Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi

Published: May 1, 2012 doi: 10.3791/3982

Summary

Total Internal Reflection Fluorescens (TIRF) mikroskopi er en kraftig tilnærming å observere strukturer nær celleoverflaten ved høy kontrast og tidsmessig oppløsning. Vi viser hvordan TIRF kan brukes til å studere protein dynamikk i cortex av celleveggen lukkede bakterie og sopp celler.

Abstract

TIRF mikroskopi har dukket opp som en kraftig bildeteknologi for å studere spatio-temporale dynamikken i fluorescerende molekyler in vitro og i levende celler ett. Den optiske fenomenet total intern refleksjon oppstår når lys passerer fra et medium med høy brytningsindeks til et medium med lav brytningsindeks på skrå større enn en karakteristisk kritisk vinkel (dvs. nærmere å bli parallelt med grensen). Selv om alt lyset reflekteres tilbake under slike forhold, er en evanescent bølge opprettet som forplantar seg over og langs grensen, som henfaller eksponentielt med avstanden, og bare trenger eksempler områder som er 100-200 nm nær grensesnittet to. I tillegg til å gi overlegen aksial oppløsning, skaper redusert eksitasjon av ute av fokus fluorophores en meget høy signal til støyforholdet og minimaliserer skadevirkningene av photobleaching 2,3. Å være en widefield teknikk, gjør TIRF også raskere bilde acquisition enn de fleste skanning baserte confocal oppsett.

Ved første øyekast ser den lave inntrengningsdybde av TIRF å være uforenlig med avbildning av bakterie-og sopp celler, som ofte er omgitt av tykke cellevegger. Tvert imot har vi funnet at celleveggene i gjær og bakterieceller faktisk forbedre brukbarheten av TIRF og øke omfanget av observerbare strukturer 4-8. Mange cellulære prosesser kan derfor få direkte tilgang ved TIRF i små, encellede mikroorganismer, som ofte tilbyr kraftige genetisk manipulering teknikker. Dette gir oss muligheten til å utføre in vivo biokjemi eksperimenter, der kinetikk protein interaksjoner og aktiviteter kan være direkte vurderes i levende celler.

Vi beskriver her de enkelte trinnene som kreves for å oppnå høy kvalitet TIRF bilder for Saccharomyces cerevisiae eller Bacillus subtilis celler. Vi peker ut ulike problemer som kan Affect TIRF visualisering av fluorescerende prober i celler og illustrere prosedyren med flere bruksområder. Til slutt viser vi hvordan TIRF bilder kan bli ytterligere forbedret ved hjelp av etablerte image restaurering teknikker.

Protocol

1. Prøvepreparering

  1. Forbereder dekker slips
    Dekkglass bør renses fra støvpartikler som TIRF er følsom for bakgrunnen signaler som følger av dekkglass (Fig. 1A, Movie 1).
    1. Bruk pinsett Sett dekslet slips i en keramisk holder med lokk.
    2. Fyll glassbeholder med en M NaOH (kan gjenbrukes flere ganger).
    3. Inkuber i 2 t etter treg kontinuerlig rotasjon (orbital shaker). Overdreven inkubasjon (> 8 timer) vil skape ugjennomsiktig dekke slips.
    4. Vask to ganger med destillert vann i 5 min etter treg kontinuerlig rotasjon.
    5. Oppbevares i keramisk holder dekket i 100% etanol.
  2. Forbereder Bacillus subtilis celler
    1. Fortynn til en OD 600 av 0,01 til 0,05 i 5 ml av egnede vekstmedier og vokse til eksponensielle fase (OD 600 av 0.3 til 0.7).
    2. Forbered 1,25% agarose i vann eller medium. Bruk syntetiske medier for å redusere bakgrunnsfluorescens. Løs opp pulveret i en 1,5 ml plastrør ved 95 ° C og oppbevar i oppvarming blokk ved 72 ° C.
    3. Legg en liten dråpe agarose til midten av et lysbilde og trykk inn i en flat pad med en andre lysbilde. Nøye separate lysbilder etter minst 2 min eller før bruk.
    4. Spinn ned 500 mL celler i mikro sentrifuger ved 12.000 rpm i 1 min.
    5. Kast supernatant, og resuspender pellet i 50 mL medium.
    6. Legg 2-4 mL celler til midten av agarose puten.
    7. Ta en renset dekkglass fra etanol fylt beholderen med tang, tørr med trykkluft og forsiktig plassere på prøve.
    8. La cellene betale minst 2 min før mikroskopi.
    9. Tett kantene dekkglass med VALAP (vaselin, Lanolin og Parafin, blandet med lik vekt under varme, påfør med liten børste eller spyttetUla) for langsiktig bildebehandling.
  3. Forbereder Saccharomyces cerevisiae celler
    1. Fortynn pre-kultur og vokse i egnede medier i minst 5 t til eksponensiell fase (OD 600 0,2 til 0,8).
    2. Ta en dekkglass fra beholderen med tang og tørre med trykkluft.
    3. Spre 5 mL Concanavalin En løsning (Cona, 2 mikrogram / ml i destillert vann) på dekkglass med en pipette og tørr med trykkluft. Cona binder seg til karbohydrater i gjær celleveggen og immobilizes gjærceller.
    4. Overfør 4,5 mL gjær cellesuspensjon til den ene siden av Cona-belagt dekkglass. Plasser dekkglass på objektglass. Start med en kant og la synke sakte for å unngå dannelse av luftbobler.
    5. La cellene betale minst 2 min før mikroskopi.
    6. Seal kantene dekkglass med VALAP (se ovenfor) for langsiktig bildebehandling.
  1. Microscope oppsett
    Vi utførte alle eksperimenter på en tilpasset TIRF oppsett basert på en helautomatisk iMic stativ (Till Photonics) med en Olympus 100x 1,45 NA mål. 75 MW DPSS lasere ved 488 nm (koherent Sapphire) og 561 nm (cobolt Jive) ble brukt som lyskilder. Lasere ble valgt ut gjennom en AOTF og ledet gjennom en fiber til iMic. En galvanometer-drevet to-axis skannerhodet ble brukt til å justere forekomst vinkler eller fluorescens restitusjon etter photobleaching (FRAP) posisjon. En ekstra galvanometer ble brukt til å veksle mellom epifluorescence, FRAP og TIRF. Bilder ble samlet inn med en Andor iXON DU-897 EMCCD kamera og en 2x forstørrelse linse foran kameraet. Oppkjøpet ble kontrollert av Live Acquisition (Till Photonics) programvarepakken.
    Følgende punkter bør vurderes:
    1. Programmerbar kontroll over lys kilde (laser lIne) og TIRF vinkel er avgjørende for reproduserbare resultater og spesielt for multi-farge TIRF, der forekomsten vinkler må justeres for hver eksitasjon bølgelengde for å sikre lik penetrasjon av flyktige bølger. I vår oppsettet TIRF vinkelen kan justeres øyeblikkelig via to galvanometre, som er direkte styrt fra Live Acquisition programvarepakken.
    2. Vår tilpasset oppsett tillater dessuten rask veksling mellom epifluorescence, TIRF og FRAP via et tredjeland galvanometer, slik enkel måling av lokaliseringstjenester kinetikk for objekter spores i TIRF.
    3. Objective-type TIRF krever høye numeriske åpninger i NA> 1,4. Vi brukte en Olympus 100x NA 1,45 mål.
    4. EMMCD kameraer fungerer veldig godt med TIRF grunn av sin høye signal til støyforhold. Slik tillater avbildning med optimal følsomhet vi brukt en 512x512 pixel tilbake opplyst EMCCD kamera med en pikselstørrelse på 16 mikrometer. For å opprettholde maksimal oppløsning vi plassert en 2x MAGNification linse foran kameraet.
    5. Som TIRF er en widefield teknikk, intensitet av laserstråler blir spredt ut. Sterke lasere derfor ofte bedre bildebehandling. Vi brukte 75 mW diode pumpet solid state (DPSS) lasere ved 488 nm og 561 nm.
    6. For å holde cellene under optimale vekstforhold under bildebehandling, bruke riktige miljømessige kontroller. Vi brukte en spesiallaget varmekammeret (Fig. 1B) for å studere gjær temperaturfølsomme mutanter. For medium utveksling i oppkjøpet enten vi brukt enkle flyt kammer eller glassbunn kultur retter som lett kan nås fra over på den omvendte mikroskop.
  2. Justere parametere
    1. Identifiser stilling celler ved hjelp av lyse felt belysning. Rød LED er spesielt gode som de ikke induserer betydelig bilde skade.
    2. Bytt til laser belysning og velge hensiktsmessige lasere og filter kombinasjoner for å opphisse fluorophores avvalg. Kontroller at TIRF vinkelen er underkritisk, eller vil du ikke kunne oppdage eventuelle signal som oppstår fra GFP fusjon proteiner. Hvis du er i tvil satt TIRF vinkel til 0 ° for å få en vinkelrett laserstråle. Finn den øverste delen av cellen (siden av cellen mot dekkglass). Alter hendelsen vinkelen på laserstrålen inntil signalene forsvinner deretter langsomt øke vinkelen til det punktet hvor fluorescens på celleoverflaten kommer tilbake (Movie 2). Juster z-fokus igjen for optimal posisjon på overflaten. Akseptable TIRF vinkler skape noe uklart glorie på kanten av cellen (Fig. 1C). Dersom betydelig foto bleking oppstår under installasjonen, lagre TIRF vinkel og flytte til en ubleket stadium posisjon før oppkjøpet.
    3. Juster laser intensiteter og kamera gevinst å maksimere dynamisk rekkevidde (høyt signal til støyforhold uten å fukte piksler). Vanligvis EMCCD kameraene er optimalt å oppdage svært lave signaler på høyt signal til støy rotteIos. For sterkere signaler vanlige CCD-kameraer produserer mindre støy og tilby et bredere dynamisk rekkevidde.
    4. TIRF mikroskopi er svært følsom for små høydeforskjeller i dekkglass, noe som resulterer i bare noen få celler, som kan avbildes på samme tid (Fig. 1D). For små celler oppkjøpet regionen (region av interesse, ROI) kan derfor ofte bli redusert til en underregion inneholder objektet av valget. Dette reduserer også tiden det tar å overføre data fra brikken til harddisken, ofte det hastighetsbegrensende trinn ved høy bildefrekvens.
    5. For dobbel farge TIRF eksperimenter sørge for å minimere blør igjennom av fluorophores. For RFP / GFP parene bruke separate utslipp filtre som RFP er svakt opphisset av 488 nm lys (Fig. 2A). De fleste filtre er ikke helt i tråd med hverandre. Filter Forskyvningen kan korrigeres ved hjelp av fluorescerende perler blandet med celler. For å oppnå sammenlignbare inntrengningsdybde, justere TIRF vinkler separat FOr hver laserlinje. En typisk arbeidsflyt er illustrert i fig. 2B.
    6. En kritisk parameter påvirke bildekvaliteten er laser justering og en ren objektiv. For å justere laseren, først fokus på z-posisjonen brukes til TIRF imaging. Fjern deretter prøven og rengjør målet om all olje (restolje vil føre til diffraksjon av laserlys og flekker i bjelken profilen). Projisere laser på taket i TIRF modus og kalibrere 0 ° posisjon slik at laseren er i en rett linje med det formål (bruk referanse flekk, alltid bruke laser vernebriller og unngå alle reflekser i strålebanen). Fokuser laser spot til en minimal størrelse. Vårt oppsett gir en bevegelig linse plassert mellom galvos og mikroskop for å lette rask kalibrering. Etter optimal justering, bør laser profilen danne et godt definere sted med omtrent rund form. Utfør kalibrering før hver økt for å oppnå optimal bildekvalitet.

3. Representative Resultater

  1. Fordeling av aktin homologer og cellevegg enzymer i Bacillus subtilis. Vi avbildes cellene uttrykker GFP fusjon av aktin homologe MBL eller transpeptidase PbpH ved TIRF og regelmessig epifluorescence. Inntrengningsdybde i TIRF er tydelig redusert og begrenset til overflaten mot dekkglass (Fig. 3A, B). Den svakt uttrykt transpeptidase PbpH lokaliserer til kortikale flekker som er knapt synlig ved epifluorescence men kan tydelig preget av TIRF (Fig. 3B). Den reduserte penetrasjon kan best observeres for PbpHGFP signal på septa, som vises som linjer i epifluorescence men som prikker i TIRF (Fig. 3B, pil).
  2. Protein domener i gjær plasmamembranen. Eksempler for nett-lignende mønstre som dannes av plasma membran proteiner i gjær er allerede gitt i fig. 1C og2. I tillegg til forbedret kontrast i TIRF som gjør klart skille disse nett-lignende mønstre, kan svake signaler noen ganger bli oppdaget eksklusivt av TIRF mikroskopi. Som eksempel avbildes vi en GFP fusjon av TORC2 komplekse komponenten Bit61 fra Saccharomyces cerevisiae. Dette proteinet er svakt uttrykt og danner små kortikale lapper med bare noen få proteiner eksemplarer per patch 9. I epifluorescence bare noen flekker er synlig over sterk bakgrunn, mens patcher kan avbildes med meget god signal til støyforhold i TIRF (Fig. 3C). Derfor TIRF er spesielt godt egnet til å studere svakt selvlysende strukturer og proteiner på celleoverflaten. Den høye aksial oppløsning levert av TIRF reduserer allerede bakgrunnsfluorescens. Ytterligere forbedring av bildet kontrast kan fås gjennom ulike bildebehandlingsprogrammer trinn. En enkel standard teknikk er lokal bakgrunn utjevning hvor en uskarp bilde trekkes fra denoriginal. Uskarpheten kan utføres med en rekke lave pass filter inkludert median eller Gaussian filter (Fig. 3D). Lokal bakgrunn subtraksjon fjerner støy og skjerper høy intensitet strukturer. Men kommer dette ofte til prisen av et tap av fine strukturer og overdrevet forsterkning av høy intensitet regioner (Fig. 3D, pil). En overlegen prosedyre er 2D deconvolution, som kan utføres med gratis eller kommersielt tilgjengelig programvare pakker som ImageJ, Matlab eller Huygens (Scientific Volume Imaging bv). TIRF bilder gir meget god aksial oppløsning og dermed en nesten to-dimensjonale point spread funksjon (PSF). Vi eksperimentelt bestemte dette PSF ved erverv av bilder av 40 nm fluorescerende perler med de samme innstillingene som ble brukt til selve avbildning (objektiv, kamera, eksitasjon og emisjon bølgelengde) Den eksperimentelle PSF ble deretter brukt til deconvolution med en klassisk maximum likelihood algoritmen i Huygens. Tidforfalle filmer av GFPRas2 eller Fet3GFP og Pma1RFP (Movies 3 og 4) viser en økning av kontrast etter deconvolution. I double fargebilder er det avgjørende å maksimere kontrast, for å kunne kvantifisere colocalization verdier (Movie 4).
  3. Analyse av protein omsetning på cellen cortex. TIRF og FRAP tilbyr en kraftig kombinasjon for studiet av dynamikken i kortikale proteiner. Men å tillate effektiv bruk av disse teknikkene, er rask kontroll av laser vinkler og posisjoner nødvendig. I TIRF, et bredt felt teknikk, må laseren å være fokusert på ryggen fokusplanet, og må følge en grunne insidens vinkel for å oppnå ønsket refleksjon. I motsetning krever FRAP laseren å være fokusert direkte på prøven og posisjonert med høy romlig nøyaktighet å tillate bleking av definerte strukturer eller regioner. Oppsettet fra Till fotonikk vi brukte i våre eksperimenter gir meget rask og intuitiv kontroll over thESE parametere. To galvanometer-kontrollerte speil brukes til å justere FRAP posisjon i x, y eller for å angi forekomsten vinkel i TIRF. En tredje speil brukes til å veksle mellom separate stråle stier for TIRF og FRAP belysning (laseren er utvidet med ytterligere objektiver i TIRF bane). Alle innstillinger er kontrollert av LA (live kjøp) programvare og kalibreringer kan raskt utføres for hvert forsøk for å oppnå optimale forhold. Denne programvaren tillater også definisjonen av blekemidler stillinger under bildet oppkjøpet, som er avgjørende for FRAP eksperimenter på bevegelige strukturer.
    Ved hjelp av denne funksjonen kan vi utelukke treadmilling av MBL filamenter som kilde for den observerte motilitet av MBL-holdige patcher (Fig. 3E). Denne observasjonen motivert vår søken etter alternative motilitet mekanismer, og til slutt resulterte i vår identifikasjon av en helt uventet type motilitet, hvor intracellulære protein komplekser (herunder MBL) er flyttet gjennom aktiviteterty av cellevegg syntetisere enzymer bosatt på utsiden av cellen fire. I en lignende måte, kunne vi observere de langsomme rearrangements av gjær plasma membran proteiner, som distribuerer til nettverket-lignende domener som dekker hele celleoverflaten (Fig. 3F).
    Disse eksemplene illustrerer hvordan dynamikken og fordelingen av kortikale proteiner kan være direkte vurderes ved å kombinere TIRF og FRAP teknikker.

4. Representative Resultater

Figur 1
Figur 1. Justering parametere. A. Dirty vs rengjøres coverslip. Bakgrunn signal som følge av støv på dekkglass forstyrre en potensiell GFP / RFP signal, har renset dekkglass mindre bakgrunn. B. Skreddersydd elektrisk oppvarming kontrolleren som viser innstilt temperatur (a), temperatur på probe (b) og prøve holderen (c) . C. Gjær protein Pma1GFP avbildes med synkende forekomst vinkler (fra øverst til venstre til nederst til høyre). Bildene viser et plutselig tap av signal ved kritisk vinkel og progressiv reduksjon i strukturell informasjon og signal til støyforhold. D. Ujevn synsfelt. En tett suspensjon av fluorescerende perler avbildes, viser at bare deler av synsfeltet er i fokus. Skala barer i A, B: 2 mikrometer, i C: 10 mm.

Figur 2
Figur 2. Double fargebildebehandling. A. Luft gjennomgang av Pil1RFP. Pil1RFP er spentmed 488 nm og en 561 nm laser og fluorescens er tatt opp med en dobbel bandet pass filter. Signal av Pil1RFP er svakt synlig i GFP kanalen. Skala bar 2 mikrometer B. Typiske tiltak for å unngå blø igjennom i dobbel farge imaging. Etter bildebehandling cellene med separate filter sett, er de deconvolved og justert (med fluoriserende perler) før han ble slått sammen for analyse.

Figur 3
Figur 3. Representative resultater. A. Sammenligning av GFPMbl fordeling i B. subtilis bruker TIRF eller regelmessig epifluorescence (EPI) mikroskopi. Blå: Cell grensen fra lyse felt bildet. Bilder representerer gjennomsnittlig anslag av en tidsserie for å indikere at området som omfattes av bevegelige MreB patcher overvåket med forskjellige bildemoduser. B. Forbedret aksial oppløsning og kontrast for TIRF bildes tatt av transpeptidase PbpHGFP i B. subtilis. Piler indikerer septal flekker som vises som ringer i epifluorescence og som flekker i TIRF. Eksponeringstid:. 100 ms C. Sammenligning mellom epifluorescence og TIRF belysning av TOR komplekse komponenten Bit61 i S cerevisiae.. Bit61 er veldig svakt uttrykt 9. Eksponeringstid: 250 ms D. Sammenlikning av ulike image bearbeidingsmetoder.. Serie som viser rå TIRF bilde av Pma1GFP, subtraksjon av Gaussian eller median uskarpe bilder, samt deconvolution bruker maksimal sannsynligheten algoritmen i Huygens. E. TIRF-FRAP av en enkelt GFPMbl patch (ovenfor stjerne) beveger seg over en B. subtilis celle. Den kymograph av den ikke-utvinne patch og intensiteten profil langs kymograph (stiplet linje) regel ut treadmilling som kilde til bevegelse. F. TIRF-FRAP av en gjær celle uttrykke Pma1GFP. Legg merke til diffusive lukking avgap i kortikale farging mønster. Skala barer: 2 mikrometer. Tid i sekunder.

Movie 1. Movie viser B. subtilis celler uttrykker en RFP fusion protein på en skitten dekkglass. Merk at RFP signalet er neppe skilles fra bakgrunnsstøy. Syklus tid 100 ms. Klikk her for å vise film .

Movie 2. Movie av Pma1GFP med forskjellige forekomst vinkler. Angle er endret fra underkritisk til kritisk vinkel, før signalet er borte. Obs, ved underkritisk vinkel interne signal er synlig, forårsaker støyende bilder helt til kritisk vinkel bare protein på PM er synlig. Syklus tid 200 ms. Scale bar: 2 mikrometer. Klikk her for å vise film .

Movie 3. Movie av gjær GFPRas2, viser alternating RAW og deconvolved TIRF bilder. GFPRas2 er en rask bevegelse protein (T1 / 2 av 2s upubliserte data), raske innhentingstider er viktig å løse den dynamiske oppførsel. Syklus tid 150 ms. Scale bar: 2 mikrometer. Klikk her for å vise film .

Movie 4. Double farge film av gjær proteiner Fet3GFP og Pma1RFP. Først 10 bilder representerer RAW-bilder og siste bildene er deconvolved. Denne filmen viser viktigheten av bildebehandlingen for colocalization analyse. De uskarpe RAW-bilder blir skjerpet, og gjør en analyse mulig. Syklustid 5 s. Scale bar: 2 mikrometer. Klikk her for å vise film .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TIRF mikroskopi er teknikken for valg til bilde perifere proteiner. Den lave inntrengningsdybde av evanescent feltet minimerer ute av fokus lys, noe som fører til en meget god signal til støyforhold og lar datainnsamling med høy bildefrekvens, eller avbildning av meget svakt uttrykte proteiner. Kombinasjonen av høy kontrast og høy bildefrekvens gjør TIRF mikroskopi et perfekt verktøy for bildebehandling spatio-temporale dynamikken i cortically lokaliserte proteiner. Interessant den tykke celleveggen rundt mange mikroorganismer ikke hindre avbildning av perifere proteiner ved TIRF. Faktisk, den faktiske generasjon av evanescent svært sannsynlig oppstår i skjæringspunktet mellom celleveggen og plasma membran 5,10. Refleksjon av lys som kommer ut av cellen kanskje føre til spredning av lys langs celleveggen, som kan forklare den store overflaten som kan avbildes i gjærceller 8.

For optimal kvalitet på TIRF imaldre det er avgjørende å ha en godt kalibrert mikroskopi system. Laseren skal være fokusert og justert før hver avbildning sesjon. Dekkglass bør rengjøres (Fig. 1a) og cellene må være riktig immobilisert. For doble Color Imaging spektrale blø igjennom må tas hensyn til eller elimineres ved hjelp av filter sett filtre separat utslipp rekkevidde. Dette vil åpenbart komme til prisen av tregere innhentingstider grunn mekanisk filter endring. Raske filter hjul eller galvanometer drevet belysning kilder kan omgå denne forsinkelsen om nødvendig. Alternativt kan den kritiske fluoroforen (RFP) skal brukes på svakere uttrykt protein i et par, noe som minsker nivået av signalinterferens.

Til tross for høy kontrast, bilder tatt med en TIRF mikroskop inneholde betydelig støy. For å fjerne denne støyen og øke bildekontrastdataene bilder kan behandles med ulike filtrering trinn. Metoden med de beste resultatene i vårerfaring er 2D deconvolution. Dette krever eksperimentelle måling av PSF for hver prøve og mikroskop tilstand. Men dette kan gjøres ganske enkelt og raskt ved hjelp av fluoriserende perler blandet inn i respektive prøven. For to-farge eksperimenter disse perlene kan i tillegg brukes til kanal justering.

Vi har vist fordelene ved å bruke TIRF mikroskopi for avbildning av kortikale proteiner i mikroorganismer. Kombinasjon av TIRF og bildebehandling tillater kjøp av bilder med høy bildefrekvens (<50 ms) og kontrast, og gir også mulighet for visualisering av svakt uttrykt proteiner som Bit61. En ekstra fordel av å utføre TIRF avbildning på mikroorganismen er at turgor press i disse cellene fører til flate plasmamembranen, og minimaliserer topologiske effekter TIRF signaler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av Max Planck samfunnet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbital Shaker UniEquip UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
TIRF microscope Customized setup
Glass container Vitlab 340-232880353
Ceramic staining rack Thomas Scientific 8542E40
Concanavalin A Sigma-Aldrich L7647
Coverslips #1(18 x 18 mm) Menzel-Glaser BB018018A1
Microscope Slides Menzel-Glaser AA00000102E
Immersion Oil Carl Zeiss, Inc. Immersol 518F
Agarose Invitrogen 16500-500
FluoSpheres Invitrogen F8795

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
  2. Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
  3. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  4. Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
  5. Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
  6. Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). , (2011).
  7. Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
  8. Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
  9. Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
  10. Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).

Tags

Bioteknologi TIRF bildebehandling gjær bakterier mikroskopi celle cortex
Visualisering av Cortex Organisasjon og Dynamics i Mikroorganismer, bruke Total Internal Reflection fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spira, F., Dominguez-Escobar, J.,More

Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Müller, N., Wedlich-Söldner, R. Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3982, doi:10.3791/3982 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter