Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции

doi: 10.3791/3982 Published: May 1, 2012

Summary

Полного внутреннего отражения флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным подход наблюдать структуры, близкие к поверхности клетки, при высокой контрастности и временным разрешением. Мы показываем, как TIRF могут быть использованы для изучения динамики белков в коре клеточной стенки закрытой бактериальных и грибковых клеток.

Abstract

TIRF микроскопия превратилась в мощную технологию визуализации для изучения пространственно-временной динамики флуоресцентных молекул в пробирке и в живых клетках 1. Оптическое явление полного внутреннего отражения, происходит при прохождении света из среды с высоким показателем преломления в среду с низким показателем преломления под углом больше, чем характерный критический угол (т.е. ближе к параллельно с границей). Несмотря на весь свет отражается обратно в таких условиях, затухающих волн создается, что распространяется вдоль и поперек границы, которая экспоненциально убывает с расстоянием, и только проникает в пример районы, 100-200 нм вблизи границы 2. В дополнение к превосходной осевой резолюции, снижение возбуждения в фокусе флуорофоров создает очень высокое отношение сигнал шум и свести к минимуму пагубные последствия фотообесцвечивания 2,3. Будучи техника широкопольных, TIRF позволяет быстрее изображение переменного токаquisition, чем большинство сканирования на основе конфокальной установки.

На первый взгляд, низкая глубина проникновения TIRF кажется несовместимым с изображениями бактериальных и грибковых клеток, которые часто окружены толстыми стенами клетки. Напротив, мы обнаружили, что клеточные стенки дрожжей и бактериальных клеток на самом деле повысить удобство работы с TIRF и расширить диапазон наблюдаемых структур 4-8. Многие клеточные процессы, поэтому могут быть непосредственно доступны TIRF в небольших, одноклеточные микроорганизмы, которые часто предлагают мощных методов генной манипуляции. Это позволяет выполнять в естественных условиях эксперименты биохимии, где кинетика белковых взаимодействий и деятельности могут быть непосредственно оценивается в живых клетках.

Мы описываем здесь отдельные шаги, необходимые для получения изображений высокого качества для TIRF Saccharomyces CEREVISIAE или Сенная палочка клеток. Отметим, различные проблемы, которые могут AffeКТ TIRF визуализации флуоресцентных зондов в клетках и иллюстрации процедуры с несколькими примерами применения. Наконец, мы показали, как TIRF изображений может быть улучшено с использованием установленных методов восстановления изображений.

Protocol

1. Подготовка образцов

  1. Подготовка крышка скользит
    Покровные стекла должна быть очищена от пыли, как TIRF чувствителен к фоновых сигналов, связанных с покровным (рис. 1А, фильм 1).
    1. Используя щипцы скользит место крышку керамический держатель с крышкой.
    2. Заполните стеклянный контейнер с 1 М NaOH (могут быть использованы несколько раз).
    3. Выдержите в течение 2 ч при медленном непрерывном вращении (орбитальный шейкер). Чрезмерное инкубации (> 8 ч) создаст непрозрачной крышкой скользит.
    4. Мыть два раза дистиллированной водой в течение 5 минут при медленном непрерывном вращении.
    5. Хранить в керамический держатель покрыты 100% этанола.
  2. Подготовка Сенная палочка клеток
    1. Разбавить до OD 600 0,01 - 0,05 в 5 мл соответствующего средства массовой информации роста и вырастет до экспоненциальной фазы (OD 600 0,3-0,7).
    2. Подготовить 1,25% агарозы в воде или в среду. Использование синтетических средах уменьшить фоновой флуоресценции. Растворите порошок в 1,5 мл пластиковых труб при 95 ° С и хранят в блоке нагрева при 72 ° C.
    3. Добавить каплю агарозном до середины слайда и нажмите на плоскую площадку со второй слайд. Аккуратно отделите слайды после по крайней мере 2 мин или перед использованием.
    4. Спином вниз 500 мкл клеток в микро центрифуги в 12,000 оборотов в минуту в течение 1 мин.
    5. Удалить супернатант, и ресуспендируют осадок в 50 мкл среды.
    6. Добавить 2-4 мкл клеток в центре площадки агарозы.
    7. Возьмите чистую покровным стеклом из этанола заполненный контейнер с пинцетом, сухой сжатый воздух и аккуратно поставить на образце.
    8. Давайте клеток решить, по крайней мере 2 мин до микроскопии.
    9. Печать края покровного с VALAP (вазелин, ланолин и Парафиновые, смешать в равных по весу тепла, обратиться с маленькой кистью или плюнулула) для долгосрочных изображений.
  3. Подготовка клетки Saccharomyces CEREVISIAE
    1. Развести предварительно культуры и расти в соответствующих средствах массовой информации, по крайней мере 5 часов в экспоненциальной фазе (OD 600 0,2-0,8).
    2. Возьмите покровное из контейнера пинцетом и сухим сжатым воздухом.
    3. Спрэд 5 мкл конканавалин решение (ConA, 2 мкг / мл дистиллированной воды) на покровное стекло с помощью пипетки и сухим сжатым воздухом. ConA связываются с углеводами клеточной стенки дрожжей и обездвиживает дрожжевых клеток.
    4. Передача 4,5 мкл суспензии клеток дрожжей с одной стороны ConA покрытые покровным. Аккуратно положите крышку скольжения на предметное стекло микроскопа. Начните с одного края, и пусть медленно снижаться, чтобы избежать образования воздушных пузырей.
    5. Давайте клеток решить, по крайней мере 2 мин до микроскопии.
    6. Печать края покровного с VALAP (см. выше) для долгосрочных изображений.
  1. Микроскоп установки
    Мы выполнили все эксперименты по установке TIRF настроенные на основе полностью автоматизированной IMIC стенд (До Photonics) с Olympus 100x 1,45 цель NA. 75 мВт DPSS лазеров на 488 нм (Coherent Sapphire) и 561 нм (Cobolt Jive) были использованы в качестве источников света. Лазеры были выбраны через AOTF и направляется через широкополосные волокна IMIC. Гальванометр управляемой двумя оси сканера головы используется для регулировки углов падения или флуоресценции Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) положении. Дополнительного гальванометра используется для переключения между эпифлуоресцентной, FRAP и TIRF. Изображения были собраны с Андор IXON DU-897 EMCCD камерой и 2x линза увеличения перед камерой. Приобретение контролировали Онлайн приобретение (Till Photonics) пакета программного обеспечения.
    Следующие пункты должны быть рассмотрены:
    1. Программируемый контроль над источника освещения (лазер лНИС) и угол TIRF имеет важное значение для воспроизводимости результатов и особенно для многоцветных TIRF, где углы падения должны быть скорректированы для каждой длины волны возбуждения по обеспечению равных проникновения затухающих волн. В нашем угол установки TIRF могут быть скорректированы мгновенно с помощью двух гальванометров, которые непосредственно управляются с Онлайн пакет приобретение программного обеспечения.
    2. Наши настроенные установки дополнительно позволяет быстрое переключение между эпифлуоресцентной, TIRF и FRAP через третью гальванометр, позволяющий простое измерение кинетики локализации объектов прослеживается в TIRF.
    3. Цель типа TIRF требует высокой числовой апертуры NA> 1.4. Мы использовали Olympus 100x NA 1,45 цели.
    4. EMMCD камеры работают очень хорошо с TIRF в связи с их высоким отношением сигнал-шум. Для того чтобы изображение с оптимальной чувствительности мы использовали 512x512 пикселей назад освещенный EMCCD камеры с размером пикселя 16 мкм. Чтобы сохранить максимальное разрешение мы поместили 2x MAGNкации линзы перед камерой.
    5. Как TIRF это техника широкопольных, интенсивность лазерного луча распространено. Сильные лазеров поэтому часто улучшения изображения. Мы использовали 75 мВт с диодной накачкой твердого тела (DPSS) лазеров на 488 нм и 561 нм.
    6. Для того чтобы клетки при оптимальных условиях роста во время съемки, использовать соответствующие экологического контроля. Мы использовали заказ нагревательной камеры (рис. 1б) для изучения дрожжей чувствительных к температуре мутантов. Для средних обмена при приобретении либо мы использовали простые камеры потока или стеклянным дном блюда культуры, которые могут быть легко доступны сверху на инвертированный микроскоп.
  2. Настройка параметров
    1. Определить положение ячеек с помощью яркого освещения поля. Красные светодиоды особенно хороши, поскольку они не вызывают значительный ущерб фото.
    2. Переключение в режим лазерной подсветки и выбрать соответствующий фильтр лазеров и комбинаций, чтобы возбудить в флуорофороввыбор. Убедитесь в том, что угол TIRF докритический, иначе вы не сможете обнаружить любой сигнал, вытекающие из белков GFP синтеза. В случае сомнений установить TIRF углом от 0 ° до получения луча перпендикулярно лазер. Найдите в верхней части ячейки (сторона клетки, стоящие перед покровным). Изменение угла падения лазерного луча до сигналы исчезают, а затем постепенно увеличивать угол до точки, где флуоресценция на поверхности клетки появляется (видео 2). Отрегулируйте Z-фокусировку еще раз для оптимального положения на поверхности. Приемлемые углы TIRF не создают размытый ореол на краю ячейки (рис. 1в). Если значительная фото отбеливание происходит во время установки, за исключением угла TIRF и перейти к небеленой положение этап перед началом приобретения.
    3. Регулировка интенсивности лазерного и усиление камеры максимально расширенным динамическим диапазоном (высокое отношение сигнал-шум без насыщения пикселей). Обычно EMCCD камеры оптимальным для обнаружения очень слабых сигналов при высоком отношении сигнал-шум крысыIOS. Для более сильных сигналов регулярные ПЗС-камер производят меньше шума и предлагают более широкий динамический диапазон.
    4. TIRF микроскопии очень чувствительны даже к небольшим изменениям высоты покровного стекла, в результате чего лишь несколько клеток, которые могут быть отображены в то же время (рис. 1D). Для малых элементов приобретение региона (области интереса, ROI), следовательно, часто сводится к субрегионе, содержащего объект выбора. Это также сокращает время, необходимое для передачи данных с чипа на жестком диске, часто лимитирующим шагом на высокую частоту кадров.
    5. Для двойной цвет TIRF экспериментов убедитесь, чтобы минимизировать кровотечение через флуорофоров. Для ППП / GFP пар использовать отдельные фильтры выбросов, RFP слабо возбуждаются светом 488 нм (рис. 2). Большинство фильтров не идеально согласованы друг с другом. Фильтр смещения могут быть исправлены с помощью флуоресцентного бисера смешаны с клетками. Для достижения сопоставимого глубину проникновения, отрегулировать углы TIRF отдельно лт каждая линия лазера. Типичный рабочий процесс показан на рис. 2B.
    6. Критический параметр влияет качество изображения лазерной центровки и чистой цели. Для выравнивания лазера, сначала сосредоточиться на Z-позиции для TIRF изображений. Затем удалите образец и очистить цель всей нефти (мазут приведет к дифракции лазерного света и крапинками в профиль пучка). Проект лазер на потолке в режиме TIRF и калибровки 0 °, что лазер на прямой линии с целью (используйте ссылки месте, всегда носите очки лазерной безопасности и избежать отражения луча). Фокус лазерного пятна в минимальном размере. Наша установка обеспечивает подвижную линзу, расположенную между galvos и микроскопом, чтобы способствовать быстрому калибровки. После оптимальной настройки, лазерный профиля должны стать также определить место с примерно круглую форму. Выполните калибровку перед каждой сессией для получения оптимального качества изображения.

3. Представитель Результаты

  1. Распределение актина гомологов и ферменты клеточной стенки Сенная палочка. Мы отображаемого клеток, экспрессирующих GFP слияния актина гомологом MBL или транспептидазы PbpH по TIRF и регулярно эпифлуоресцентной. Глубина проникновения в TIRF явно сокращается и ограничивается поверхности, обращенной к покровным (рис. 3А, Б). Слабо выражены транспептидазы PbpH локализуется в корковом патчи, которые едва заметны на эпифлуоресцентной но можно четко различить по TIRF (рис. 3В). Снижение проникновения лучше всего можно наблюдать на PbpHGFP сигнал на перегородками, которые изображаются в виде линий в эпифлуоресцентной но в виде точек в TIRF (рис. 3В, стрелка).
  2. Белки доменов в плазматической мембраны дрожжей. Примеры сети как модели образована плазма мембранных белков в дрожжах, уже приведены на рис. 1С и2. В дополнение к улучшенным контрастом TIRF, что позволяет четкое разграничение этих сетей как моделей, слабые сигналы, иногда могут быть обнаружены только с помощью микроскопа TIRF. В качестве примера, мы отображаемого GFP слияние TORC2 комплекс Bit61 компонент CEREVISIAE Saccharomyces. Этот белок слабо выражены и образует небольшие пятна с корковой только несколько белков копий на патч 9. В эпифлуоресцентной только несколько патчей видны над сильным фоном, в то время как патчи могут быть отображены с очень хорошими отношения сигнал-шум в TIRF (рис. 3в). Поэтому TIRF особенно хорошо подходит для изучения слабо люминесцентными структур и белков на поверхности клеток. Высокое разрешение осевой предоставляемые TIRF уже снижает фоновой флуоресценции. Дополнительное повышение контраста изображения могут быть получены через различные этапы обработки изображений. Простой стандартный метод локальной выравнивания фона, на котором размытого изображения вычитается изоригинала. Размытие может быть выполнена с различными фильтров нижних частот, включая средний или гауссовой фильтров (рис. 3). Местное вычитания фона удаляет шум и обостряет высокая интенсивность структур. Тем не менее, это часто происходит ценой потери тонких структур и преувеличенные усиления высокогорных районах интенсивность (рис. 3D, стрелка). Превосходная процедура 2D деконволюции, которые могут быть выполнены с бесплатным или коммерчески доступных программных пакетов, таких как ImageJ, Matlab или Гюйгенс (Научно Объем изображений BV). TIRF изображений обеспечивают очень хорошую осевой разрешение и, следовательно, почти двумерной функции размытия точки (ФРТ). Мы экспериментально определить эту PSF, приобретая изображения 40 нм люминесцентные бусины с теми же настройками, которые были использованы для реального изображения (цель, камера, возбуждения и длины волны излучения) экспериментальные PSF затем был использован для деконволюции с классического алгоритма максимального правдоподобия в Гюйгенс. Времянедействительной фильмы GFPRas2 или Fet3GFP и Pma1RFP (фильмы 3 и 4) демонстрируют увеличение контрастности после деконволюции. В двойных цветных изображений крайне важно максимально напротив, чтобы иметь возможность количественно колокализации значения (фильм 4).
  3. Анализ белка оборот в клетку мозга. TIRF и FRAP предлагает мощную комбинацию для изучения динамики корковых белков. Однако, чтобы обеспечить эффективное использование этих методов, быстрое управление лазерным углов и позиций не требуется. В TIRF, широкое поле техника, лазерная должно быть сосредоточено на задней фокальной плоскости и должен следовать мелкие угла падения для достижения желаемого отражения. В отличие от FRAP требует лазерной быть направлены непосредственно на образце и позиционируется с высокой пространственной точностью, чтобы отбеливание определенных структур или регионов. До установки из фотоники мы использовали в наших экспериментах обеспечивает очень быстрый и интуитивный контроль над йесе параметров. Два гальванометра контролируемого зеркала используются для настройки FRAP позицию в х, у или установить угол падения в TIRF. Третье зеркало используется для переключения между различными путями луч для TIRF и FRAP освещенности (лазерный расширена дополнительными объективами в пути TIRF). Все настройки находятся под контролем Л.А. (живой приобретение) программного обеспечения и калибровки можно быстро выполняться для каждого эксперимента для достижения оптимальных условиях. Это программное обеспечение также позволяет определять отбеливатель позиции во время захвата изображения, что очень важно для FRAP эксперименты на подвижных структур.
    С помощью этой функции можно было бы исключить из treadmilling MBL нити в качестве источника для наблюдаемой подвижности MBL содержащих исправления (рис. 3Е). Это наблюдение мотивирован наш поиск альтернативных механизмов, подвижность, и, наконец, привели в нашей идентификации совершенно неожиданный тип моторики, где внутриклеточных белковых комплексов (в том числе MBL) перемещаются через деятельти синтеза клеточной стенки ферментов, расположенных на внешней стороне клетки 4. Аналогичным образом, мы имели возможность наблюдать медленное перестройки дрожжи белков плазматической мембраны, которые распространяют в сети, как области, охватывающей всю поверхность клетки (рис. 3F).
    Эти примеры показывают, как динамика и структурирование коры белков может быть непосредственно оценить посредством сочетания TIRF и FRAP техники.

4. Представитель Результаты

Рисунок 1
Рисунок 1. Регулировка параметров.. Грязные против очищены сотрудничестваverslip. Фонового сигнала, связанных с пылью на покровное мешает потенциальным GFP / ППП сигнал, очищают покровное меньше фона. Б. заказ электрический регулятор нагрева показывает заданную температуру (а), датчик температуры (б) и держатель образца (с) . С. Дрожжи белка Pma1GFP отображаемого при уменьшении углов падения (от верхнего левого угла в правый нижний). Изображения показывают, внезапная потеря сигнала на критический угол и прогрессирующим снижением структурной информации и отношение сигнал-шум. D. неравномерное поле зрения. Плотной подвеской люминесцентных бисера отображаемого, показывая, что только часть поля зрения находится в фокусе. Масштаб баров, B: 2 мкм, в C: 10 мкм.

Рисунок 2
Рисунок 2. Двухместные изображениями цветов. А через Стравите из Pil1RFP. Pil1RFP возбуждаетсяс 488 нм и 561 нм и флуоресценции записан двойной фильтр полосы пропускания. Сигнал Pil1RFP слабо видны в канал GFP. Шкала бар 2 мкм Б. Типичные шаги, чтобы избежать кровотечения путем в двойные изображения цветов. После изображений клеток с отдельными наборами фильтров, они deconvolved и приведены в соответствие (с помощью флуоресцентного бисера), а затем объединены для анализа.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель результаты. А. Сравнение GFPMbl распределения B. Сенная использованием TIRF или регулярные эпифлуоресцентной (РПИ) микроскопии. Синий: Сотовый границы от яркого поля изображения. Изображения представляют средние прогнозы временных рядов, чтобы указать область покрыта подвижными патчи MreB мониторинга с различными режимами съемки. B. Повышение осевой разрешение и контрастность изображения TIRFс приняты во внимание транспептидазы PbpHGFP в B. Сенная. Стрелки указывают перегородки окрашивание, которое появляется, как кольцо в эпифлуоресцентной а также патчи в TIRF. Время экспозиции:. 100 мс С. Сравнение эпифлуоресцентной и TIRF освещения ТОР комплекс Bit61 компонент S CEREVISIAE.. Bit61 очень слабо выражен 9. Выдержка: 250 мс D. Сравнение различных методов обработки изображений.. Серия показывает сырья изображение TIRF из Pma1GFP, вычитание гауссовской или Медиана смазывания изображения, а также деконволюции с использованием максимального правдоподобия в алгоритме Гюйгенса. Е. TIRF-FRAP одного GFPMbl патч (выше звездочки), перемещаемых через B. Сенная клетки. Кимограф не-патч восстановления и интенсивность профиля по кимограф (пунктирная линия) исключают treadmilling как источник движения. Ф. TIRF-FRAP из дрожжевых клеток выражения Pma1GFP. Обратите внимание на диффузионные закрытияРазрыв в корковых окрашиванием. Масштаб бары: 2 мкм. Время в секундах.

Фильм 1. Фильм показывает B. Сенная клеток, экспрессирующих белок RFP слияние на грязной покровным. Обратите внимание, что ППП сигнал вряд ли отличается от фонового шума. Время цикла 100 мс. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Фильм 2. Фильм Pma1GFP с различными углами падения. Угол изменяется от докритических на критический угол, пока сигнал теряется. Обратите внимание, что при докритических угол внутренний сигнал виден, вызывая шумные изображения, пока на критический угол только белка в премьер-видна. Время цикла 200 мс. Шкала бар: 2 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Фильм 3. Фильм дрожжей GFPRas2, показывая переменногоING RAW и deconvolved TIRF изображений. GFPRas2 это быстро движущихся белка (T1 / 2 2s неопубликованные данные), быстрое время приобретения имеют важное значение для решения динамических характеристик. Время цикла 150 мс. Шкала бар: 2 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Фильм 4. Двухместный фильм цвет дрожжей белки Fet3GFP и Pma1RFP. Первые 10 кадров в формате RAW представляют собой изображения и последний кадры deconvolved. Этот фильм показывает важность обработки изображений для колокализации анализа. Размытых изображений RAW стало заостренным, что делает анализ. Время цикла 5 с. Шкала бар: 2 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TIRF микроскопии является методом выбора для изображений периферических белков. Низкая глубина проникновения неоднородных полей минимизирует вне фокуса света, что приводит к очень хороший сигнал-шум и позволяет сбор данных с высокой частотой кадров или изображений очень слабо выражены белков. Сочетание высокой контрастности и высокой частоты кадров делает TIRF микроскопии идеальный инструмент для визуализации пространственно-временной динамики cortically локализованных белков. Интересно, что толстая клеточная стенка окружающих многие микроорганизмы не препятствует визуализации периферических белков TIRF. На самом деле, реальное поколение неоднородных весьма вероятно, происходит на границе между клеточной стенкой и 5,10 плазматической мембраны. Отражение света, который выходит из клетки может даже привести к распространению света вдоль клеточной стенки, которые могли бы объяснить большой площадью поверхности, которые могут быть отображены в клетках дрожжей 8.

Для обеспечения оптимального качества TIRF имвозрасте очень важно иметь хорошо калиброванный микроскопии системы. Лазерный должны быть направлены и выровнены друг перед изображениями сессии. Покровные стекла должна быть очищена (рис. 1а), а клетки должны быть надлежащим образом обездвижен. Для двойных цветных изображений спектральных кровотечение путем должно быть принято во внимание или устранить с помощью фильтра фильтры наборов отдельных спектр излучения. Это, очевидно, будет приходить по цене приобретения медленнее раза за счет механического фильтра. Быстрый фильтр колеса или гальванометра управляемых источников освещения могут обойти эту задержку, если необходимо. Кроме того, критические флуорофора (RFP) могут быть использованы на более слабых выразил белка в паре, сводя к минимуму уровень сигнала помехи.

Несмотря на высокую контрастность, снимки, сделанные с помощью микроскопа TIRF содержат значительный шум. Для удаления этих шумов изображения и дальнейшее увеличение изображения отличие может быть обработан с различными фильтрации шагов. Метод с лучшими результатами в нашейопыт 2D деконволюции. Это требует экспериментального измерения ФРТ для каждого образца и микроскопа состоянии. Однако, это может быть выполнена довольно легко и быстро с помощью флуоресцентного бисера смешивается с соответствующим образцом. В течение двух цветов эксперименты эти бусины могут быть дополнительно использованы для выравнивания канала.

Мы продемонстрировали преимущества использования TIRF микроскопии для визуализации коры белков микроорганизмов. Сочетание TIRF и обработки изображений позволяет получать изображения с высокой частотой кадров (<50 мс) и контрастности, а также позволяет визуализировать слабо выраженные белки, такие как Bit61. Дополнительным преимуществом проведения TIRF изображений на микроорганизм является то, что давление тургора в этих клетках приводит к плоской мембраны плазмы, а также сводит к минимуму топологические эффекты TIRF сигналов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Обществом Макса Планка.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbital Shaker UniEquip UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
TIRF microscope Customized setup
Glass container Vitlab 340-232880353
Ceramic staining rack Thomas Scientific 8542E40
Concanavalin A Sigma-Aldrich L7647
Coverslips #1(18 x 18 mm) Menzel-Glaser BB018018A1
Microscope Slides Menzel-Glaser AA00000102E
Immersion Oil Carl Zeiss, Inc. Immersol 518F
Agarose Invitrogen 16500-500
FluoSpheres Invitrogen F8795

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Axelrod, D., Thompson, N. L., Burghardt, T. P. Total internal inflection fluorescent microscopy. J. Microsc. 129, 19-28 (1983).
  2. Axelrod, D., Omann, G. M. Combinatorial microscopy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 944-952 (2006).
  3. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
  4. Dominguez-Escobar, J. Processive movement of MreB-associated cell wall biosynthetic complexes in bacteria. Science. 333, 225-228 (2011).
  5. Sparkes, I. A. Bleach it, switch it, bounce it, pull it: using lasers to reveal plant cell dynamics. J. Exp. Bot. 62, 1-7 (2011).
  6. Uchida, M. Total synthesis and absolute configuration of avenolide, extracellular factor in Streptomyces avermitilis. J. Antibiot. (Tokyo). (2011).
  7. Yu, H., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics: Generating randomness by formin(g) and moving. Bioarchitecture. 1, 165-168 (2011).
  8. Yu, J. H., Crevenna, A. H., Bettenbuhl, M., Freisinger, T., Wedlich-Soldner, R. Cortical actin dynamics driven by formins and myosin V. J. Cell. Sci. 124, 1533-1541 (2011).
  9. Berchtold, D., Walther, T. C. TORC2 plasma membrane localization is essential for cell viability and restricted to a distinct domain. Mol. Biol. Cell. 20, 1565-1575 (2009).
  10. Vizcay-Barrena, G., Webb, S. E., Martin-Fernandez, M. L., Wilson, Z. A. Subcellular and single-molecule imaging of plant fluorescent proteins using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). J. Exp. Bot. 62, 5419-5428 (2011).
Визуализация Cortex организация и динамика у микроорганизмов, с помощью микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Müller, N., Wedlich-Söldner, R. Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3982, doi:10.3791/3982 (2012).More

Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Müller, N., Wedlich-Söldner, R. Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3982, doi:10.3791/3982 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter