Summary
Deze studie beschrijft de ontwikkeling van een
Abstract
De ruitvormige lip is een embryonale neuroepithelium in de achterhersenen op het knooppunt tussen de neurale buis en het dak zelf van het vierde ventrikel (beoordeeld in 1). De ruitvormige lip kan worden onderverdeeld in de bovenste ruitvormige lip (URL), die rhombomere 1 (R1) omvat en genereert neuronen van het cerebellum en de onderste ruitvormige lip (LRL) die aanleiding geeft tot diverse neuronale hersenstam lijnen 2-4. LRL derivaten omvatten de auditieve neuronen van de slakkenhuis kernen en die van de precerebellar kernen die betrokken zijn bij de regulering evenwicht motorbesturing 5-8. Neurogenese van de LRL optreedt over een grote tijdelijke venster dat embryonale dagen (E) 9.5-16.5 5, 9 omvat. Verschillende neuronale lijnen komen uit de LRL als postmitotische cellen (of zijn geboren) in verschillende ontwikkelings-dagen tijdens deze neurogene venster.
Elektroporatie van genexpressie constructen kunnen worden gebruiktmanipuleren genexpressie in LRL voorlopers en kan mogelijk veranderen het lot van de neuronen uit deze regio 10-12. Het veranderen van genexpressie van LRL voorlopercellen in de muis via de in de baarmoeder elektroporatie is zeer succesvol gebleken voor het manipuleren van lineages geboren op embryonale dag E12.5 of later 10, 12-14. In utero electroporations voorafgaand aan E12.5 zijn vooral succesvol vanwege de letaliteit geassocieerd met aanprikken van de vierde ventrikel dak zelf, een noodzakelijke stap in het leveren van exogene DNA dat wordt geëlektroporeerd in de LRL. Echter, veel LRL afgeleid lijnen komen voort uit de LRL eerder dan E12.5 9. Deze eerder geboren lijnen zijn de neuronen die de laterale reticulaire omvatten, externe cuneate, en inferieure olivaris kernen van de precerebellar systeem met als functie het input van het ruggenmerg en de hersenschors verbinden met de kleine hersenen 5. Om uitdrukking in de LRL te manipulerenvan embryo's jonger dan E12.5, ontwikkelden we een in vitro systeem waarin embryo's worden in de cultuur geplaatst na elektroporatie.
Deze studie geeft een efficiënte en effectieve methode voor het manipuleren van de genexpressie van LRL voorlopercellen op E11.5. Embryo's geëlektroporeerd met groen fluorescerend eiwit (GFP) verdreven uit de over het algemeen actieve CAG promotor reproduceerbaar uitgedrukt GFP na 24 uur van de cultuur. Een cruciaal aspect van deze test is dat de genexpressie wordt alleen gewijzigd als gevolg van de expressie van het exogene gen en niet omwille van secundaire effecten die het gevolg zijn van de elektroporatie en het kweken technieken. Er werd vastgesteld dat de endogene genexpressie patronen ongestoord blijft geëlektroporeerde en gekweekte embryo's. Deze test kan worden gebruikt om het lot van cellen die uit de LRL van embryo's jonger dan E12.5 door de introductie van plasmiden voor overexpressie te wijzigen of knock down (door middel van RNAi) van verschillende pro-neurale transcriptiefactoren.
Protocol
1. Preparaten Voor elektroporatie
- Amplify het DNA voor elektroporatie met een maxi prep (Prime-It of Qiagen). De concentratie van de DNA moet minimaal 1 mg / ml voor een efficiënte opname zijn.
- Verwijder 495 pi van DNA en meng met 5 pi 0,01% Fast Green in een X PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) in een microcentrifugebuisje.
2. Embryonale Harvest
- Stel getimede paringen van CD-1 muizen (Harlan). Controleer op de aanwezigheid van vaginale stekkers en beschouwen de datum waarop een vaginale plug wordt waargenomen als embryonale dag (E) 0,5. Embryo's worden geoogst 11 dagen na het visualiseren van plug (E11.5).
- Plaats gesteriliseerde instrumenten in 70% ethanol. Behandel een laminaire stroming kap met UV licht gedurende minstens een uur voor gebruik. Buiskap, ontleden lade en ontleden van omvang met 70% ethanol. Verwarm 1 X PBS tot 37 ° C.
- Op E11.5 euthanaseren de vrouwelijke volgens de voorwaarden die zijn goedgekeurd door het Institutional Comite voor de zorg en het gebruik van dieren (ICCUA). Plaats ontleden lade in het laminaire stroming kap. Spuit het achterlijf van het vrouwtje met 70% ethanol.
- Open de buikholte en speld de muren tot de ontleden lade. Trek de baarmoederhoorns, zodat het rust in de buikholte.
- Knip voorzichtig openen de wand van de baarmoeder hoorn. Gebruik een 20 mm lepel (Fijn wetenschappelijke instrumenten) om de embryo verwijder voorzichtig in de dooierzak weg van de placenta. Plaats embryo's in een 100 mm weefselkweek schotel voorgevuld met 10 ml steriel 1 X PBS dat werd voorverwarmd in 2.2.
- Herhaal dit voor alle embryo's aanwezig.
3. Elektroporatie van E11.5 embryo's (Figuur 1)
- Een 20 mm Schep eerste embryo een nieuwe 100 mm schaal voorgevuld met 10 ml steriele 1XPBS die voorverwarmd was tot 37 ° C.
- Gebruik 11 cm pincet met een 0,05 x 0,02 mm tip (Fijn wetenschappelijke instrumenten) om zorgvuldig opnieuwbewegen en gooi de dooierzak.
- Plaats embryo zodat de rugzijde naar boven, zodat het lijkt op de cartoon in figuur 1A. Gebruik 7 mm elektrode paddles (Harvard Apparatus) om voorzichtig te houden van de embryo. De elektroden moeten worden geplaatst aan weerszijden van de neurale buis ter hoogte van de achterhersenen vierde ventrikel. Het ventrikel is zichtbaar met het blote oog, maar met behulp van een dissectie microscoop kan vergemakkelijken nauwkeurige paddle plaatsing. Plaatsing van de peddels is cruciaal voor het bepalen van de regio die de geëlektroporeerde DNA ontvangt. Als het onderste rhombische lip (LRL) van het dorsale embryonale achterhersenen gewenst is moet schoepen zijn zodanig plaats, dat deze rechtstreeks het breedste deel van het vierde ventrikel opening flankerende.
- Gebruik een 1 cc injectiespuit met het opstellen van het plasmide DNA gemengd met 0,01% snel groen. 500 pi van het mengsel voldoende zijn voor de elektroporatie van ten minste 8-10 embryo's (zie 3.5).
- Voorzichtig doorboren het dak zelf overlying de vierde ventrikel met een 25G 5/8 tuberculine naald aan de 1 cc spuit en injecteer het DNA-kleurstof mengsel in het ventrikel. Succesvolle injecties worden gekenmerkt door de DNA-kleurstof mengsel vult de gehele ventrikelsysteem (figuur 1c). De hoeveelheid DNA-kleurstof mengsel gewoonlijk geïnjecteerd minder dan 50 microliter. Exacte bedragen variabel tussen embryo als een deel van het mengsel meestal weglekken ventrikel in het PBS rondom het embryo. Een alternatieve middel van het leveren van de DNA-kleurstof mengsel zou zijn door de toegang tot het ventriculaire systeem door aanprikken van de velum bovenop de middenhersenen. Opnieuw worden succesvolle injecties gekenmerkt door de DNA-kleurstof mengsel vult de gehele ventriculaire systeem.
- Lever vijf vierkante pulsen met behulp van een elektrische puls generator (BTX) en 7 mm elektrode peddels. Elke puls is 50 V duurzaam 5 ms per puls van 500 ms tussen elke puls. Het weefsel het dichtst bij de positief geladen elektrode zal dan TakE t het plasmide.
4. Cultuur van embryo's
- In een laminaire stroming kap vult de buitenste putjes van een 12 goed kweekschaal met 2 ml DMEM/F12 media aangevuld met 10% foetaal runderserum, 5% paarden serum, 1% glutamine, 1% penicilline / streptomycine dat werd voorverwarmd tot 37 ° C. De kweekomstandigheden zijn overgenomen van de Diego en collega's. 15
- In laminaire stroming kap snufje embryo's op buik (onder het hart) met een pincet en verwijder achterste deel van de embryo. Plaats het voorste gedeelte in een van de gevulde putten van de 12-well cultuur schotel.
- Herhaal dit voor alle embryo's. Vul alleen de buitenste putjes van de 12-well plaat om verontreiniging van culturen voorkomen.
- Culture embryo's in een 37 ° C incubator met 5% CO2. Expressie van het geëlektroporeerde plasmide moet worden waarneembaar binnen 24 uur.
- Indien meer cultuur tijden te wensen over, vul het uit putten van een nieuwe 12 wells-plaat met 2 mlde media gebruikt in 4.1. Met een gesteriliseerde lepel over te dragen de embryo's tot een goed in de nieuwe plaat. Plaats terug in de 37 ° C incubator. Cultuur voor maximaal 48 uur is mogelijk.
- Als de gewenste cultuur van de tijd is bereikt, vast embryo's voor analyse (zie hieronder).
5. Voorbereiding van embryo's voor analyse
- Spoel embryo 1 X PBS bij 4 ° C gedurende vijf minuten. Herhaal.
- Fix embryo voor de analyse van 2% paraformaldehyde (PFA) in 1XPBS gedurende 2 uur bij 4 ° C.
- Spoel embryo 1 X PBS bij 4 ° C gedurende vijf minuten. Herhaal.
- Evenwicht embryo in 30% sucrose in een X PBS gedurende de nacht bij 4 ° C.
- Embedden embryo's in optimale Cutting Temperatuur (LGO) verbinding met een droogijs / ethanol bad. Embryo's kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Sectie embryo's op een cryostaat (Leica) in 30 micrometer secties en monteren op dia's (VWR, Superfrost Plus). Bewaren bij -20 ° C.
6. IMMUnohistochemistry Analyse
- Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals beschreven in 16. Primaire antilichaam verdunningen gebruikt voor dit onderzoek zijn onder andere konijn α-GFP (Invitrogen) 1:2500; muis α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; konijn α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; konijn α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; konijn-Math1 (Jane Johnson) 1:100. Incubeer glijbaan vlak, monster naar boven op een kleuring lade bij 4 ° C gedurende de nacht.
- Dia's werden geanalyseerd op een samengestelde microscoop (Olympus BX51).
7. Representatieve resultaten
Een schematisch in fig. 1A toont de elektroporatie experiment. Figuur 1B toont een aanzicht van een sagittaal E11.5 embryo voor manipulatie. Dezelfde embryo na injectie van het plasmide bevattende CAG :: GFP in 0,01% Fast Green is in figuur 1C en een representatief losgemaakte embryo vertoont GFP eenzijdigeuitdrukking in de dorsale achterhersenen 24 uur volgende cultuur in figuur 1D. De omvang van het gebied van de LRL dat succesvol geëlektroporeerd is variabel en lijkt sterk afhankelijk positionering van de elektroden. In onze onderzoeken werd gevonden dat 52 van 65 (80%) van de geëlektroporeerde embryo succes GFP uitgedrukt. Tissue geacht met succes geëlektroporeerd als het positief GFP in gelokaliseerde gebieden over verschillende secties na fixatie en immunohistochemische analyse (zie hierna). Embryo's die niet aan deze criteria voldoen werden gescoord als niet geslaagde pogingen tot elektroporatie.
Verdere beoordeling van elektroporatie efficiency kan worden vastgesteld door het uitvoeren immunohistochemie tegen GFP op dwarsdoorsneden van geëlektroporeerde embryo's op het niveau van de vierde kamer. Figuur 2 representatief seriële secties van een embryo weergegeven eenzijdigeGFP expressie. Figuur 2A toont een geïdealiseerd schema dat illustreert dat de linkerzijde van de embryo richting van de positieve elektrode. Dwarsprofielen (op een niveau gerepresenteerd door de middelste tekening van figuur 2A) blijkt gelokaliseerde GFP expressie uitsluitend aan de linkerkant van de achterhersenen weefsel (Figuren 2C en 2D). De geëlektroporeerde gebied van de LRL niet vergroten de gehele anterior-posterior as van de neurale buis onderzoek secties 300 pm rostraal of meer van die getoond in figuur 2C niet expliciet GFP (Figuur 2B).
Het nut van deze assay voor manipulatie van genexpressie afhankelijk is van de stabiliteit van de expressie gebieden voor de endogene eiwitten. De LRL wordt gekenmerkt als met hun eigen unieke voorlopercellen domeinen gekenmerkt door de differentiële expressie van proneural transcriptiefactoren (herzien in 1).Een subgroep van deze factoren (Mash1, Math1, Ngn1 en Ptf1a) werden gekozen voor analyse door hun voorgestelde en / of gekenmerkt rol in de specificatie van precerebellar neurale subtypes in de LRL, een onderwerp van toekomstige studies 16-18. Alle vier de eiwitten hebben een zeer karakteristieke uitdrukking domeinen in het caudale achterhersenen op E11.5 16-18. We zagen dat embryo's die werden geplaatst culturen niet in omvang toenemen en ook niet aan de productie van choroïdplexus epitheel en invaginatie van de LRL en dak zelf, morfologische gebeurtenissen die plaatsvinden tussen E11.5 en E12.5 5 te initiëren. Op basis van deze observaties werd vastgesteld dat de normale ontwikkeling van deze embryo's werd gestopt of grove vertraagd en de vergelijkbare controle voor de gekweekte embryo's onbeschaafde embryo's zijn op E11.5.
Om ervoor te zorgen dat cultuur en elektroporatie niet het niveau van endogene eiwitten verstoren, hebben we vier verschillende eiwitten geanalyseerd door immunohistochemistry (IHC) in 34 verschillende embryo's werden geëlektroporeerd en gekweekt gedurende minimaal 24 uur. Tabel I toont het aantal embryo geanalyseerd voor elke marker en het percentage van de embryo geanalyseerd om vastgehouden normale eiwitgehalte. Figuur 3 representatieve gegevens blijkt IHC van twee van de eiwitten geanalyseerd Mash1 (Figuren 3A en 3B) en Math1 (figuren 3C en 3D). We hebben vastgesteld dat het merendeel van de embryo normale niveaus van expressie na elektroporatie en cultuur (figuren 3b en 3d) gehandhaafd vergeleken met de controle embryo's in E11.5 (Figuren 3A en 3C). Belangrijker, het kenmerk expressie domeinen van deze eiwitten niet verstoord.
Figuur 1. Elektroporatie van embryo's op E11.5. (A) Schematische weergave van ee elektroporatie experiment. Een E11.5 embryo wordt geïsoleerd en het expressieplasmide in 0,01% Fast Green wordt geïnjecteerd in de vierde kamer. De embryo wordt geflankeerd door elektrode schoepen en onderworpen aan een 50 volt puls voor plaatsing in cultuur (B) Sagittaal aanzicht van een E11.5 embryo voor injectie. (C) dezelfde E11.5 embryo na injectie van plasmide in 0,01% Fast Green. (D) Eenzijdige achterhersenen expressie van GFP waargenomen in E11.5 embryo na 24 uur van de cultuur. mb-middenhersenen, 4V-vierde ventrikel.
Figuur 2. Expressie van GFP in geëlektroporeerd Tissue. (A) De strip links toont de plaatsing van elektroden rond een E11.5 embryo. Midden cartoon toont opname en weergave van plasmide dat codeert GFP links van het embryo. Beeldverhaal over rechts is schema van een geïdealiseerde dwarse doorsnede genomen door het embryo op levels aangegeven met zwarte lijnen in het midden cartoon. (B-D) Immunohistochemie voor GFP op dwarsdoorsneden door middel van een geëlektroporeerde E11.5 embryo na 24 uur van de cultuur. Pijlen geven het dak zelf (rp), die vallen het secundaire antilichaam. Beelden worden genomen op 10x vergroting. De relatieve niveau van de getoonde secties worden weergegeven door de horizontale lijnen door het midden cartoon (A). mb-middenhersenen; l 4V-vierde ventrikel; rp-dak zelf.
Figuur 3. Expressie van endogene eiwitten in de onderste lip Rhombic Immunohistochemie van Mash1 (A en B) of Math1 (C en D) het vergelijken dwarsdoorsneden van E11.5 embryo's die niet waren gekweekt (A, C) met embryo's werden geëlektroporeerd met CAG.: : GFP en gekweekt gedurende 24 uur (B en D). Foto genomen op 10x vergroting.
| Proneural TranscriptiAnalyse van de Factor | Aantal embryo's Analyzed | Percentage behouden Normaal expressiepatronen |
| Math1 | 15 | 86,7% |
| Mash1 | 12 | 83,3% |
| Ngn1 | 7 | 71,4% |
| Ptf1a | 6 | 100% |
Tabel I. Percentage geëlektroporeerd en gekweekt embryo's behouden Normaal Proneural Transcriptie Factor Domeinen in de LRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De in vitro elektroporatie techniek die in deze studie is een nieuwe methodiek die efficiënt kan worden om de genexpressie te manipuleren gebruikt in embryo's jonger dan 12 dagen van de dracht. Plaatsing van de embryo's in de cultuur maakt de expressie van het geïntroduceerde gen zijn en is de letaliteit waargenomen wanneer geëlektroporeerde embryo's mogen blijven in vivo. Deze techniek maakt het mogelijk om manipulatie van genexpressie in embryonale voorlopers die voorheen niet toegankelijk voor elektroporatie op basis van studies.
De elektroporatie techniek resulteerde in efficiënte expressie van het geïntroduceerde gen in 80% van de embryo geanalyseerd. Zoals in figuur 2 de mate van geëlektroporeerde weefsel is gelokaliseerd op discrete gebieden. Om het bijzonder een bepaalde achterhersenen gebied richten voor elektroporatie de elektroden worden geplaatst zorgvuldig deze regelt de locatie van eenffected weefsel. Als de onderste lip van de ruitvormige dorsale embryonale achterhersenen gewenst is moet schoepen zijn zodanig plaats, dat deze rechtstreeks het breedste deel van het vierde ventrikel opening flankerende. Als expressie eenzijdige aan een zijde van de neurale buis gewenst dan het embryo te worden geplaatst tussen de elektroden zodanig dat de as van de neurale buis evenwijdig aan de schoepen. Kantelen van het embryo kan leiden tot onjuiste targeting en / of bilaterale expressie. In het optimaliseren van een betere elektroporatie efficiëntie te bereiken zou men kunnen variëren de elektroporatie spanning als dit kan het aandeel van de cellen die de opname van de geëlektroporeerde DNA te verhogen. Men kan ook verder concentreren DNA voorraden. Als neurale buis is alleen geschikt een klein volume vloeistof, meer geconcentreerde monsters de hoeveelheid plasmide in de cellen na elektroporatie. Ten slotte kan een verandering van de diameter van de schoepen. Wil men een kleinere streven naar eend meer gelokaliseerd gebied is het misschien het beste om de peddel te verkleinen.
Van cruciaal belang voor de bruikbaarheid van deze techniek in het manipuleren van achterhersenen genexpressie is het behoud van normale gen en eiwit expressie patronen na elektroporatie en cultuur van embryo's. Zoals vermeld in figuur 3 en tabel I, normaal proneural transcriptiefactor niveaus en patronen goed behouden 83% van de embryo's geanalyseerde Mash1 uitgedrukt, 86%, uitgedrukt Math1, en 100% uitgedrukt Ptf1a. Niveaus van Ngn1 niet als stevig vastgehouden (71%) als de andere transcriptiefactoren getest. Hoewel het mogelijk is dat dit transcriptiefactor nadelig wordt beïnvloed door de elektroporatie en cultuur procedure wij dat er een andere verklaring. Gebleken is dat Ngn1 expressie in de dorsale achterhersenen vermindert de tijd, met niveaus verdwijnen door embryonale dag (E) 12,5 16. Aangezien de pERCENTAGE embryo tot expressie Ngn1 lager dan behouden normale expressie van de onderzochte andere eiwitten (83% of hoger) is het mogelijk dat althans een deel van de 30% van embryo die deficiënt zijn in de expressie van dorsale Ngn1 gevorderd in de normaal ontwikkelings-programma, uit te schakelen Ngn1 expressie 24 uur na de oogst op E11.5 en plaatsing in de cultuur. Dit suggereert dat de moleculaire veranderingen die optreden in de dorsale achterhersenen tussen E11.5 en E12.5 kunnen optreden in een deel van de embryo's, maar daarbij op een asynchrone of vertraagde tijd. Deze bevinding verdient verdere analyse in toekomstige studies, maar doet niets af aan het enthousiasme voor deze test. De mogelijkheid dat embryo's zouden kunnen moleculaire veranderingen die optreden tijdens de normale ontwikkeling ondergaat ook moeten informeren over hoe de resultaten van studies gebruik te maken van deze techniek worden geïnterpreteerd.
Variaties op de geoptimaliseerde elektroporatie en cultuur voorwaarden die in ewordt studie mogelijk. Het bleek dat 50 V een robuuste opname van de geëlektroporeerde gen met minimale verstoring van weefselintegriteit gaf. De spanning van de electroporations kunnen worden gemodificeerd om deze assay afstemmen van de behoeften individuele experimentator. De kweekomstandigheden zijn geoptimaliseerd op embryo's die rechtstreeks in de cultuur media (hierboven beschreven) geplaatst in een 12-wells plaat. Deze techniek kan worden gewijzigd door het plaatsen van het embryo op een membraan (Costar) dat is geplaatst in de media van een 12-wel plaat. Tijdens het optimaliseren van de techniek het kweken van deze variant is geprobeerd, maar het ook niet lijken te significante invloed op de experimentele resultaat in geëlektroporeerde genexpressie of het behoud van normale gen expressie patronen.
Dit onderzoek richtte zich op het kweken van embryo's voor 24 uur. Embryo's gekweekt tot 48 uur met de media worden gewijzigd in 24 uur. Het bleek dat de integriteit van het weefsel af met langere incubatietijden maar expressie van geëlektroporeerde GFP kan worden gedetecteerd. Voor langere incubatie tijd (afgelopen 48 uur) kan het noodzakelijke verandering van de cultuur voorwaarden en zal waarschijnlijk het onderwerp van toekomstig onderzoek.
Bij optimalisatie van de cultuur assay werd vastgesteld dat behoud van endogene genexpressie verbeterd embryo's grotere blootstelling aan de neurale buis om het hele medium was. In deze studies werd dit bereikt door het aanprikken van de 4 e ventrikel dak zelf en de verwijdering vreemde weefsel in het caudale deel van het embryo voorafgaand aan plaatsing in cultuur. Toekomstige studies zullen onderzoeken of gemicrodissecteerde neurale buis met succes kan worden gekweekt onder deze omstandigheden.
Dit onderzoek richtte zich op elektroporatie van embryo's op 11,5 dagen van de dracht (E11.5). Een toekomstige richting zou zijn om de techniek te optimaliseren voor eerdere stadia van ontwikkeling. Wij hebben deze techniek embryogeoogst op E10.5 en terwijl we nog moeten verzamelen en analyseren van een groot aantal embryo's hebben we gezien het succes bij de invoering van GFP en het kweken van de embryo's. Een meer in de diepte verder onderzoek nodig zou zijn om met zekerheid zeggen dat de techniek die gebruikt wordt in deze studie kan worden toegepast bij jongere embryo's. Het is misschien mogelijk om electroporate embryo's jonger dan E10.5, maar het is nog niet geprobeerd.
Een functioneel toepassing van deze techniek kan tot overexpressie of neer te slaan de functie van genen te onderzoeken of de eiwitten zijn essentieel voor de productie van verschillende subtypes van neurale LRL. Toekomstige experimenten met deze techniek zal zich richten op de introductie van proneural transcriptiefactoren om het lot van de verschillende neurale subypes bekend worden geproduceerd uit de LRL op E11.5 wijzigen. De techniek kan tevens worden aangepast aan andere neuro gebieden die actief neuronen die ten E11.5 gericht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Jane Johnson bedanken voor de Math1, Ngn1 en Ptf1a antilichamen en Connie Cepko voor de pCAG :: GFP plasmide. Dit werk werd gefinancierd door NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
