Summary
Denne undersøgelse beskriver udviklingen af en
Abstract
Den rombiske læbe er en embryonisk neuroepitel placeret i baghjerne ved forbindelsen mellem neuralrøret og roofplate af den fjerde ventrikel (gennemgået i 1). Den rombiske læbe kan inddeles i den øvre rombisk læbe (URL), der omfatter rhombomere 1 (R1) og genererer neuroner i cerebellum og det nedre rombisk læbe (LRL), hvilket giver anledning til forskellige neuronale hjernestamme linier 2-4. LRL derivater omfatter de auditive neuroner i den cochleare kerner og de i precerebellar kerner, der er involveret i reguleringen af balance og motorisk kontrol 5-8. Neurogenese fra LRL sker over et stort tidsmæssig vindue, omfatter embryoniske dag (E) 9,5 til 16,5 5, 9. Forskellige neuronale slægter komme fra LRL som postmitotiske celler (eller er født) under forskellige udviklingsmæssige dage i løbet af denne neurogen vindue.
Elektroporering af genekspression konstrukter kan anvendes tilmanipulere genekspression i LRL stamfædre og kan potentielt ændre skæbnen for de neuroner fremstillet af denne region 10-12. Ændring genekspression af LRL stamfædre i musen via in utero elektroporation har været meget vellykket for at manipulere slægter født på fosterdag E12.5 eller senere 10, 12-14. In utero elektroporeringer forud for E12.5 har tabt sagen primært som følge af dødelighed i forbindelse med punktering den fjerde ventrikel roofplate, et nødvendigt skridt i at levere eksogene DNA, der er elektroporeres ind LRL. Imidlertid mange LRL afledt slægter skyldes LRL før E12.5 9. Disse tidligere født slægter indbefatter neuroner, der omfatter laterale retikulære, ekstern cuneate og ringere olivary kerner af precerebellar system, som fungerer til at forbinde input fra rygmarven og cortex af cerebellum 5. For at manipulere ekspression i LRLembryoner yngre end E12.5, udviklede vi en in vitro system, hvor embryoer anbragt i kultur efter elektroporering.
Denne undersøgelse viser en effektiv fremgangsmåde til manipulering af genekspression af LRL progenitorer ved E11.5. Embryoer elektroporeret med grønt fluorescerende protein (GFP) drevet fra bredt aktive CAG promotor reproducerbart udtrykt GFP efter 24 timers dyrkning. Et kritisk aspekt af dette assay er, at genekspression kun ændres på grund af ekspressionen af det eksogene gen og ikke på grund af sekundære virkninger, som skyldes elektroporering og dyrkningsteknikker. Det blev fastslået, at de endogene genekspressionsmønstre forblive uforstyrret i elektroporerede og dyrkes embryoner. Dette assay kan anvendes til at ændre skæbne af celler, der følger LRL af embryoner yngre end E12.5 ved indførelse af plasmider til overekspression eller vælte (gennem RNAi) af forskellige pro-neurale transkriptionsfaktorer.
Protocol
1. Forberedelser før Elektroporation
- Forstærk den DNA for elektroporation af en maxi Prep (Prime-It or Qiagen). Koncentrationen af DNA bør være mindst 1 mg / ml til effektiv optagelse.
- Fjernelse 495 pi DNA og blandes med 5 pi af 0,01% Fast Green i 1 X PBS (phosphatpufret saltvand) i et mikrocentrifugerør.
2. Embryonale Harvest
- Etablere timede parringer af CD-1 mus (Harlan). Kontrollere for tilstedeværelsen af vaginale propper og betragter det tidspunkt en vaginal prop observeret som embryonisk dag (E) 0,5. Embryoner vil blive høstet 11 dage efter at visualisere stik (E11.5).
- Anbring steriliseret værktøjer i 70% ethanol. Behandling af en laminar strømningshætte med UV-lys i mindst en time før brug. Sprayhood, dissekere bakke, og dissekere omfang med 70% ethanol. Forvarme 1 X PBS til 37 ° C.
- På E11.5 aflive den kvindelige henhold til betingelser, der er godkendt af Institutional udvalg for Pleje og anvendelse af dyr (ICCUA). Anbring dissekering bakken i laminar strøm-hætte. Sprøjt ned i maven af hun med 70% ethanol.
- Åbn bughulen og ben væggene til dissekere bakken. Træk de uterine horn, således at det hviler i den peritoneale kavitet.
- Forsigtigt skåret åbne væg livmoderhorn. Brug en 20 mm ske (fine videnskabelige værktøjer) til forsigtigt at fjerne foster i blommesækken væk fra placenta. Sted embryoer i en 100 mm vævskulturskål forfyldt med 10 ml steril 1 X PBS, der var forvarmet i 2.2.
- Gentag for alle embryoner til stede.
3. Elektroporering af E11.5 embryoer (figur 1)
- Ved anvendelse af en 20 mm ske, overfører den første fosteret til en ny 100 mm skål forfyldt med 10 ml sterile 1XPBS der var forvarmet til 37 ° C.
- Brug 11 cm tang med en 0,05 x 0,02 mm spids (fine videnskabelige værktøjer) til grundigt reflytte og kasseres blommesækken.
- Position foster, således at dens dorsale side vender opad, så det ligner den tegneserie i figur 1A. Brug 7 mm elektrode pagajer (Harvard Apparatus) til forsigtigt at holde fosteret. Elektroderne skal være anbragt på hver side af neuralrøret på niveau med den baghjerne fjerde ventrikel. Ventriklen er synlig for det blotte øje, men under anvendelse af en dissektion mikroskop kan lette nøjagtig paddle placering. Positionering af skovlene er kritisk for at bestemme det område, der modtager den elektroporerede DNA. Hvis den nedre rombisk læbe (LRL) af den dorsale embryoniske baghjerne ønskes, skal skovlene være plads, således at de umiddelbart flankerer den bredeste del af den fjerde ventrikel åbning.
- Brug en 1 ml sprøjte til at udarbejde plasmid-DNA blandet med 0,01% Fast Green. 500 pi af blandingen bør være tilstrækkelig til elektroporering af mindst 8-10 embryoer (se 3.5).
- Forsigtigt punktere roofplate overlying den fjerde ventrikel med en 25G 5/8 tuberkulin nål fastgjort til en cc sprøjte og injiceres DNA-farvestofblanding i ventriklen. Vellykkede injektioner er karakteriseret ved DNA-farvestofblanding fylder hele ventrikulære system (figur 1C). Mængden af DNA-farvestofblanding indsprøjtes typisk er mindre end 50 pi. Nøjagtige mængder varierer mellem embryoer som en del af blandingen tendens til at sive ud af ventriklen i PBS, der omgiver embryo. En alternativ måde at levere DNA-farvestofblanding ville være gennem adgang det ventrikulære system ved at punktere velum overliggende midterhjernen. Igen er succesfulde injektioner kendetegnet ved DNA-farvestofblanding fylder hele ventrikulære system.
- Levere fem firkantede impulser med en elektrisk impuls generator (BTX) og 7 mm elektrode skovlene. Hver impuls er 50 V varig 5 ms impuls med 500 ms mellem hver puls. Vævet nærmest positivt ladet elektrode vil derefter tae op plasmidet.
4. Dyrkning af embryoner
- I en laminar strømningshætte, fylde de ydre brønde i en 12-brønds dyrkningsplade med 2 ml DMEM/F12 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 5% hesteserum, 1% glutamin, 1% penicillin / streptomycin som blev forvarmet til 37 ° C. De dyrkningsbetingelser blev tilpasset fra de Diego og kolleger. 15
- I laminær strømning knivspids embryoer på midsection (under hjertet) med pincet og fjern bageste del af embryo. Anbring den forreste del ind i en af de fyldte brøndene i 12-brønds dyrkningsplade.
- Gentag for alle embryoner. Fylde kun de ydre brønde i 12-brønds plade for at undgå kontaminering af kulturerne.
- Kultur embryoner i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Ekspression af den elektroporerede plasmidet skal iagttages 24 timer.
- Bør længere kultur gange ønskes, udfylde ud brøndene i en ny 12-brønds plade med 2 ml afmedier, der anvendes i 4.1. Med en steriliseret ske overføre embryoer til en brønd i den nye plade. Anbring igen til 37 ° C inkubator. Kultur for op til 48 timer er muligt.
- Når den ønskede kulturen er nået, fastsætte embryoner til analyse (se nedenfor).
5. Udarbejdelse af embryoer til analyse
- Skylles embryoner i 1 X PBS ved 4 ° C i fem minutter. Gentag.
- Fastsætte embryoner til analyse i 2% paraformaldehyd (PFA) i 1X PBS i 2 timer ved 4 ° C.
- Skylles embryoner i 1 X PBS ved 4 ° C i fem minutter. Gentag.
- Ækvilibrere embryoner i 30% saccharose i 1 X PBS natten over ved 4 ° C.
- Indlejre embryoner i Optimal Cutting temperatur (OCT) forbindelse under anvendelse af et tøris / ethanol-bad. Embryoner kan opbevares ved -20 ° C.
- § embryoner på en kryostat (Leica) til 30 um snit og montere på dias (VWR, SuperFrost Plus). Opbevar ved -20 ° C.
6. IMMUnohistochemistry Analyse
- Immunohistokemi blev udført som beskrevet i 16. Primære antistof fortyndinger anvendes til denne undersøgelse indbefatter kanin α-GFP (Invitrogen) 1:2500; muse α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; kanin α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; kanin α-Ptf1a (Jane Johnson ) 1:2500; kanin-Math1 (Jane Johnson) 1:100. Inkuber objektglas flade prøven opad på en farvning bakke ved 4 ° C natten over.
- Objektglassene blev analyseret på en forbindelse mikroskop (Olympus BX51).
7. Repræsentative resultater
Et skematisk i figur 1A afbilder elektroporering eksperimentet. Figur 1B viser en sagittal afbildning af en E11.5 embryo før manipulation. Den samme embryo efter injektion af plasmid-holdige CAG :: GFP i 0,01% Fast Green er vist i figur 1C og et repræsentativt fikserede embryo udviser unilateral GFPekspression i den dorsale baghjerne 24 timer efter dyrkning er vist i figur 1D. Udstrækningen af det område af LRL, der med held elektroporeret er variabel og synes at være meget afhængig af placeringen af elektroderne. I vores undersøgelser blev det fundet, at 52 ud af 65 (80%) af de elektroporerede embryoner med succes udtrykt GFP. Vævet blev anset for at være vellykket elektroporeret hvis det var positivt for GFP i lokaliserede regioner i flere sektioner efter fiksering og immunohistokemisk analyse (se nedenfor). Embryoner, der ikke levede op til dette kriterium blev scoret som mislykkede forsøg på elektroporation.
Yderligere vurdering af elektroporation effektivitet kan bestemmes ved at udføre immunohistokemi mod GFP på tværsnit af elektroporerede embryoer på niveauet af den fjerde ventrikel. Figur 2 viser repræsentative serielle sektioner fra et embryo viser ensidigGFP-ekspression. Figur 2A viser en idealiseret skematisk der illustrerer, at den venstre side af embryo var mod den positive elektrode. Tværsnit (i niveauer, der er repræsenteret ved midten tegning i figur 2A) viser lokaliseret GFP-ekspression udelukkende på venstre side af baghjerne væv (figur 2C og 2D). Den elektroporerede område af LRL ikke strække sig over hele anterior-posterior aksen af neuralrøret, som behandlingen af sektionerne 300 um rostral eller større som vist i figur 2C ikke udtrykker GFP (figur 2B).
Anvendeligheden af denne assay for manipulation af genekspression er afhængig af stabiliteten af udtrykket domæner for de endogene proteiner. LRL er blevet karakteriseret som havende unikke progenitor domæner kendetegnet ved den differentielle ekspression af proneural transkriptionsfaktorer (gennemgået i 1).En undergruppe af disse faktorer (Mash1, Math1, Ngn1, og Ptf1a) blev valgt til analyse på grund af deres foreslåede og / eller kendetegnet roller i specifikationen af precerebellar neurale undertyper i LRL, et emne for fremtidige studier 16-18. Alle fire proteiner er meget karakteristisk udtryk domæner i den caudale baghjerne ved E11.5 16-18. Vi bemærkede, at embryoner, der blev placeret kulturer undladt at vokse i størrelse og heller ikke at indlede produktion af plexus choroideus epitel og invaginering af LRL og roofplate, morfologiske hændelser, der opstår mellem E11.5 og E12.5 5. Baseret på disse observationer blev det fastslået, at normal udvikling i disse embryoner blev standset eller groft forsinket, og det tilsvarende kontrol for de dyrkede embryoner skal være ukultiverede embryoner ved E11.5.
For at sikre, at kulturen og elektroporation ikke forstyrrer niveauer af endogene proteiner, analyserede vi fire forskellige proteiner ved immunohistochemistry (IHC) i 34 forskellige embryoer, der var elektroporeret og derefter dyrket i mindst 24 timer. Tabel I viser antallet af embryoer analyseret for hver markør og den procentdel af embryonerne analyseret, at de lagrede normale proteinniveauer Figur 3 viser repræsentative IHC data fra to af proteinerne analyseret, Mash1 (fig. 3A og 3B) og Math1 (figur 3C og 3D). Vi observerede, at størstedelen af embryonerne tilbageholdes normale niveauer for ekspression efter elektroporering og kultur (fig. 3B og 3D) sammenlignet med kontrol-embryoer ved E11.5 (figur 3A og 3C). Vigtigere blev karakteristisk udtryk domæner af disse proteiner ikke forstyrres.
Figur 1. Elektroporation af embryoner ved E11.5. (A) Skematisk af the elektroporering eksperiment. En E11.5 embryo isoleres og ekspressionsplasmidet i 0,01% Fast Green injiceres ind i den fjerde ventrikel. Embryoet derefter flankeret af elektrode skovle og underkastet en 50 V-impuls før de anbringes i kultur (B) sagittalbillede af en E11.5 embryo før injektion. (C) Den samme E11.5 embryo efter injektion af plasmid i 0,01% Fast Green. (D) Ensidig baghjerne ekspression af GFP observeret i E11.5 embryo efter 24 timers kultur. mb-midthjernen, 4V-fjerde ventrikel.
Figur 2. Ekspression af GFP i elektroporerede Tissue. (A) Tegningen venstre afbilder placeringen af elektroderne omkring en E11.5 embryo. Midten tegning afbilder optagelse og ekspression af plasmid der koder for GFP i venstre side af embryoet. Tegneserie til højre er skematisk en idealiseret tværsnit taget gennem embryo på levels markeret med sorte streger i midten tegneserie. (B-D) Immunhistokemi for GFP i tværgående snit gennem en elektroporerede E11.5 embryo efter 24 timers kultur. Pilene angiver roofplate (rp), som fælder den sekundære antistof. Billeder taget ved 10x forstørrelse. De relative niveauer af de viste sektioner er afbildet med de vandrette linier gennem midten tegning i (A). mb-midthjernen, l 4V-fjerde ventrikel, rp-roofplate.
Figur 3. Ekspression af endogene proteiner i Nedre rombisk Lip Immunhistokemi for Mash1 (A og B) eller Math1 (C og D) sammenligning tværsnit af E11.5 embryoer, der ikke var dyrket (A, C) med embryoer, der var elektroporeret med CAG.: : GFP og dyrket i 24 timer (B og D). Billeder taget ved 10x forstørrelse.
| Proneural Transcriptipå Faktor Analyseret | Antal af embryoner Analyseret | Procent Fastholdelse Normale ekspressionsmønstre |
| Math1 | 15 | 86,7% |
| Mash1 | 12 | 83,3% |
| Ngn1 | 7 | 71,4% |
| Ptf1a | 6 | 100% |
Tabel I. Andel af Elektroporerede og kulturperler embryoner Støttemure Normale Proneural Transcriptionsfaktor domæner i LRL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro elektroporering teknik i denne undersøgelse, er en hidtil ukendt metode, der effektivt kan anvendes til at manipulere genekspression i embryoer yngre end 12 dages drægtighed. Placering af embryoer i kultur tillader ekspression af det indførte gen, og omgår den letalitet observeret når elektroporerede embryoner lov til at forblive in vivo. Denne teknik giver mulighed for manipulation af genekspression i embryoniske stamceller, der tidligere var utilgængelige for elektroporation-baserede undersøgelser.
Elektroporationsteknikken resulterede i effektiv ekspression af det indførte gen med 80% af embryoerne analyseret. Som observeret i figur 2 omfanget af elektroporerede væv er lokaliseret til diskrete områder. For specifikt at målrette en særlig baghjerne region for elektroporation af elektroderne skal omhyggeligt placeret så dette styrer placeringen af enffected væv. Hvis den nedre rombisk læbe dorsale embryoniske baghjerne ønskes, skal skovlene være plads, således at de umiddelbart flankerer den bredeste del af den fjerde ventrikel åbning. Hvis ensidig ekspression på den ene side af neuralrøret ønskes derefter embryonet skal placeres mellem elektroderne, således at aksen af neuralrøret er parallel med skovlene. Vipning af embryo kan resultere i ukorrekt målretning og / eller bilateralt ekspression. At optimere at opnå en bedre elektroporering effektivitet kunne variere elektroporering spænding, da dette kan forøge andelen af celler, der optagelse den elektroporerede DNA. Man kunne også yderligere at koncentrere DNA-lagre. Som neuralrøret kun kan rumme en lille mængde væske, bør mere koncentrerede prøver forøge mængden af plasmid indføres i cellerne ved elektroporering. Endelig kan man ændre diameteren af skovlene. Hvis man ønsker at målrette en mindre end mere lokalt område kan det være bedst at reducere padle størrelse.
Kritisk for anvendeligheden af denne teknik til at manipulere baghjerne genekspression er retentionen af normale gen og protein ekspressionsmønstre efter elektroporering og dyrkning af embryoer. Som dokumenteret i figur 3 og tabel I, normale proneural transcriptionsfaktor og-mønstre godt bevaret 83% af embryoerne analyserede udtrykt Mash1, 86% udtrykt Math1, og 100% udtrykt Ptf1a. Niveauer af Ngn1 var ikke så robust bibeholdt (71%) som de andre transkriptionsfaktorer analyseret. Selv om det er muligt, at denne særlige transkriptionsfaktor negativt påvirket af elektroporering og kulturen fremgangsmåde vi mener, at der er et alternativ forklaring. Det er blevet vist, at Ngn1 ekspression i den dorsale baghjerne formindskes med tiden, med niveauer forsvinder ved embryonisk dag (E) 12,5 16. Idet percentage af embryoer, der udtrykker Ngn1 er lavere end dem, der bevarer den normale ekspression af de andre vurderes proteiner (83% eller højere), er det muligt, at i det mindste en del af 30% af embryoner, der er deficiente i udtrykkelsen af dorsale Ngn1 er skredet i normale udviklingsmæssige program, slukker Ngn1 udtryk 24 timer efter høsten E11.5 og placering i kultur. Dette antyder, at molekylære ændringer, der forekommer i det dorsale baghjerne mellem E11.5 og E12.5 kunne forekomme i en del af embryonerne, men gør dette på en asynkron eller forsinket tidsramme. Dette finde fortjener yderligere analyse i fremtidige undersøgelser, men mindsker ikke begejstring for denne analyse. Den mulighed, at embryoner kan under molekylære forandringer, der sker under den normale udvikling bør også oplyse, hvordan resultaterne fra forsøg med denne teknik fortolkes.
Variationer til den optimerede elektroporation og kultur betingelser præsenteres i ther undersøgelsen er mulige. Det blev konstateret, at 50 V gav en robust optagelse af den elektroporerede genet med minimal forstyrrelse væv integritet. Spændingen for elektroporeringer kan ændres med henblik på at finjustere denne analyse til individuel experimenter behov. Dyrkningsbetingelserne var optimeret i embryoner der var direkte anbragt i dyrkningsmedier (beskrevet ovenfor) i en 12-brønds plade. Denne teknik kan modificeres ved at anbringe embryo på en membran (Costar), der er anbragt i mediet i en 12-brønds plade. Under optimering af dyrkning af teknikken denne variation blev forsøgt, men det syntes ikke at påvirke den eksperimentelle resultatet enten i elektroporerede genekspression eller tilbageholdelse af normale genekspression mønstre.
Denne undersøgelse fokuserede på dyrkning embryoner i 24 timer. Embryoer er blevet dyrket i op til 48 timer med de medier, der ændres på 24 timer. Det blev konstateret, at integriteten af vævet faldt med langER inkubationstider men ekspression af elektroporerede GFP kunne detekteres. For længere inkubationstider (seneste 48 timer), kan det være nødvendigt ændre de dyrkningsbetingelser, og vil sandsynligvis blive genstand for fremtidige undersøgelser.
Under optimeringen af kulturen assayet blev det konstateret, at retention af endogen genekspression forbedret embryoer, der havde større eksponering af det neurale rør til mediet miljøet. I disse forsøg blev dette opnået ved punktering af den 4. ventrikel roofplate og fjernelse uvedkommende væv i den caudale del af embryoet før placering i kultur. Fremtidige undersøgelser vil undersøge, om mikrodissekeres neuralrør held kan dyrkes under disse betingelser.
Denne undersøgelse fokuserede på elektroporering af embryoer på 11,5 dage inde i graviditeten (E11.5). En fremtidig retning ville være at optimere teknik til tidligere stadier af udvikling. Vi har brugt denne teknik på embryonerhøstet ved E10.5, og mens vi har endnu til at akkumulere og analysere et betydeligt antal af embryoner, vi har set vellykkede indførelse af GFP og dyrkning af embryoner. En mere dybtgående yderligere undersøgelse vil være nødvendigt at sige med sikkerhed, at den teknik, der anvendes i denne undersøgelse kunne anvendes til yngre embryoner. Det kunne være muligt at elektroporere embryoner yngre end E10.5, men det har ikke været forsøgt.
En funktionel anvendelse af denne teknik kunne være at overudtrykke eller vælte funktionen af gener for at undersøge om deres proteinprodukter er kritisk for produktion af forskellige neurale undertyper fra LRL. Fremtidige eksperimenter med denne teknik vil fokusere på indførelsen af proneural transkriptionsfaktorer at ændre skæbnen for de forskellige neurale subypes vides at være fremstillet af LRL på E11.5. Den teknik kan også tilpasses til at målrette andre neuroepitelceller regioner, der aktivt producerer neuroner ved E11.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Jane Johnson for Math1, Ngn1, og Ptf1a antistoffer og Connie Cepko for pCAG :: GFP plasmid. Dette arbejde blev finansieret af NIH R15 1R15HD059922-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM-1850 | |
| Biologie tip Dumoxel treated DUMONT forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| 20 mm MORIA perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| ECM 830 Square Wave Electroporation Generator | BTX (VWR) | 47745-928 | |
| Harvard Apparatus 7 mm Tweezertrodes* Electrodes | BTX (Fisher) | BTX450165 | |
| Fisher Isotemp CO2 Incubator | Fisher Scientific | 1325525 | |
| NAPCO CO2 Gas Regulator | Fisher Scientific | 15497020 | |
| 12 Well Tissue Culture Plates | BD Falcon (Fisher) | 877229 | |
| HyClone Liquid Media DMEM/F-12 (1:1); With L-Glutamine and HEPES; 500mL | Thermo Scientific (Fisher) | SH3002301 | |
| HyClone* Donor Equine Serum | Thermo Scientific (Fisher) | SH3007402 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated | Invitrogen | 16140-063 | |
| cellgro* 10,000 IU Penicillin, 10,000μg/mL Streptomycin | Mediatech (Fisher) | MT-30-002-CI | |
| HyClone* L-Glutamine L-Glutamine; 200mM in 0.85% NaCl | Thermo Scientific (Fisher) | SH3003401 | |
| Fast-Green | Fisher Scientific | AC41053-0250 | 0.01% |
References
- Ray, R. S., Dymecki, S. M. Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip. Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wingate, R. J. The rhombic lip and early cerebellar development. Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).
- Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps. Neuron. 50, 205-218 (2006).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. Origin of the precerebellar system. Neuron. 27, 475-486 (2000).
- Taber-Pierce, E. Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse. J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).
- Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem. Neuroscience. 162, 560-573 (2009).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain. Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).
- Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene. Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).
- de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla. Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).
- Landsberg, R. L. Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6. Neuron. 48, 933-947 (2005).
- Hoshino, M. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Yamada, M. Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on. Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).
