Summary
कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) संरचनाओं उच्च विपरीत और लौकिक संकल्प में कोशिका की सतह के करीब निरीक्षण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है. हम प्रदर्शन कैसे TIRF दीवार संलग्न सेल बैक्टीरियल और फंगल कोशिकाओं के प्रांतस्था में प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.
Protocol
1. नमूना तैयार करना
- कवर निकल जाता है की तैयारी
Coverslips धूल के कणों से साफ किया जाना चाहिए के रूप में TIRF पृष्ठभूमि coverslip (छवि 1 ए, मूवी 1) से उत्पन्न होने वाले संकेतों के प्रति संवेदनशील है.- ढक्कन के साथ एक चीनी मिट्टी धारक में संदंश जगह कवर निकल जाता है का उपयोग करना.
- एम 1 NaOH (कई बार reused किया जा सकता है) के साथ ग्लास कंटेनर भरें.
- धीमी गति से निरंतर रोटेशन (कक्षीय हिलनेवाला) के तहत 2 घंटे के लिए सेते हैं. अत्यधिक ऊष्मायन (8 घंटे) अपारदर्शी कवर निकल जाता है पैदा करेगा.
- आसुत जल के साथ धीमी गति से निरंतर रोटेशन के तहत 5 मिनट के लिए दो बार धो लें.
- चीनी मिट्टी के धारक में स्टोर 100% इथेनॉल में शामिल किया गया.
- बेसिलस subtilis कोशिकाओं की तैयारी
- 0.05 उचित विकास मीडिया की 5 मिलीलीटर में और घातीय चरण (0.3-0.7 की 600 ओवर ड्राफ्ट) विकसित करने के लिए 0.01 की एक 600 आयुध डिपो के लिए पतला.
- पानी या मध्यम में 1.25% agarose तैयार करते हैं. सिंथेटिक मीडिया का उपयोग करने के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम. पाउडर भंग 1.5 मिलीग्राम प्लास्टिक ट्यूब में 95 डिग्री सेल्सियस और हीटिंग ब्लॉक में दुकान 72 डिग्री सेल्सियस
- Agarose के एक छोटे से ड्रॉप करने के लिए और एक दूसरे स्लाइड के साथ एक फ्लैट पैड में स्लाइड प्रेस के बीच में जोड़ें. कम से कम 2 मिनट के बाद या पहले ध्यान से अलग स्लाइड्स का उपयोग करें.
- 1 मिनट के लिए 12.000 rpm पर 500 μl कोशिकाओं सूक्ष्म अपकेंद्रित्र में स्पिन.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 50 μl माध्यम resuspend गोली.
- Agarose पैड के बीच 2-4 μl कोशिकाओं जोड़ें.
- इथेनॉल भरा कंटेनर से साफ संदंश के साथ कवर पर्ची, दबाव हवा के साथ सूखा लो और ध्यान से नमूना पर जगह है.
- कोशिकाओं को कम से कम 2 मिनट माइक्रोस्कोपी के लिए पहले के लिए व्यवस्थित.
- Coverslip की VALAP (वेसिलीन, लानौलिन और Parafin के के, गर्मी के तहत बराबर वजन में मिश्रित के साथ किनारों को सील करने के लिए, छोटे ब्रश के साथ लागू किया जा रहा है या विवादयूला दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए).
- Saccharomyces cerevisiae कोशिकाओं की तैयारी
- पूर्व संस्कृति पतला और कम से कम 5 घंटे के लिए घातीय चरण (600 0.2-.8 ओवर ड्राफ्ट) के लिए उपयुक्त मीडिया में हो.
- संदंश और दबाव हवा के साथ सूखे के साथ कंटेनर से एक coverslip लो.
- 5 μl Concanavalin विंदुक और दबाव हवा के साथ सूखे के साथ कवर पर्ची पर एक समाधान (ConA, 2 / आसुत जल में μg मिलीलीटर) बिखरा हुआ है. ConA खमीर कोशिका दीवार के कार्बोहाइड्रेट को बांधता है और खमीर कोशिकाओं immobilizes.
- 4.5 μl खमीर सेल निलंबन coverslip ConA में लिपटे के एक तरफ करने के लिए स्थानांतरण. खुर्दबीन स्लाइड पर ध्यान से कवर पर्ची जगह है. एक बढ़त के साथ आरंभ और धीरे धीरे ड्रॉप करने के लिए हवा के बुलबुले के गठन से बचने के.
- कोशिकाओं को कम से कम 2 मिनट माइक्रोस्कोपी के लिए पहले के लिए व्यवस्थित.
- VALAP साथ coverslip की सील दीर्घकालिक इमेजिंग के लिए किनारों (ऊपर देखें).
- माइक्रोस्कोप सेटअप
हम एक स्वनिर्धारित TIRF एक ओलिंप 100x 1.45 NA उद्देश्य के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित iMIC स्टैंड (फोटोनिक्स तक) पर आधारित सेटअप पर सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया. 488 एनएम (सुसंगत नीलम) और 561 एनएम (Cobolt बक) में 75 मेगावाट DPSS लेज़रों प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया. लेजर AOTF के माध्यम से चयन किया गया था और एक ब्रॉडबैंड iMIC के फाइबर के माध्यम से निर्देशित है. एक बिजली की शक्ति नापने का यंत्र चालित स्कैनर दो अक्ष सिर घटना कोण या स्थिति Photobleaching के बाद (FRAP) प्रतिदीप्ति वसूली को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक अतिरिक्त बिजली की शक्ति नापने का यंत्र लिए epifluorescence FRAP, और TIRF के बीच स्विच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. छवियाँ एक Andor iXon ड्यू 897 EMCCD कैमरे और कैमरे के सामने एक 2x बढ़ाई लेंस के साथ एकत्र किए गए. अधिग्रहण लाइव (फोटोनिक्स डटे) सॉफ्टवेयर पैकेज अधिग्रहण के द्वारा नियंत्रित किया गया.
निम्नलिखित बातों पर विचार किया जाना चाहिए:- निर्देशयोग्य रोशनी स्रोत पर नियंत्रण (लेजर एल) ine और TIRF कोण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए और विशेष रूप से बहु - रंग TIRF, जहां घटना कोण प्रत्येक उत्तेजना तरंग लंबाई के लिए समायोजित किया जा करने के लिए क्षणभंगुर तरंगों के बराबर पहुंच सुनिश्चित करने की आवश्यकता है के लिए आवश्यक है. हमारे सेटअप TIRF कोण में दो galvanometers, जो सीधे लाइव अधिग्रहण सॉफ्टवेयर पैकेज से नियंत्रित कर रहे हैं के माध्यम से तत्काल समायोजित किया जा सकता है.
- हमारे अनुकूलित सेटअप अतिरिक्त एक तिहाई गैल्वेनोमीटर के माध्यम epifluorescence TIRF, और FRAP के बीच तेजी से स्विचन की अनुमति देता है, TIRF में पता लगाया वस्तुओं के लिए स्थानीयकरण कैनेटीक्स का सरल माप की अनुमति.
- उद्देश्य प्रकार TIRF उच्च संख्यात्मक apertures> एनए 1.4 की आवश्यकता है. हम एक ओलिंप 100x NA 1.45 उद्देश्य इस्तेमाल किया.
- EMMCD कैमरे उनके शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत के कारण TIRF के साथ बहुत अच्छी तरह से काम करते हैं. इष्टतम संवेदनशीलता के साथ इमेजिंग की अनुमति हम वापस EMCCD कैमरे प्रबुद्ध 16 माइक्रोन का एक पिक्सेल आकार के साथ एक 512x512 पिक्सेल का इस्तेमाल किया. अधिकतम संकल्प बनाए रखने के लिए हम एक 2x Magn रखा हैification लेंस कैमरे के सामने.
- के रूप में TIRF widefield तकनीक, लेजर बीम की तीव्रता है बाहर फैला हुआ है. मजबूत लेज़रों इसलिए अक्सर इमेजिंग में सुधार. हम 75 मेगावाट डायोड ठोस राज्य पंप (DPSS) 488 एनएम और 561 एनएम पर पराबैंगनीकिरण.
- इष्टतम विकास परिस्थितियों इमेजिंग के दौरान कोशिकाओं को रखने के लिए, उचित पर्यावरण नियंत्रण का उपयोग करें. हम एक कस्टम मेड हीटिंग कक्ष (छवि 1 बी) का इस्तेमाल किया खमीर तापमान संवेदनशील म्यूटेंट अध्ययन. मध्यम विनिमय के लिए अधिग्रहण के दौरान हम या तो सरल प्रवाह कक्षों या गिलास नीचे संस्कृति बर्तन का इस्तेमाल किया है कि आसानी से उलटा माइक्रोस्कोप पर ऊपर से पहुँचा जा सकता है.
- मापदंडों का समायोजन
- उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग कोशिकाओं की स्थिति को पहचानें. लाल एल ई डी विशेष रूप से अच्छा कर रहे हैं के रूप में वे महत्वपूर्ण तस्वीर क्षति प्रेरित नहीं है.
- लेजर रोशनी करने के लिए स्विच करें और उपयुक्त लेज़रों और फिल्टर संयोजन का चयन करने के लिए की fluorophores उत्तेजितपसंद. लगता है कि TIRF कोण subcritical है, तो या आप किसी भी GFP संलयन प्रोटीन से उत्पन्न होने वाले संकेत का पता लगाने में सक्षम नहीं होगा. यदि संदेह में 0 ° TIRF कोण सेट करने के लिए एक सीधा लेजर बीम प्राप्त है. सेल (coverslip की ओर का सामना करना पड़ सेल) के शीर्ष अनुभाग खोजें. लेजर बीम की घटना कोण बदल जब तक संकेत गायब हो जाते हैं तो धीरे धीरे बिंदु तक कोण में वृद्धि जहां कोशिका की सतह पुन: दिखाई देता है (2 मूवी) प्रतिदीप्ति. समायोजित सतह पर इष्टतम स्थिति z के लिए फिर से ध्यान केंद्रित. स्वीकार्य TIRF कोण सेल (छवि 1C) के किनारे पर नहीं धुंधला प्रभामंडल के बनाएँ. यदि महत्वपूर्ण विरंजन तस्वीर सेटअप के दौरान होता है, TIRF कोण को बचाने और अधिग्रहण शुरू करने से पहले एक कड़ा चरण स्थिति के लिए कदम.
- लेजर की तीव्रता और कैमरे के लिए गतिशील रेंज (saturating के पिक्सल के बिना शोर अनुपात करने के लिए उच्च संकेत) को अधिकतम लाभ को समायोजित करें. आमतौर पर EMCCD कैमरों उच्च संकेत पर बहुत कम संकेत शोर चूहा का पता लगाने के लिए इष्टतम हैंIos. मजबूत संकेतों के लिए नियमित रूप से सीसीडी कैमरों शोर का उत्पादन कम और एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान करते हैं.
- TIRF माइक्रोस्कोपी बहुत छोटे coverslip की ऊंचाई मतभेद, केवल कुछ कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप, जो एक ही समय (छवि 1D) में imaged किया जा सकता है के प्रति संवेदनशील है. छोटे कोशिकाओं के लिए अधिग्रहण क्षेत्र (ब्याज के क्षेत्र, आरओआई) इसलिए अक्सर एक युक्त उपप्रदेश पसंद की वस्तु के लिए कम किया जा सकता है. यह भी चिप से हार्ड ड्राइव पर डेटा, अक्सर दर सीमित उच्च फ्रेम दर पर कदम हस्तांतरण की जरूरत समय कम कर देता है.
- डबल रंग के लिए TIRF प्रयोगों fluorophores के माध्यम से खून कम से कम करने के लिए सुनिश्चित करें. आरएफपी / GFP के लिए जोड़े आरएफपी के रूप में अलग उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग दुर्बलता से 488 एनएम प्रकाश (2A छवि) से उत्साहित है. अधिकांश फिल्टर को पूरी तरह से एक दूसरे के साथ नहीं जुड़ रहे हैं. फ़िल्टर ऑफसेट फ्लोरोसेंट कोशिकाओं के साथ में मिश्रित मोती का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है. तुलनीय प्रवेश गहराई को प्राप्त करने के लिए, TIRF कोण के लिए अलग से समायोजितप्रत्येक लेजर लाइन आर. एक ठेठ वर्कफ़्लो छवि में सचित्र है. 2B.
- एक महत्वपूर्ण छवि गुणवत्ता को प्रभावित पैरामीटर लेजर संरेखण और एक साफ उद्देश्य है. लेजर, TIRF इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया z स्थिति पर पहले ध्यान केंद्रित संरेखित. तो नमूना हटाने और सभी तेल का उद्देश्य साफ (अवशिष्ट तेल लेजर प्रकाश और speckles के की बीम प्रोफ़ाइल में विवर्तन के लिए नेतृत्व करेंगे). TIRF मोड में छत पर लेजर परियोजना और 0 ° स्थिति ऐसी है कि लेजर उद्देश्य (संदर्भ स्थान का उपयोग करने के लिए, हमेशा लेजर सुरक्षा काले चश्मे पहनते हैं और किरण पथ में सभी प्रतिबिंब से बचने के) के साथ एक सीधी रेखा में है जांचना. एक न्यूनतम आकार के लिए लेजर हाजिर ध्यान दें. हमारी सेटअप एक जंगम लेंस galvos और माइक्रोस्कोप के बीच में तैनात करने के लिए तेजी से अंशांकन की सुविधा प्रदान करता है. इष्टतम समायोजन के बाद, लेजर प्रोफ़ाइल के रूप में एक अच्छी तरह से मोटे तौर पर गोल आकार के साथ मौके को परिभाषित करना चाहिए. हर सत्र से पहले अंशांकन प्रदर्शन करने के लिए इष्टतम छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए.
3. प्रतिनिधि परिणाम
- Actin बेसिलस subtilis में homologues कोशिका दीवार एंजाइमों का वितरण. हम कोशिकाओं imaged किया actin के सजात MBL या TIRF और नियमित epifluorescence के द्वारा transpeptidase PbpH GFP fusions व्यक्त. TIRF में प्रवेश गहराई स्पष्ट रूप से और कम coverslip का सामना करना पड़ सतह (छवि 3 ए, बी) तक ही सीमित है. कमजोर व्यक्त transpeptidase PbpH cortical पैच कि epifluorescence से शायद ही दिखाई दे रहे हैं लेकिन स्पष्ट रूप से TIRF (3B छवि) द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है localizes. कम प्रवेश septa पर PbpHGFP संकेत है, जो epifluorescence में लाइनों के रूप में लेकिन TIRF में डॉट्स (छवि 3B, तीर) के रूप में दिखाई देते हैं के लिए सबसे अच्छा देखा जा सकता है.
- खमीर प्लाज्मा झिल्ली में प्रोटीन डोमेन नेटवर्क की तरह खमीर में प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन द्वारा गठित पैटर्न के लिए उदाहरण पहले से ही छवि में दिया जाता है. 1C और2. TIRF में सुधार विपरीत है कि इन नेटवर्क की तरह पैटर्न के स्पष्ट अंतर की अनुमति देता है के अलावा, कमजोर संकेतों कभी कभी TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा विशेष रूप से कर सकते हैं पता लगाया जा. उदाहरण के रूप में, हम Saccharomyces cerevisiae से TORC2 जटिल घटक Bit61 के एक GFP संलयन के imaged. इस प्रोटीन को कमजोर और व्यक्त की है केवल कुछ पैच प्रति 9 प्रोटीन प्रतियों के साथ छोटे cortical पैच रूपों. Epifluorescence में केवल कुछ पैच मजबूत पृष्ठभूमि के ऊपर दिखाई दे रहे हैं, जबकि पैच TIRF में शोर अनुपात (छवि -3 सी) के लिए बहुत अच्छा संकेत के साथ imaged किया जा सकता है. इसलिए TIRF विशेष रूप से अच्छी तरह कोशिका की सतह पर कमजोर फ्लोरोसेंट संरचनाओं और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है. उच्च अक्षीय TIRF द्वारा प्रदान की संकल्प पहले से ही पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम कर देता है. छवि के विपरीत अतिरिक्त सुधार विभिन्न छवि प्रसंस्करण कदम के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. एक सरल मानक तकनीक स्थानीय पृष्ठभूमि समकारी जहां एक धुंधला छवि से घटाया जाता हैमूल. धुंधला मंझला या गाऊसी फिल्टर (छवि 3 डी) सहित कम से गुजारें फिल्टर की एक किस्म के साथ किया जा सकता है. स्थानीय पृष्ठभूमि घटाव शोर निकालता है और उच्च तीव्रता संरचनाओं शार्प. हालांकि, इस बार ठीक संरचनाओं और उच्च तीव्रता के क्षेत्रों की अतिरंजित प्रवर्धन (छवि 3 डी, तीर) का एक नुकसान की कीमत पर आता है. एक बेहतर प्रक्रिया 2D deconvolution, जो ImageJ, Matlab या Huygens (वैज्ञानिक माप इमेजिंग BV) के रूप में मुक्त या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल के साथ किया जा सकता है. TIRF चित्र बहुत अच्छा axial संकल्प है और इसलिए लगभग एक दो आयामी बात फैल समारोह (पीएसएफ) प्रदान करते हैं. हम प्रयोगात्मक एक ही सेटिंग है कि वास्तविक इमेजिंग (उद्देश्य, कैमरा, उत्तेजना, और उत्सर्जन तरंग लंबाई) के लिए इस्तेमाल किया गया प्रयोगात्मक पीएसएफ तो एक शास्त्रीय अधिकतम संभावना कलन विधि के साथ deconvolution के लिए इस्तेमाल किया गया था के साथ 40 एनएम फ्लोरोसेंट मोती की छवियों को प्राप्त करने के द्वारा इस पीएसएफ निर्धारित Huygens. समयचूक GFPRas2 की या Fet3GFP और Pma1RFP की फिल्में (सिनेमा 3 और 4) deconvolution के बाद इसके विपरीत की वृद्धि प्रदर्शित करता है. डबल रंग छवियों में यह करने के लिए इसके विपरीत अधिकतम करने के लिए, के लिए colocalization मूल्यों (4 मूवी) मात्रा ठहराना करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है.
- सेल प्रांतस्था में प्रोटीन कारोबार के विश्लेषण TIRF और FRAP के cortical प्रोटीन की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली संयोजन प्रदान करते हैं. हालांकि, इन तकनीकों के कुशल उपयोग की अनुमति देने के लिए, लेजर कोण और पदों की तेजी से नियंत्रण की आवश्यकता है. TIRF, एक व्यापक क्षेत्र तकनीक में, लेजर वापस फोकल हवाई जहाज़ पर ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है और एक उथले घटना कोण वांछित प्रतिबिंब को प्राप्त करने का पालन करने की जरूरत है. इसके विपरीत, FRAP लेजर सीधे नमूना पर ध्यान केंद्रित किया और उच्च स्थानिक शुद्धता के साथ तैनात परिभाषित संरचनाओं या क्षेत्रों के विरंजन की अनुमति की आवश्यकता है. फोटोनिक्स तक से सेटअप हम हमारे प्रयोगों में इस्तेमाल किया तीन वर्षों में बहुत तेजी से और सहज ज्ञान युक्त नियंत्रण प्रदान करता हैese पैरामीटर. दो गैल्वेनोमीटर नियंत्रित दर्पण एक्स, वाई में FRAP स्थिति को समायोजित या TIRF में घटना कोण सेट करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक तिहाई दर्पण TIRF FRAP और रोशनी (लेजर TIRF पथ में अतिरिक्त लेंस द्वारा चौड़ी है) के लिए अलग किरण पथ के बीच स्विच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. सभी सेटिंग्स ला (रहते अधिग्रहण) सॉफ्टवेयर और calibrations के तेजी से प्रत्येक इष्टतम स्थितियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रयोग के लिए प्रदर्शन कर सकते हैं द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. यह सॉफ्टवेयर भी छवि अधिग्रहण, जो गतिशील संरचनाओं पर FRAP प्रयोगों के लिए आवश्यक है के दौरान ब्लीच पदों की परिभाषा की अनुमति देता है.
इस सुविधा का उपयोग करने हम मनाया MBL युक्त पैच की गतिशीलता (3E छवि) के लिए स्रोत के रूप में MBL के filaments की treadmilling बाहर निकाल सकता है. इस अवलोकन वैकल्पिक गतिशीलता तंत्र के लिए हमारी खोज से प्रेरित है, और अंततः हमारी गतिशीलता, जहां intracellular प्रोटीन परिसरों (MBL सहित) गतिविधियों के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं की एक पूरी तरह से अप्रत्याशित प्रकार के पहचान के परिणामस्वरूपकोशिका दीवार के ty 4 सेल के बाहर रहने वाले एंजाइमों synthesizing के. इसी तरह फैशन में, हम खमीर प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन है, जो पूरे कोशिका की सतह को कवर डोमेन (3F छवि) की तरह नेटवर्क में वितरित की धीमी rearrangements का पालन करने में सक्षम थे.
इन उदाहरणों का वर्णन कैसे गतिशीलता और cortical प्रोटीन की patterning सीधे TIRF और FRAP तकनीक के संयोजन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
आकृति 1. मापदंडों का समायोजन. गंदा बनाम साफ सहverslip. पृष्ठभूमि संकेत coverslip पर धूल से उत्पन्न होने वाली है एक संभावित GFP / आरएफपी संकेत के साथ हस्तक्षेप करने के लिए, साफ coverslip कम पृष्ठभूमि है. बी विद्युत ताप नियंत्रक सेट तापमान दिखा रहा है (एक), जांच में तापमान (ख) और नमूना धारक (ग) कस्टम बनाया सी.. खमीर प्रोटीन Pma1GFP घटना कोण कम (ऊपर से नीचे सही करने के लिए छोड़ दिया) के साथ imaged. छवियाँ महत्वपूर्ण कोण पर एक संकेत के अचानक नुकसान और संरचनात्मक जानकारी और संकेत में शोर अनुपात करने के लिए प्रगतिशील कमी डी देखने के असमान क्षेत्र दिखा. फ्लोरोसेंट मोतियों की एक घने निलंबन imaged किया है दिखा रहा है कि देखने के क्षेत्र का सिर्फ एक हिस्सा है ध्यान में है. एक में बड़े पैमाने सलाखों, बी 2 सी में: माइक्रोन, 10 माइक्रोन.
चित्रा 2. डबल रंग इमेजिंग. Pil1RFP के माध्यम से भरो. Pil1RFP उत्साहित है488 एनएम और 561 एनएम लेजर और प्रतिदीप्ति साथ एक दोहरे बैंड पास फिल्टर के साथ दर्ज की गई है. Pil1RFP का सिग्नल कमजोर GFP चैनल में दिखाई देता है. स्केल बार 2 माइक्रोन बी विशिष्ट डबल रंग इमेजिंग में के माध्यम से खून से बचने के कदम. अलग फिल्टर सेट के साथ कोशिकाओं इमेजिंग के बाद, वे deconvolved और विश्लेषण के लिए विलय किया जा रहा से पहले गठबंधन (फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग).
चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम. ए बी में GFPMbl वितरण की तुलना करें subtilis TIRF या नियमित epifluorescence माइक्रोस्कोपी (महामारी) का उपयोग कर. ब्लू: उज्ज्वल क्षेत्र छवि से सेल सीमा. छवियाँ चलता - फिरता MreB अलग इमेजिंग मोड के साथ निगरानी पैच द्वारा कवर क्षेत्र से संकेत मिलता है एक समय की श्रृंखला के औसत अनुमानों का प्रतिनिधित्व करते हैं. बी axial संकल्प और TIRF छवि के विपरीत बेहतरएस बी में transpeptidase PbpHGFP की लिया subtilis. तीर वंशीय धुंधला कि epifluorescence में अंगूठी के रूप में और TIRF में पैच के रूप में प्रकट होता है का संकेत मिलता है. एक्सपोज़र समय: 100 एमएस epifluorescence और और टो एस cerevisiae में जटिल घटक Bit61 की TIRF रोशनी के बीच सी. तुलना करें. Bit61 बहुत कमजोर 9 व्यक्त किया है. एक्सपोज़र समय: 250 एमएस डी. अलग छवि प्रसंस्करण विधियों की तुलना करें. Pma1GFP के कच्चे TIRF छवि दिखाने श्रृंखला, गाऊसी या माध्य धुंधला, छवियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से deconvolution घटाव Huygens में अधिकतम संभावना कलन विधि का उपयोग कर ई. एक एकल GFPMbl (तारांकन ऊपर) पैच एक बी के पार जाने की TIRF FRAP. सेल subtilis. गैर - ठीक पैच और kymograph साथ तीव्रता प्रोफ़ाइल (बिंदीदार रेखा) गति के स्रोत के रूप में treadmilling बाहर शासन की kymograph एफ TIRF-FRAP एक खमीर सेल Pma1GFP व्यक्त की. नोट के वाचाल बंदcortical धुंधला पैटर्न में अंतर है. स्केल सलाखों: 2 माइक्रोन. सेकंड में समय.
1 मूवी बी दिखा मूवी. subtilis कोशिकाओं एक गंदा coverslip पर एक RFP संलयन प्रोटीन व्यक्त. ध्यान दें कि आरएफपी संकेत शायद ही पृष्ठभूमि शोर से अलग पहचाना है. चक्र 100 समय एमएस फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
2 मूवी अलग घटनाओं कोण के साथ Pma1GFP की मूवी. कोण subcritical से महत्वपूर्ण कोण बदल दिया है, जब तक संकेत खो दिया है. ध्यान दें, subcritical कोण आंतरिक संकेत पर दिखाई देता है, शोर छवियों के कारण जब तक सिर्फ बजे प्रोटीन महत्वपूर्ण कोण पर दिख रहा है. समय चक्र 200 एमएस. पैमाने पर पट्टी: 2 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
मूवी 3 GFPRas2 खमीर की मूवी, alternat दिखाआईएनजी रॉ और deconvolved TIRF छवियों. GFPRas2 एक तेजी से बढ़ प्रोटीन (/ T1 2s अप्रकाशित डेटा का 2) है, तेजी से अधिग्रहण के समय गतिशील व्यवहार को हल करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. चक्र 150 बार एमएस. पैमाने पर पट्टी: 2 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
मूवी 4 खमीर प्रोटीन Fet3GFP और Pma1RFP डबल रंग फिल्म. पहले 10 तख्ते RAW छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं और अंतिम फ्रेम deconvolved हैं. इस फिल्म colocalization विश्लेषण के लिए इमेज प्रोसेसिंग के महत्व को दर्शाता है. धुँधली RAW छवियों तेज हो जाते हैं, एक विश्लेषण संभव बनाने. समय चक्र 5 है. पैमाने पर पट्टी: 2 माइक्रोन. फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
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Discussion
TIRF माइक्रोस्कोपी छवि परिधीय प्रोटीन के लिए पसंद की तकनीक है. क्षणभंगुर क्षेत्र की कम गहराई में प्रवेश ध्यान प्रकाश है, जो शोर अनुपात करने के लिए एक बहुत अच्छा संकेत होता है और उच्च फ्रेम दर, या बहुत दुर्बलता से व्यक्त प्रोटीन इमेजिंग के साथ डाटा अधिग्रहण की अनुमति देता है बाहर के कम से कम है. उच्च विपरीत और उच्च फ्रेम दर के संयोजन TIRF माइक्रोस्कोपी इमेजिंग cortically स्थानीयकृत प्रोटीन की spatio-अस्थायी गतिशीलता के लिए एक आदर्श उपकरण बनाती है. दिलचस्प मोटी सेल दीवार कई सूक्ष्मजीवों आसपास के TIRF द्वारा परिधीय प्रोटीन की इमेजिंग में बाधा नहीं है. वास्तव में, क्षणभंगुर की वास्तविक पीढ़ी बहुत संभावना कोशिका दीवार और प्लाज्मा झिल्ली 5,10 के बीच इंटरफेस में होता है. प्रकाश बाहर निकलता है कि सेल भी कोशिका दीवार है, जो बड़े क्षेत्र की सतह की व्याख्या हो सकती है कि खमीर कोशिकाओं में 8 imaged किया जा सकता है के साथ प्रकाश के प्रचार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं का प्रतिबिंब.
TIRF im की इष्टतम गुणवत्ता के लिएउम्र के यह एक अच्छी तरह से calibrated माइक्रोस्कोपी प्रणाली के लिए महत्वपूर्ण है. लेजर और ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए प्रत्येक इमेजिंग सत्र से पहले गठबंधन. Coverslips (छवि 1A) साफ किया जाना चाहिए और कोशिकाओं को ठीक तरह से स्थिर हो. डबल रंग इमेजिंग वर्णक्रमीय खून के लिए के माध्यम से ध्यान में रखा जाना है या फिल्टर सेट फिल्टर अलग उत्सर्जन सीमा का उपयोग करके समाप्त किया है. यह स्पष्ट रूप से धीमी अधिग्रहण यांत्रिक फिल्टर परिवर्तन के कारण समय की कीमत पर आ जाएगा. तेजी से फिल्टर पहियों या बिजली की शक्ति नापने का यंत्र चालित रोशनी सूत्रों इस देरी को दरकिनार यदि आवश्यक हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, महत्वपूर्ण fluorophore (आरएफपी) एक जोड़ी में कमजोर व्यक्त प्रोटीन पर इस्तेमाल किया जा सकता है, संकेत हस्तक्षेप का स्तर कम से कम.
उच्च विपरीत के बावजूद, TIRF माइक्रोस्कोप के साथ लिया छवियों महत्वपूर्ण शोर होते हैं. इस शोर को दूर करने के लिए और आगे बढ़ाने छवि के विपरीत छवियों विभिन्न फ़िल्टरिंग कदम के साथ संसाधित किया जा सकता है. हमारे सबसे अच्छा परिणाम के साथ विधिअनुभव 2D deconvolution है. यह एक नमूना और माइक्रोस्कोप हालत के लिए पीएसएफ की प्रयोगात्मक माप की आवश्यकता है. हालांकि, यह काफी प्रदर्शन किया जा सकता है आसानी से और जल्दी से फ्लोरोसेंट संबंधित के नमूने में मिश्रित मोती का उपयोग कर. दो रंग के प्रयोगों के लिए इन मोतियों अतिरिक्त चैनल संरेखण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम TIRF माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए सूक्ष्मजीवों में cortical प्रोटीन की का उपयोग कर के लाभ का प्रदर्शन किया है. TIRF और छवि प्रसंस्करण के संयोजन उच्च फ्रेम दर (<50 एमएस) और इसके विपरीत के साथ छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है और यह भी Bit61 जैसे कमजोर व्यक्त प्रोटीन के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. सूक्ष्मजीव पर TIRF इमेजिंग प्रदर्शन के एक अतिरिक्त लाभ है कि इन कोशिकाओं में turgor दबाव फ्लैट प्लाज्मा झिल्ली की ओर जाता है, और TIRF संकेतों को सांस्थितिक प्रभाव कम से कम कि.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | UniEquip | UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER | |
| TIRF microscope | Customized setup | ||
| Glass container | Vitlab | 340-232880353 | |
| Ceramic staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | |
| Coverslips #1(18 x 18 mm) | Menzel-Glaser | BB018018A1 | |
| Microscope Slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | |
| Immersion Oil | Carl Zeiss, Inc. | Immersol 518F | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| FluoSpheres | Invitrogen | F8795 |
References
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