניסויים חרוזים צבעוניים אלה יכולים לשמש בנוסף יישור הערוץ.
אנחנו הוכיחו את היתרונות של שימוש במיקרוסקופ TIRF הדמיה של חלבונים בקליפת המוח של מיקרואורגניזמים. שילוב של TIRF ותמונה עיבוד מאפשר רכישה של תמונות עם מסגרת חליפין גבוה (<50 MS) ו בניגוד וגם מאפשר הדמיה של חלבונים לידי ביטוי בחולשה כמו Bit61. יתרון נוסף של ביצוע הדמיה TIRF על מיקרואורגניזם הוא שלחץ turgor בתאים הללו גורמת ממברנות פלזמה שטוחים, וממזער השפעות טופולוגי לאותות TIRF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מקס פלאנק החברה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
- Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
- Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
- Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
- Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
- Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
- Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
- Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
- Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
