Summary
이 연구의 발전을 설명
Abstract
마름모꼴의 입술은 신경 튜브와 넷째 뇌실 (1 검토)의 roofplate 사이의 교차점에서 hindbrain에있는 배아 neuroepithelium입니다. 마름모꼴의 입술은 rhombomere 1 (R1)을 포함하고 소뇌의 뉴런의 연결을 다양한 brainstem의 lineages 2-4로 상승을주는 낮은 마름모꼴의 입술 (LRL)를 생성하는 상위 마름모꼴의 입술 (URL)로 세분화 할 수 있습니다. LRL 파생 상품은 청각 와우각 핵의 뉴런과 균형과 모터 제어 5-8를 규제에 관련된 precerebellar 핵 분들을 포함합니다. LRL에서 Neurogenesis은 배아 일 (E) 9.5-16.5 5, 9를 포함 대용량 시간적 창을 통해 발생합니다. 다른 lineages의 연결이 neurogenic 창을 동안 뚜렷한 발달 일간 postmitotic 세포 (또는 태어난다)로 LRL에서 나온다.
유전자 발현 구조의 Electroporation을하는 데 사용할 수있는LRL progenitors의 유전자 발현을 조작하고 잠재적으로이 지역에서 생산된 10-12 뉴런의 운명을 바꿀 수 있습니다. utero의 electroporation의를 통해 마우스의 LRL progenitors의 변화 유전자 발현은 배아 일 E12.5 이상 10, 12-14 일에 태어 lineages 조작을위한 큰 성공을 거두었습니다. utero의 electroporations에는 사전에 E12.5이 주로 인해 성공하지 못했습니다 보여 주죠는 네 번째 뇌실의 roofplate, LRL로 electroporated되는 외인성 DNA를 제공하는 필요한 단계를 펑쳐링과 관련된. 그러나 많은 LRL 파생된 lineages 일찍 E12.5 9보다 LRL에서 발생합니다. 이러한 이전 출생 lineages는 측면 망상을 구성하는 뉴런, 외부 cuneate 및 소뇌 5 척수와 대뇌 피질로부터 입력을 연결하는 기능 precerebellar 시스템의 열등 olivary 핵을 포함합니다. LRL 표현을 조작하기 위해서는E12.5 미만 배아의, 우리는 배아가 electroporation에 따라 문화에 배치되는 체외 시스템에서 개발.
이 연구 E11.5에서 LRL progenitors의 유전자 발현을 조작을위한 효율적이고 효과적인 방법을 제공합니다. 크게 활성 배속 모터에서 구동 녹색 형광 단백질 (GFP)을 electroporated 태아는 reproducibly 문화 24 시간 후 GFP를 표명했다. 이 분석의 핵심 측면은 유전자 발현에만 때문에 외인성 유전자의 표현이 아니라 인해 이차 효과 변경되는 것입니다 electroporation과 culturing 기법에 따른니다. 그것은 내생 유전자 발현 패턴 electroporated과 교양 배아에 그대로 남아있는 것으로 확인되었다. 이 분석은 overexpression에 대한 plasmids의 도입을 통해 E12.5 미만 배아의 LRL에서 신흥 세포의 운명을 변경하거나 (RNAi를 통해) 아래로 노크를 활용할 수 다른 프로신경 전사 요인.
Protocol
1. Electroporation 이전 준비
- 맥시의 준비 (프라임 - 이건 또는 Qiagen)에 의해 electroporation을위한 DNA를 증폭. DNA의 농도는 효율적인 이해 1 밀리그램 / ML 최소이어야합니다.
- microcentrifuge 튜브 1 X PBS (인산염 식염수 버퍼)의 0.01 % 빠른 그린의 5 μl로 DNA와 혼합 495 μL를 제거합니다.
2. 배아 하베스트
- CD-1 생쥐 (할란)의 시간이 초과되었습니다 matings을 마련한다. 질 플러그의 존재를 확인하고 질 플러그가 배아 일 (E) 0.5으로 관찰되는 날짜를 생각한다. 태아도 11일 플러그 (E11.5)를 시각화 후에 수확한다.
- 70 % 에탄올로 소독 도구를 놓습니다. 사용하기 전에 적어도 한 시간 동안 자외선과 판상 흐름 후드를 드셔보세요. 스프레이 후드, 해부 트레이, 그리고 70 % 에탄올로 범위를 해부. 37까지 사전 열 1 X PBS는 ° C.
- E11.5에서 Institut의 승인 조건에 따라 여성을 안락사시켜야동물의 관리 및 사용 (ICCUA)에 대한 ional위원회. 층류 후드의 해부 트레이를 놓습니다. 70 % 에탄올과 여성의 복부를 스프레이.
- 복막 캐비티를 열고 해부 트레이에 성벽을 달아주는. 그것이 복막 캐비티 내에 달려 있도록 자궁 뿔을 내밀어 봐요.
- 조심스럽게 자궁 뿔의 벽을 열고 했네요. 부드럽게 멀리 태반에서 난황에서 배아를 제거하는 20 밀리미터 스푼 (파인 과학적 도구)를 사용합니다. 100 밀리미터 조직 배양 접시에 플레이스 배아 2.2에 preheated되었습니다 멸균 1 X PBS의 10 ML과 prefilled.
- 현재 모든 배아에 대해 반복합니다.
3. E11.5의 태아의 Electroporation (그림 1)
- 20 밀리미터 스푼을 사용하여, 37에 preheated되었습니다 멸균 1XPBS의 10 ML로 prefilled 새로운 100mm 요리 ° C.에 최초의 배아를 전송
- 신중을 다시 0.05 X 0.02 밀리미터 팁 (파인 과학적 도구)로 11cm의 집게를 사용하여이동하고 난황을 버리고.
- 위치 배아 그래서 그 지느러미 측면은 그림 1A에서 만화과 비슷한 정도로까지 직면하고 있다고. 부드럽게 배아를 개최하기 위해 7mm 전극 충격기 (하버드 장치)를 사용합니다. 전극은 hindbrain 넷째 뇌실의 수준에서 신경 튜브의 양쪽에 위치해야합니다. 뇌실은 맨눈으로 볼 수 있지만 해부 현미경을 사용하면 정확한 패들 배치를 용이하게하실 수 있습니다. 심폐 소의 위치는 electroporated DNA를받는 지역을 결정하기 위해 중요합니다. 지느러미 배아 hindbrain의 낮은 마름모꼴의 입술 (LRL)이 원하는 경우 심폐들이 직접 번째 뇌실 개구의 가장 넓은 부분을 측면되는 그러한 장소 여야합니다.
- 0.01 % 빠른 그린과 혼합 플라스미드 DNA를 구축하도록 한 CC의 주사기를 사용하십시오. 혼합물 500 μL은 적어도 8-10 배아 (3.5 참조) electroporation 충분해야합니다.
- 부드럽게 찔린 roofplate 오븐한 CC의 주사기에 부착된 25G 8분의 5 투베르쿨린 바늘로 네 번째 뇌실을 erlying 및 뇌실로 DNA를 염색 혼합물을 주입. 성공 주사는 전체 심실 시스템 (그림 1C)을 작성 DNA-염료 혼합물을 특징으로하고 있습니다. 일반적으로 주입 DNA-염료 혼합물의 양은 50 미만 μL입니다. 혼합물의 부분이 배아를 둘러싼 PBS로 뇌실 밖으로 새는 경향으로 정확한 금액은 배아 사이의 변수입니다. DNA-염료 혼합물을 전달하는 대체 수단 midbrain을 overlying 연구개를 펑쳐링하여 심실 시스템에 액세스를 통해 것입니다. 다시 말하지만, 성공적인 주사는 전체 심실 시스템을 작성 DNA-염료 혼합물을 특징으로하고 있습니다.
- 전기 펄스 발생기 (BTX) 및 7 밀리미터 전극 충격기를 사용하여 다섯 사각형 펄스를 제공합니다. 각각의 펄스는 각 펄스 사이의 500 MS와 펄스 당 50 V, 지속적인 다섯 MS입니다. 긍정적으로 충전 전극에 가장 가까운 조직 얘기가 그러면됩니다플라스미드 백업 E.
4. 태아의 문화
- 층류 후드에서는 10 % 태아 소 혈청 5 % 말 혈청, 1 %의 글루타민, 1 % 페니실린 / preheated되었습니다 스트렙토 마이신과 보완 DMEM/F12 미디어 2 ML과 함께 12도 문화 접시의 바깥쪽 우물을 채울 37에 ° C. 문화 조건 드 샌디에고 및 동료에서 적응되었다. 15
- 포셉과 midsection (심장 아래)에서 층류 후드의 핀치 배아와 태아의 후부 부분을 제거합니다. 12 잘 배양 접시 가득 우물 중 하나로 앞부분 일부를 놓습니다.
- 모든 배아에 대해 반복합니다. 문화의 오염을 피하기 위해 12 잘 판만을 외부 우물을 채웁니다.
- 5% CO 2와 37 ° C 배양기에서 문화 배아. electroporated 플라스미드의 표현 24 시간 이내에 관찰할 수 있어야합니다.
- 이상 배양 시간이 원하는되어야, 2 ML과 함께 새로운 12 잘 접시의 밖으로 우물을 채울미디어 4.1에 사용됩니다. 멸균 스푼으로 새 접시에 잘으로 배아를 전송합니다. 37 ° C 배양기에 다시 넣습니다. 최대 48 시간까지를위한 문화가 가능합니다.
- 원하는 문화 시간에 도달하면 (아래) 분석을 위해 배아를 채운다.
5. 분석을위한 태아의 작성
- 다섯 분에 대해 4 ° C에서 1 X PBS에서 배아를 씻어. 반복합니다.
- 4 ° C.에 2 시간 1XPBS의 2 % paraformaldehyde의 분석 (PFA)의 배아를 고정
- 다섯 분에 대해 4 ° C에서 1 X PBS에서 배아를 씻어. 반복합니다.
- 4에서 하룻밤 1 X PBS의 30 % 자당에 배아를 평형 ° C.
- 드라이 아이스 / 에탄올 욕조를 사용하여 최적의 절삭 온도 (-10 월) 화합물의 배아를 포함시킵니다. 태아도 -20 ° C.에 저장될 수
- 30 μm의 섹션으로 그라 이오 스탯 (Leica)과 (VWR, Superfrost 플러스) 슬라이드에 마운트에 관한 섹션 배아. -20 ° C.에 저장
6. Immunohistochemistry 분석
- 16에 설명된대로 Immunohistochemistry이 수행되었다. 마우스 α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; 토끼 α-Ngn1 (제인 존슨) 1:5000, 토끼 α-Ptf1a (제인 존슨은이 연구에 사용되는 일차 항체 dilutions는 토끼 α-GFP (Invitrogen) 1:2500 포함 ) 1:2500, 토끼 Math1 (제인 존슨) 1:100. 4 ° C에서 하룻밤에 염색법 트레이에 슬라이드 평면, 표본 측면을 품어.
- 슬라이드는 복합 현미경 (올림푸스 BX51)을 분석했다.
7. 대표 결과
그림 1A의 개략도 electroporation 실험을 묘사. 그림 1B는 조작 이전 E11.5 배아의 화살보기를 표시합니다. 0.01 % 빠른 그린에서 플라스미드 포함 배속 :: GFP의 주입에 따라 동일한 배아는 그림 1C 및 일방적 GFP를 전시 대표 고정되지 않은 배아에 나와 있습니다지느러미 hindbrain 24 시간 다음과 문화의 표현은 그림 1D에 표시됩니다. 성공적으로 electroporated되는 LRL의 영역의 범위는 변수이며 전극의 위치에 크게 의존 것 같습니다. 우리의 연구에 그것은 electroporated 배아 65 (80 %)의 52 밖으로 성공적으로 GFP를 표명 사실을 발견했습니다. 조직은 그것이 고정 및 immunohistochemical 분석 (아래)에 따라 여러 부분 이상의 지역화된 지역에서 GFP 양성 반응이 있었다면 성공적으로 electroporated로 간주되었다. 이 기준을 충족하는 데 실패 태아도 electroporation의 실패로 득점했다.
electroporation 효율의 자세한 평가는 넷째 뇌실의 수준에서 electroporated 배아의 가로 부분에 GFP에 대한 immunohistochemistry를 수행하여 ascertained 될 수 있습니다. 그림 2는 일방적를 표시 배아의 대표 시리얼 섹션을 보여줍니다GFP를 표현. 그림 2A는 배아의 왼쪽은 긍정적인 전극쪽으로이라고 설명하고 이상적인 설계도를 보여줍니다. 가로 구역 (그림 2A의 중간 만화로 대표되는 수준에서) hindbrain 조직 (그림 2C와 2D)의 왼쪽에 독점적으로 지역화된 GFP 발현을 알 수있다. 그림 2C에 나타난 그 ~ 300 μm의 주동이의 이상 부분의 심사는 명시적 GFP (그림 2B)을하지 않으므로 LRL의 electroporated 면적은 신경 튜브의 전체 앞쪽에-후부 축을 연장하지 않았다.
유전자 표현의 조작이 분석의 유틸리티는 내생 단백질에 대한 표현 도메인의 안정성에 의존적일 수 밖에 없습니다. LRL는 proneural 전사 요인 차등 표현 (1 검토)을 특징으로 독특한 전구 도메인을 소지으로 특징되었습니다.이러한 요소의 하위 집합 (Mash1, Math1, Ngn1 및 Ptf1a)는 LRL, 미래 연구 16-18의 과목에 precerebellar 신경 subtypes의 사양에 그들의 제안 및 / 또는 특징 역할로 인해 분석에 선정되었습니다. 이들 네 단백질은 E11.5 16-18에서 꼬리 hindbrain에서 매우 특징적인 표현 도메인이 있습니다. 우리는 문화를 배치했다 배아 크기가 증가하는 데 실패하며 맥락막 얼기의 상피와 E11.5 및 E12.5 5 사이에 발생 LRL 및 roofplate, 형태학의 이벤트 invagination 생산을 시작하는 데 실패했음을 관찰했다. 이러한 관찰을 바탕으로 그것이 태아의 정상적인 개발이 중지 또는 조잡한 지연과 교양 배아에 대한 비교 가능한 컨트롤 E11.5에 미개한 배아있을 것을 결정했다.
문화와 electroporation은 내생 단백질의 수준을 방해하지 않게하기 위해, 우리는 immunohistoch하여 네 가지 단백질을 분석electroporated 그리고 최소 24 시간을위한 다음 교양했다 34 다른 배아에 emistry (IHC). 표 전 보관 정상적인 단백질 수준. 그림 3은 대표 IHC 데이터를 보여주는 것으로 분석 각 마커와 배아의 비율에 대한 분석 배아의 수를 보여줍니다 단백질의 두 분석에서 Mash1 (그림 3A 및 3B)와 Math1 (그림 3C 및 3D). 우리는 E11.5 (그림 3A와 3C)에서 제어 배아에 비해 배아의 대부분은 표현에 따라 electroporation과 문화 (그림 3B 및 3D)의 정상 수준을 유지 것을 관찰했다. 중요한 것은, 이러한 단백질의 특성 표현 도메인은 perturbed되지 않았습니다.
1 그림. 회의 E11.5시 태아의 Electroporation. () 도식전자 electroporation 실험. E11.5의 배아는 격리되어 0.01 % 빠른 그린에서 플라스미드 표현식 번째 뇌실로 주입된다. 배아 그러면 전극 충격기의 어귀 사전 문화에 주입 이전 E11.5 배아의 (B) 화살 볼 수있게 된에 50 V 펄스를 받게됩니다. (C) 같은 E11.5의 배아는 0.01 % 빠른 그린에서 플라스미드의 주입에 따라. (D) GFP의 일방적 hindbrain 표현 문화의 24 시간에 따라 E11.5의 배아에서 관찰. 메가바이트-midbrain, 4V - 넷째 뇌실.
그림 2. Electroporated 조직에서 GFP의 표정은. () 왼쪽에있는 만화는 E11.5 배아 주위에 전극의 위치를 묘사. 중동 만화는 배아의 왼쪽에있는 플라스미드 인코딩 GFP의 이해와 표현을 묘사. 오른쪽에있는 만화는 내 덕분에 배아를 통해 촬영한 이상 형인 가로 섹션의 개략도이다evels는 중간 만화의 검정색 라인으로 표시. 문화의 24 시간 이후 electroporated E11.5의 배아를 통해 가로 섹션에 GFP를위한 (B-D) Immunohistochemistry. 화살표는 roofplate (RP) 어떤 트랩 이차 항체를 나타냅니다. 이미지 10X 배율로 촬영하고 있습니다. 표시된 섹션의 상대적인 수준은 ()의 중간 만화를 통한 가로선으로 표시됩니다. 메가바이트-midbrain, 리터 4V-넷째 뇌실, RP-roofplate.
그림 3. 로어 마름모꼴의 입술에 내생 단백질의 표현 Mash1 (A와 B) 또는 편대의 편대 장으로 electroporated 있었다 배아으로 (A, C) 교양 아니었 E11.5의 배아의 가로 섹션을 비교 Math1 (C와 D)에 대한 Immunohistochemistry. : : GFP, 24 시간 (B와 D)에 대한 교양. 이미지 10X 배율에서 찍은.
| Proneural Transcripti팩터에서 분석 | 태아의 수 분석 | 일반 표현식 패턴을 유지 비율 |
| Math1 | 15 | 86.7 % |
| Mash1 | 12 | 83.3 % |
| Ngn1 | 7 | 71.4 % |
| Ptf1a | 6 | 백퍼센트 |
LRL에서 정상 Proneural 전사 인자 도메인을 유지 Electroporated과 교양 태아의 표 I. 비율.
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Discussion
본 연구에서 제시된 시험 관내 electroporation 기술의 효율적 회임 12 일 이내에 젊은 배아에서 유전자 발현을 조작하는 데 활용할 수있는 새로운 방법입니다. 문화에 대한 태아의 위치는 도입 유전자의 표현을 허용하고 electroporated 배아는 생체내에 남아 허용하는 경우 주죠 지켜 circumvents. 이 기술은 electroporation 기반의 연구 이전에 액세스할 수있었습니다 배아 progenitors에서 유전자 발현의 조작을 허용합니다.
배아의 80 %에서 도입 유전자의 효율적인 표현으로 이어지는 electroporation 기술은 분석했다. 으로 electroporated 조직의 범위는 이산 지역에 지역화된입니다 그림 2에서 관찰했다. 특별히 electroporation을 위해 특정 hindbrain 지역을 타겟으로하기 위해서는 전극이의 위치를 이렇게 지배로 신중을 삽입되어야합니다조직을 ffected. 지느러미 배아 hindbrain의 하단 마름모꼴의 입술을 원하는 경우 심폐들이 직접 번째 뇌실 개구의 가장 넓은 부분을 측면되는 그러한 장소 여야합니다. 신경 튜브의 한쪽에 대한 일방적인 표현을 원하는 경우 다음 배아는 신경 튜브의 축 '노'평행이라는 같은 전극 사이에 위치해야합니다. 배아의 기울이기 부적 절한 타겟팅 및 / 또는 양자 표현이 발생할 수 있습니다. 이건 그 이해 electroporated DNA를 세포의 비율을 증가 하듯이보다 electroporation 효율을 달성하기 위해 최적화에 하나 electroporation 전압을 변경할 수 있습니다. 하나도 추가로 DNA의 주식을 집중 수 있습니다. 신경 튜브에만 액체의 작은 볼륨을 수용할 수 있듯이,보다 집중적으로 샘플 electroporation시 세포에 도입 플라스미드의 양을 늘려야합니다. 마지막으로, 하나는 '노'의 직경을 변경할 수 있습니다. 하나는 소규모를 대상으로 원한다면d 개 지역화된 영역 외륜 크기를 감소하는 것이있을가 있습니다.
hindbrain 유전자 발현 조작하는데이 기술의 유틸리티에 중요한는 배아의 electroporation과 문화에 따라 정상적인 유전자와 단백질 발현 패턴의 유지이다. 그림 3과 표 I에 문서화되어 정상적인 proneural 전사 인자 수준과 패턴이 잘 배아의 83 %가 Mash1을 표명 분석 유지됩니다, 86%은 Math1을 표명하고, 100 % Ptf1a을 표명했다. 다른 전사 요인 assayed로 Ngn1의 수준은 아니라 robustly (71 %) 유지되지 않았다. 그것이 특정 전사 인자는 부정적인 electroporation 문화와 절차에 의해 영향을받는 것이 가능하지만 우리는 대안적 설명이있다는 것을 믿습니다. 그것은 지느러미 hindbrain의 Ngn1 표현 배아 일 (E) 12.5 16에 의해 사라지는 수준으로 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났습니다. 그 P을 감안할 때Ngn1을 표현 배아의 ercentage는 지느러미 Ngn1의 표현에 결함있는 태아의 30 % 이상의 부분으로 진행했을 가능성이 평가된 다른 단백질 (83 % 또는 이상)에 대한 일반적인 표현을 유지보다 낮은 E11.5에서 수확과 문화에 배치 후 Ngn1 표현 24 시간을 끄는 정상적인 발달 프로그램입니다. 이것은 E11.5와 E12.5 사이에 지느러미 hindbrain에서 발생하는 분자 변화가 배아의 부분에 발생할 수 암시하지만, 비동기 또는 지연 기간에 그렇게 않습니다. 이것은 미래 연구에 공로 자세한 분석을 찾는지만,이 분석에 대한 열정을 축소하지 않습니다. 배아는 정상적인 발달 동안 발생하는 분자 변화를 겪고지도 모른다는 가능성도이 기법을 활용하여 연구의 결과를 해석하는 방법을 알려야한다.
최적화된 electroporation의 변화와 문화 조건 번째로 표시학습이 가능합니다. 그것은 50 V는 조직 통합에 대한 최소한의 방해와 electroporated 유전자의 강력한 이해 준 것으로 나타났습니다. electroporations에 대한 전압은 각 실험자의 요구에 이러한 분석을 세부적으로 조정할에 순서대로 수정할 수 있습니다. 문화 조건은 직접 12 잘 플레이트에서 문화 매체 (위에서 설명한)에 배치되었다 배아에 최적화되었습니다. 이 기법은 12도 접시의 언론으로 배치되며, 멤브레인 (Costar)에 배아를 배치하여 수정할 수 있습니다. culturing 기법의 최적화 중에이 변형을 시도했습니다하지만 electroporated 유전자 발현이나 정상적인 유전자 발현 패턴의 보존에 어느 상당히 실험 결과에 영향을 나타나지 않았다.
이 연구는 24 시간 동안 culturing의 배아에 집중했다. 태아도 24 시간에서 변경되고 미디어를 48 시간을 위해 배양해 왔습니다. 그것은 조직의 무결성 오래 같이 거부된 것으로 나타났다어 보육 시간이지만 electroporated GFP 표현 발견 될 수 있습니다. 긴 배양 시간 (지난 48 HR)의 경우는 필요한 변화 문화 조건이 될 수도 있고 가능성이 앞으로 수사의 대상이 될 것입니다.
문화 분석의 최적화 중에는 미디어 환경에 신경 튜브보다 노출을 가지고 배아에서 개선 내생 유전자 발현의 유지를 찾았습니다. 이러한 연구는 이것이 문화에 배치하기 전에 배아의 꼬리 부분에있는 4 번째 뇌실의 roofplate 및 제거 필요없는 조직의 주사에 의해 달성되었다. microdissected 신경 튜브가 성공적으로 이러한 조건에서 배양해 수있다면 미래 연구 조사합니다.
이 연구 회임의 11.5 일 (E11.5)에서 배아의 electroporation에 집중했다. 향후 방향은 개발의 초기 단계에 대한 기술을 최적화하는 것입니다. 우리는 배아에서이 기법을 사용했을E10.5에서 수확한 우리는 배아의 큰 숫자를 축적하고 분석 아직 남아있을 때 우리는 GFP와 culturing 배아를 소개에서 성공을 보았다. 깊이 진학에 이상이 연구에 사용된 기술은 젊은 배아에 적용할 수있다는 확신을 할 필요가있을 것이다. 그것은 E10.5 이상의 배아는 어린 electroporate하는 것이 가능 할지도 모르지만 그것은 시도되지 않았습니다.
이 기법의 기능적인 애플 리케이션들은 단백질 제품 LRL과 다른 신경 subtypes의 생산에 중요한 있는지 조사하는 유전자의 기능을 overexpress 또는 아래로 노크 될 수 있습니다. 이 기술을 향후 실험 E11.5에서 LRL에서 생산되는 것으로 알려져 다른 신경 subypes의 운명을 변경할 proneural 전사 요소의 도입에 초점을 것입니다. 기술도 적극적으로 E11.5에서 뉴런을 생산하는 다른 neuroepithelial 지역을 대상으로 적응 수 있습니다.
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Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자 Math1, Ngn1 위해 제인 존슨 감사 드리고, 그리고 Ptf1a의 항체와 pCAG위한 코니 Cepko :: GFP 플라스미드 것이다. 이 작품은 NIH R15 1R15HD059922-01에 의해 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
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