Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten

Published: May 14, 2012 doi: 10.3791/3986
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

Genereren van T-lymfocyten van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen geeft een alternatieve aanpak van het gebruik van embryonale stamcellen voor T-cel-gebaseerde immunotherapie. De werkwijze blijkt dat door een gebruik

Abstract

Adoptieve overdracht cel (ACT) van antigeen-specifieke CD8 + cytotoxische T lymfocyten (CTL) is een veelbelovende behandeling voor een verscheidenheid van tumoren 1. CTL's kan herkennen kwaadaardige cellen door interactie tumor antigenen met de T-cel-receptoren (TCR), en laat cytotoxinen en cytokines om kwaadaardige cellen te doden. Het is bekend dat minder gedifferentieerd en centrale geheugen zoals (zogenoemde zeer reactieve) CTL's de optimale populatie ACT gebaseerde immunotherapie omdat deze CTL een hoge proliferatie potentieel minder gevoelig voor apoptose dan meer gedifferentieerde cellen en een hogere vermogen om te reageren op homeostatische cytokinen 2-7. Echter, vanwege problemen bij het verkrijgen van een groot aantal van zulke CTL's van patiënten, is er een dringende behoefte aan een nieuwe aanpak van de zeer reactieve Ag-specifieke CTL's voor een succesvolle ACT-gebaseerde therapieën te genereren te vinden.

TCR transductie van de zelf-hernieuwbare stamcellen Immuun een therapeutisch potentieel voor de behandeling van ziekten 8-10. Echter, de aanpak van embryonale stamcellen (SER) te verkrijgen van de patiënten is niet haalbaar. Hoewel het gebruik van hematopoietische stamcellen (HSC) voor therapeutische doeleinden is op grote schaal toegepast in de kliniek 11-13 zijn HSCs minder differentiatie en proliferatieve capaciteiten en HSCs moeilijk in te breiden in vitro celkweek 14-16. Recente iPS cel-technologie en de ontwikkeling van een in vitro systeem voor gen delivery in staat zijn om het genereren van iPS cellen van patiënten zonder chirurgische benadering. Bovendien, zoals SER, iPS cellen hebben onbepaalde prolifereren in vitro, en blijken te differentiëren in hematopoïetische cellen. Zo iPS cellen groter potentieel worden gebruikt in ACT gebaseerde immunotherapie opzichte SER of HSCs.

Hier we methode voor het genereren van T lymfocytencyten van iPS cellen in vitro en in vivo programmering van antigeen-specifieke CTL's van IPS cellen te bevorderen kanker immuunsurveillance. Stimulatie in vitro met een inkeping ligand aandrijft T celdifferentiatie van iPS cellen en TCR gen transductie resultaten iPS cellen differentiëren in antigeen-specifieke T-cellen in vivo, die tumorgroei voorkomt. Zo tonen we aan antigeen-specifieke T-cel differentiatie van IPS-cellen. Onze studies bieden een potentieel efficiëntere aanpak voor het genereren van antigeen-specifieke CTL's voor ACT-based therapieën en de ontwikkeling van therapeutische strategieën voor ziekten.

Protocol

1. Cel Cultuur

  1. Voorbereiding van de bestraalde SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) feeder cellen voor cultuur.
    SNL76 / 7 cellen blijven doorgaans in 10% foetaal bovine serum (FBS) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) medium.
    1. Een kweekschaal of de kolf wordt bekleed met 0,1% gelatine-oplossing in 37 ° C incubator gedurende 30 minuten vóór herstel SNL76 / 7 cellen van vloeibare stikstof.
    2. Wanneer SNL76 / 7 cellen confluentie bereiken worden cellen getrypsiniseerd worden uit gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en geresuspendeerd in vers medium.
    3. Geresuspendeerd SNL76 / 7 cellen worden bestraald in 60 Co bestraler met een dosis van 5000 Rads.
      Alternatieve benadering, SNL76 / 7 cellen kunnen worden vervangen door muis embryonale fibroblasten (MEF) en mitomycine-inactivatie kunnen vervangen bestraling.
    4. Na de bestraling wordt cellen worden gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en geresuspendeerd in 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) FBS bevriezing buffer, aliquot incryovials en bewaard in vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik.
  2. Bereiding van OP9-DL1 cellen in vitro differentiatie.
    OP9-DL1 cellen algemeen gehandhaafd in 20% FBS α-Minimum Essential Medium (α-MEM) media. Wanneer zij tot confluentie cellen gesplitst in een 1:5 verdunning.
  3. Voorbereiding van E.G7 thymoom cellen.
    E.G7 thymoma cellen algemeen gehandhaafd in 10% FBS Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) -1,640 media. Wanneer zij tot confluentie worden cellen gesplitst in een 1:10 verdunning.
  4. Algemeen onderhoud van IPS en TCR-getransduceerde iPS cellen.
    1. Een cultuur schotel zal worden bekleed met 0,1% gelatine oplossing in 37 ° C gedurende 30 minuten voor het zaaien irSNL76 / 7 feeder-cellen een dag van tevoren van nuttige toepassing of splitsing van iPS cellen.
    2. Voor iPS cellen gesplitst, zullen de cellen getrypsiniseerd worden uit gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en geresuspendeerd in 15% FBS DMEM medium.
    3. Getrypsiniseerd iPScellen worden geïncubeerd op een verse cultuur schotel 30 minuten in 37 ° C incubator voor het zaaien van verse irSNL76 / 7 feeder cel voorgelakt schotel naar gedifferentieerde cellen en resten feeder-cellen uit te sluiten.
    4. Na de incubatie wordt 4 x 10 6 cellen worden gezaaid in een 100 mm cultuur schotel.

2. In vitro Programming

  1. In vitro coculture systeem.
    1. Op dag 0, zal 5x10 4 ips-cellen worden gezaaid op een 100mm cultuur schotel met confluente OP9-DL1 cel monolaag in 20% FBS α-MEM media.
    2. Op Dag 3, zal kweekmedia worden gewijzigd door nieuwe.
      1. Op dag 5 zal cellen getrypsiniseerd worden uit en gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 minuten incuberen bij een verse 100mm kweekschaal gedurende 30 minuten 37 ° C incubator.
      2. Drijvende cellen worden verzameld en geteld wordt 5x10 5 cellen worden overgebracht naar een nieuwe cultuurschaaltje met confluente OP9-DL1 cel monolaag in 20% FBS α-MEM media. Cytokine mFlt-3L (eindconcentratie: 5 ng / ml) wordt toegevoegd in de cultuur.
      1. Op dag 8, zal losjes bevestigde cellen voorzichtig worden pipetteer naar beneden.
      2. Was de OP9-DL1 voeding laag met 10 ml PBS nog een keer om de maximale herstel van de gedeeltelijk gedifferentieerde iPS cellen te krijgen.
      3. Na het oogsten cellen van de coculture wordt cellen worden gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en geresuspendeerd in 20% FBS α-MEM medium aangevuld met mFlt-3L (5 ng / ml) en mIL-7 (1 ng / ml).
      4. De cellen zullen worden overgebracht naar een 6-en cultuur plaat bedekt met confluente OP9-DL1 cellen. Meestal iPS cellen hersteld van een 100 mm cultuur schotel zal worden overgebracht in een goed van de 6-wells plaat.
      1. Vanaf dag 10, zal kweekmedia worden gewijzigd in elke andere dag (20% FBS α-MEM media supplemented met mFlt-3L (5 ng / ml) en mIL-7 (1 ng / ml)).
      2. Kweekplaten bekleed met feeder-OP9 DL1 cellen worden veranderd in 4-6 dagen, afhankelijk van de groei van de feeder cellen.
  2. In vivo rijping van gedeeltelijk gedifferentieerde iPS cellen.
    1. Op dag 22 coculture wordt iPS cellen getrypsiniseerd worden uit gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en geïncubeerd op een vers kweekschaal in 37 ° C gedurende 30 minuten.
    2. Drijvende cellen zullen worden verzameld, doorgegeven door middel van 70 pm nylon zeef naar cel klonten die longembolie aan muizen kunnen veroorzaken uit te sluiten en drie keer gewassen in koude PBS.
    3. Cellen worden geresuspendeerd in PBS met een concentratie van 1.5x10 7 cellen / ml.
    4. Cellen worden gehandhaafd ijs voor injectie.
    5. Voor iv injectie door de staartader, zullen muizen worden geplaatst onder een infrarood licht om hun staartader verwijden.
    6. Na ader dilatation, 200 ui celsuspensie of 3x10 6 cellen zal adoptief worden overgebracht naar een 4 weken oude B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J-muis door middel van haar staart ader. Drie weken zijn toegestaan ​​voor in vivo rijping van gedeeltelijk gedifferentieerde iPS cellen.
  3. Evaluatie.
    1. Morfologische veranderingen van gedifferentieerde cellen en cel herstel tarieven. Figuur 1.
      1. Op verschillende dagen van coculture met OP9-DL1 cellen, zullen levende cellen foto's worden genomen in het kader van conventionele microscoop.
      2. Cell herstel tarieven worden berekend op basis van het aantal cellen dat geoogst van cultuur.
    2. Flowcytometrische analyse van het oppervlaktewater marker veranderingen. Figuur 2a.
      1. Op verschillende dagen van coculture, zullen cellen worden verwijderd van cultuur door behandeling met trypsine en gewassen met koude PBS voordat u overgaat tot het celoppervlak vlekken.
      2. Voor vlekken with verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen, zal cellen worden geblokkeerd door Fc blokker 24G2 in 4 ° C gedurende 20 minuten.
      3. Na 20 minuten kleuren in 4 ° C, cellen worden drie keer gewassen in koude PBS voor flowcytometrische onderzoek.
    3. Activering van in vitro gedifferentieerde cellen iPS. Figuur 2b.
      1. Een dag voor activering assay voorlaag 24-wells plaat met anti-CD3 (uiteindelijke concentratie: 4 pg / ml in PBS) bij 4 ° C gedurende de nacht.
      2. Op dag 22 coculture, iPS cellen afgeleid T-cellen worden geoogst uit de cultuur en gewassen met koude PBS voor het stimuleren met plaat gecoat anti-CD3 en oplosbare anti-CD28 antilichamen (uiteindelijke concentratie: 4 pg / ml).
      3. Incubatie wordt uitgevoerd in 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 40 uur en vervolgens Befeldin A toegevoegd in cultuur nog 4 uur.
      4. Aan het einde van coculture zal cellen in harverworven, gewassen en Fc geblokkeerd door blokkering zoals hierboven beschreven. Geblokkeerde cellen zullen worden gekleurd voor oppervlakte markers als CD8 en TCR Vβ keten door gebruik te maken fluorochroom geconjugeerde antilichamen.
      5. Na celoppervlak kleuring wordt cellen worden vastgesteld met 4% formaldehyde en gepermeabiliseerd met Biolegend de Permeabilizing kit.
      6. Na permeabilisatie zal intracellulaire moleculen zoals IL-2 en IFN-γ worden gekleurd met fluorochroom geconjugeerde antilichamen.
      7. Vóór de definitieve flowcytometrische onderzoek zal cellen worden drie keer gewassen in koude PBS overmatige antilichamen te sluiten.
    4. Rijping in de Rag-/ - muizen.
      1. Na drie weken in vivo ontwikkeling, Rag-/ - muizen worden opgeofferd, milt en lymfeklieren worden verwijderd uit muizen.
      2. Enkele cellen zullen worden verwerkt door middel van een mechanisch defect. De rode bloedcellen worden gelyseerd met lysisbuffer en ACKmononucleocytes worden verzameld en tweemaal gewassen in koude PBS.
      3. Na wassen wordt cellen worden geblokkeerd met Fc blokker 24G2 in 4 ° C gedurende 20 minuten en aan het einde van blokkeren, cellen zullen worden gekleurd met verschillende fluorochroom geconjugeerd anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 en anti-TCRβ antilichamen 4 ° C gedurende 20 minuten.
      4. Aan het einde van kleuring wordt cellen worden drie keer gewassen in koude PBS voor flowcytometrische onderzoek.

3. In vivo Programming

  1. Generatie retrovirale construct.
    1. MSCV-IRES-DsRed (MiDR) vector geconstrueerd naar MSCV-IRES-GFP vector te vervangen door het GFP-gen met de DsRed gen.
    2. OT-I T cel receptor gen gesubkloneerd in de vector MiDR om OT-I/MiDR construeren.
  2. Retrovirale transductie en cel sortering.
    1. Plat-E inpakcellen are gebruikt om pseudovirus te genereren die gebruikt zullen worden voor de volgende transductie.
      1. 3x10 6 Plat-E cellen worden uitgezaaid in een 100 mm kweekschaal een dag voor transfectie.
    2. Op dag 0 Plat-E cellen worden getransfecteerd met OT-I MiDR plasmide met GeneJamma transfectiereagens.
    3. Op dag 1 worden 1x10 6 ips cellen worden uitgeplaat in een putje van een 0,1% gelatine gecoate 24-wells plaat.
      1. Op dag 2, pseudovirus bevattende supernatans van Plat-E cultuur zullen worden verzameld en doorgegeven door middel van een 0,4 urn filter om eventuele verontreinigingen uit te sluiten.
      2. Transductie wordt uitgevoerd onder de voorwaarde 32 ° C centrifuge bij 1400 tpm gedurende 1 uur in de aanwezigheid van 5 pg / ml polybreen.
      3. Na centrifuge gebaseerde transductie wordt cellen worden in 32 ° C, 5% CO2 incubator gedurende de nacht.
    5. Op dag 3, herhaal dan de dag 2 transduction procedure zoals hierboven beschreven. Een 6-putjes plaat wordt vooraf bekleed met irSNL76 / 7 feeder cellen voor toekomstig gebruik.
    6. Op dag 4 getransduceerde cellen worden iPS getrypsiniseerd uit gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en uitgeplaat op gecoate irSNL76 / 7 feeder cellen.
    7. Bij confluentie worden cellen getrypsiniseerd worden uit gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en verwerkt celsortering. GFP en DsRed dubbele positieve cellen worden gesorteerd op MoFlo celsorteerder. Gesorteerde cellen worden gekweekt op irSNL76 / 7 feeder cellen voor toekomstig gebruik.
  3. Adoptieve overdracht en tumor uitdaging.
    OT-I TCR getransduceerde iPS (OT-I/iPS) cellen worden in het algemeen gehandhaafd irSNL76 / 7 feeder cellen zoals hierboven beschreven.
    1. Op de dag van adoptieve overdracht worden OT-I/iPS cellen getrypsiniseerd uit gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 min. en geresuspendeerd in vers medium.
    2. 30 minuten incubatie op een nieuwe kweekschaal in 37 ° C incubator is om gedifferentieerde cel te eliminerenen het overblijfsel feeder cellen.
    3. Aan het einde van de incubatie wordt drijvende cellen te verzamelen en gecentrifugeerd bij 400 g gedurende 5 minuten.
    4. Cell pellet wordt gewassen in koude PBS driemaal, en cellen worden gevoerd door een 70 pm nylon zeef tussen twee wasbeurten in cel klonten (2X filtratie) sluiten.
    5. Na wassen wordt cellen worden geteld en geresuspendeerd in koude PBS in een concentratie van 1.5x10 7 cellen / ml.
    6. Cellen worden gehandhaafd ijs voor injectie.
    7. Voor adoptieve overdracht, zal 4-6 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muizen worden gebruikt. Voor iv injectie door de staartader, zullen muizen worden geplaatst onder een infrarood licht om hun staart aderen verwijden.
    8. Na ader verwijding, wordt 200 ui celsuspensie of 3x10 6 cellen adoptief worden overgemaakt via de staartader. Zes weken zal toegestaan ​​worden voor in vivo rijping van de OT-I TCR getransduceerde iPS cellen.
      1. Na zes weken van intraveneuze injectie, zal 4x10 6 E.G7 thymoom cellen worden ingeënt intraperitoneaal.
      2. E.G7 thymoom cellen zullen worden verzameld van cultuur en drie keer gewassen in PBS.
      3. Aan het einde van wassen wordt cellen worden gesuspendeerd in koude PBS in een concentratie van 8x10 7 cellen / ml.
      4. 50 pi celsuspensie of 4x10 6 cellen geïnjecteerd in de peritoneale holte.
  4. Evaluatie.
    1. In vitro karakterisering van OT-I TCR getransduceerde iPS cellen.
      1. Fluorescerende microscopisch onderzoek van DsRed, zal GFP dubbele positieve cellen worden uitgevoerd onder conventionele TL-microscoop met niet vastgelegde levende cellen.
      2. Gene integratie en expressie zullen worden geanalyseerd door zowel PCR en RT-PCR-analyses.
        1. Cellulaire DNA of RNA zullen afzonderlijk worden geïsoleerd uit monsters met behulp van Qiagen's DNA ofRNA isolatie kit.
        2. PCR en RT-PCR zal worden uitgevoerd met behulp van primers die specifiek herkennen de gerecombineerde VDJ regio van TCR Vβ5 keten.
    2. T cel ontwikkeling en rijping. Figuur 3a.
      1. In week 2 zal 4 en 6 na de cell transfer, dieren worden opgeofferd en de milt, de lymfeklieren worden verwijderd uit dier.
      2. Single celsuspensie zal worden gemaakt door middel van een mechanisch defect. De rode bloedcellen worden gelyseerd met lysisbuffer en ACK mononucleocytes worden verzameld en tweemaal gewassen in koude PBS.
      3. Na wassen wordt cellen worden geblokkeerd met Fc blokker 24G2 in 4 ° C gedurende 20 minuten en aan het einde van blokkeren, cellen worden aliquotted en gekleurd met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen in 4 ° C gedurende 20 minuten.
      4. Aan het einde van kleuring wordt cellen worden drie keer gewassen in koude PBS voor het laden van flow cytometer.
    3. Peptide stimulatie. Figuur 3b.
      1. Op dag 50 van de tumor uitdaging, zullen dieren worden geofferd en de milt, de lymfeklieren worden verwijderd van dieren.
      2. Single celsuspensie zal worden gemaakt door middel van een mechanisch defect. De rode bloedcellen worden gelyseerd met lysisbuffer en ACK mononucleocytes worden verzameld en tweemaal gewassen in koude PBS.
      3. CD8 + T cellen worden geïsoleerd via Miltenyi Biotec van CD8 + T cel isolatiekit. Geïsoleerd CD8 + T cellen gemengd met bestraalde splenocyten geïsoleerd uit naïeve C57BL/6J-muizen in de verhouding 01:10 en gepulseerd met 0,5 umol / ml OVA 257-264 peptide gedurende 40 uur. Daarna Brefeldin A wordt toegevoegd aan de cultuur nog 4 uur.
      4. Aan het einde van coculture zal cellen worden geoogst, gewassen en Fc geblokkeerd door blokkering zoals hierboven beschreven.
      5. Geblokkeerde cellen zullen worden gekleurd om de oppervlakte-merkers als CD8 en TCR Vβ5 keten met fluorochroom geconjugeerde antilichamen.
      6. Na celoppervlak kleuring wordt cellen worden vastgesteld met 4% formaldehyde en gepermeabiliseerd met cel permeabilisatie kit.
      7. Na permeabilisatie zal intracellulaire moleculen zoals IL-2 en IFN-γ worden gekleurd met fluorochroom geconjugeerde antilichamen.
      8. Vóór de definitieve flowcytometrische onderzoek zal cellen worden drie keer gewassen in koude PBS overmatige antilichamen te sluiten.
    4. In vivo assay doden. Figuur 3C.
      1. Splenocyten van naïeve C57BL/6J-muizen zal worden geïsoleerd en voorzien van carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) als doelcellen.
      2. Gelabelde cellen met 5 pmol / ml CFSE (CFSE hi cellen) worden gepulseerd met 10 ug / ml OVA 257-264 peptide en cellen gelabeld met 0,5 umol / ml CFSE (CFSE lo cellen) niet gepulseerd. Een mengsel van 2.5x10 6 CFSE hi cellen plus 2.5x10 6 CFSE lo cellen zullen adoptief worden overgedragen door iv injectie in de aangegeven ontvanger.
      3. Na 16 uur wordt splenocyten van de muizen geïsoleerd en CFSE + cellen geanalyseerd door flowcytometrie.
    5. Intraperitoneale tumor cellen. Figuur 4.
      Op dag 20 van de tumor uitdaging, zullen muizen worden opgeofferd en buikholte lavage wordt uitgevoerd met behulp van koude PBS. Peritoneale lavage hersteld tumorcellen worden geteld.
    6. Tumor-infiltrerende T-cellen identificatie. Figuur 5.
      1. In het late stadium van de tumor uitdaging, zullen muizen worden opgeofferd en de tumor wordt verwijderd uit buikholte van verschillende groepen.
      2. Tumor wordt in stukken gesneden; een stuk zal worden gebracht in een cryovial en op droog ijs onmiddellijk, zal de andere helft worden vastgesteld voormaldehyde en een derde stuk wordt bewaard in geconditioneerde RPMI-1640 media voor toekomstig gebruik.
      3. H & E kleuring zal worden uitgevoerd in overeenstemming met algemeen protocol van formaldehyde gefixeerde en in paraffine verpakte monsters.
      4. Immunofluorescentie kleuring zal worden uitgevoerd op ingevroren monsters.
        1. Weefsel zal coupes en bewaard in -20 ° C voor gebruik.
        2. Weefselcoupes zal de lucht gedroogd 15 minuten voor 15 minuten koude aceton fixatie.
        3. Na fixatie, worden de secties aan de lucht gedroogd nog 15 minuten voor 5 minuten PBS wassen.
        4. Na wassen, plaats glaasjes in een vochtige kamer en omvatten de weefselsectie met 30 pi 3% BSA in PBS gedurende 30 minuten niet-specifieke binding te blokkeren.
        5. Aan het einde van blokkeren, vlek uit blokkeringsbuffer en bedek weefsel secties met 50 pi mengsel van PE-anti-TCR Vα2 antilichamen en FITC-anti-OVA antilichamen verdund in 3% BSAin PBS.
        6. Incubeer in een vochtige kamer 2 uur en het einde van de incubatie wordt dia worden drie keer gewassen met koud PBS en gemonteerd op waterbasis afdekmiddel voor fluorescerende microscopisch onderzoek.
      5. Flow cytometrische analyse van tumor-infiltrerende T-cellen.
        1. Tumor wordt geplet in enkele celsuspensie en rode bloedcellen worden gelyseerd door ACK lysis buffer.
        2. Na het wassen en het blokkeren, zullen cellen worden gelabeld met verschillende fluorochroom geconjugeerde antilichamen die specifiek herkennen CD8, TCR Vα2 en TCR V β5 moleculen die tot expressie gebracht op het celoppervlak.
    7. Muis te overleven. Figuur 6.
      Na tumor uitdaging, zal de muis te overleven zorgvuldig gecontroleerd te worden.

4. Representatieve resultaten

CD3 en TCRβ worden gebruikt als markers Tcellen. Om te bepalen of stimulatie van iPS cellen met de Notch ligand DL1 zou kunnen bijdragen aan T-cel differentiatie, onderzochten we de expressie van CD3 en TCRβ + op iPS cel afkomstige cellen, en verder geanalyseerd expressie van CD4-en CD8, poorten op CD3 + en + TCRβ populatie. Zoals hier getoond, op dag 22 CD3 + TCRβ + CD4 - CD8 + een positieve (SP) T cellen werden gegenereerd iPS cellen in vitro. Bovendien is de iPS cel afkomstige SP cellen konden IL-2 en IFN-γ produceren wanneer gestimuleerd in vitro door plaat bekleed anti-CD3 en oplosbare anti-CD28 antilichamen (Fig. 2), wat suggereert dat iPS cellen afgeleid T-cellen zijn functioneel.

Na adoptieve overdracht in de ontvanger muizen, de meeste TCR gen-getransduceerde cellen ondergingen iPS differentiatie in CD8 + CTL die in vitro stimulatie reageerden op peptide door secreting IL-2 en IFN-γ (Fig. 3). Het belangrijkste is dat adoptieve overdracht van TCR-getransduceerde iPS cellen geactiveerd infiltratie van OVA-reactieve CTL's in tumor weefsel en beschermde dieren van de tumor uitdaging (Fig. 5-6). Zo TCR gen-getransduceerde cellen iPS kunnen differentiëren in functionele antigeen-specifieke CTL's in vivo.

Figuur 1
Figuur 1. Morfologie van iPS celdifferentiatie. Op verschillende dagen werden muizen iPS cellen samen gekweekt met OP9-DL1 cellen α-MEM medium aangevuld met 20% FCS en 2,2 g / L natriumbicarbonaat in aanwezigheid van 5 ng / ml mFlt3L en 1 ng / ml mIL-7 .

Figuur 2
Figuur 2. T-cel differentiatie van IPS-cellen. Mouse iPS cellen werden samen gekweekt met OP9-DL1 cellen zoals beschreven in figuur 1. Op day 22 werden iPS cel-afgeleide cellen geïsoleerd en geanalyseerd. A) CD4 + CD8 - of CD4 - CD8 + cellen na gating op CD3 + en + TCRβ populaties. B) cellen werden gestimuleerd met plaat gecoat anti-CD3 en oplosbare anti-CD28 antilichamen 5 uur bij 37 ° C in 5% CO2. IL-2 en IFN-γ werden geanalyseerd door intracellulaire kleuring na gating van levende CD4 - CD8 + T cellen.

Figuur 3
Figuur 3. Antigeen-specifieke CD8 + T-cel ontwikkeling van iPS cellen in vivo. OT-I gen TCR-getransduceerde cellen werden geïnjecteerd iPS iv in C57BL / 6 muizen. Na zes tot tien weken, werd OVA-specifieke CD8 + Vβ5 + T cel ontwikkeling bepaald. A) CD8 + Vβ5 + T-cellen uit gepoold LNS en milt werden geanalyseerd door middel van flowcytometrie, na gating op CD8 + populaties. B) IL-2 en IFN-γ productie (donkere lijnen; gearceerde gebieden aan isotype controle) werden bepaald door intracellulaire cytokine kleuring na gating de CD8 + + Vβ5 populaties. C) In vivo proliferatie / cytotoxiciteitstest. CFSE hi (rechts pieken) en CFSE lo (links pieken) doelcellen werden gepulseerd met OVA 257-264 peptide en de controle, respectievelijk, en werden geïnjecteerd in muizen tien weken na iPS cel overdracht of de dag na OT-I CTL overdracht.

Figuur 4
Figuur 4. Adoptieve overdracht van OT-I TCR gen-getransduceerde iPS cellen onderdrukt de groei van tumoren. OT-I TCR gen-getransduceerde iPS cellen werden adoptief overgebracht naar C57BL / 6 muizen. Een groep van muizen ingespoten met OVA-reactieve CD8 + T cellen OT-I TCR transgene muizen, en een groep muizen hadden geen cel-overdracht. Na een zes weken of de volgende dag na de cel overdracht, werden de muizen blootgesteld aan te vechten met E. G7 tumorcellen. Op dag 20 werden tumor cellen in de peritoneale holte opgesomd.

Figuur 5
Figuur 5. IPS cel afkomstige antigeen-specifieke CTL infiltreren in tumor weefsel. Op dag 30 tot 35 na de tumor uitdaging, werden tumor weefsel onderzocht op tumor-reactieve T-cel infiltratie. A) H & E kleuring. Inflammatoire cellen geïnfiltreerd in tumor weefsel (↓). B) Immunohistologische vlekken. OVA-specifieke Vα2 + CTL's (rood) geïnfiltreerd in OVA-expressie tumor weefsel (groen). C) Single-celsuspensies van tumor weefsels werden geanalyseerd op expressie van Vα2 + en + Vβ5 door flowcytometrie na gating de CD8 + populatie.

"Afbeelding Figuur 6. Adoptieve overdracht van OT-I TCR gen-getransduceerde iPS cellen ondersteunt muis te overleven. OVA TCR gen-getransduceerde cellen werden iPS adoptief overgebracht in C57BL / 6 muizen die werden onderworpen aan testen met E. G7 tumorcellen zoals beschreven in Fig. 4. Muis overleven op dag 50 werd aangetoond door Kaplan-Meier survival curves (n = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voor ACT-therapieën, de in vitro productie van grote aantallen zeer reactieve Ag T-cellen in vivo opnieuw infusie een optimale benadering. Hoewel wij in vitro methode leidt functionele T-cellen uit iPS cellen grote aantallen iPS cel afkomstige afsterven vier weken, vooral in de vierde week. We concluderen dat het voortbestaan ​​signalen van Notch signalering door bemiddeling van de DL1 en IL-7 en FLt3L niet voldoende zijn om het voortbestaan ​​van iPS cel afkomstige progenitor T-cellen te waarborgen, mogen andere survival factoren coöperatieve deze cel rijping te reguleren. TCR gen transductie in vitro stimulatie met de uitsparing ligand grotendeels direct T celdifferentiatie van iPS cellen echter het iPS cel afkomstige antigeen-specifieke T-cellen kan nog steeds niet overleven meer, die voorkomt verkrijgen geschikte aantal iPS cel afkomstige antigeen- T-cellen voor ACT gebaseerde immunotherapie.

ve_content "> De ontwikkeling van de T-lymfocyten in de thymus is een goed geordende proces. De onrijpe thymocyten die expressie van CD4-en CD8 worden aangeduid als dubbele ontkenning (DN) cellen. DN voorlopers zijn onderverdeeld in ontwikkelings-subsets gebaseerd op de expressie van CD44 en CD25. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) en DN4 (CD44 - CD25 -) Alleen DN3 cellen die hebben geleid tot een functionele TCRβ keten, die paren met de invariante pre-Tα en de CD3 is gekoppeld aan een pre-TCR vormen en worden geselecteerd voor verdere differentiatie. Dit evenement, genaamd β-selectie, de eerste controlepost tijdens de T cel ontwikkeling vertegenwoordigt. Pre-TCR vorming signalen proliferatie, de beëindiging van TCRβ locus omlegging , en differentiatie van DN thymocyten aan de CD4 + CD8 + dubbele positieve (DP) fase 17. Onze in vitro stimulatie wet de Notch ligand DL1 rijdt iPS cellen door het β-selectie checkpoint in 2 weken, en pre-T-cellen (CD3 + TCRβ +; CD25 - CD44 -; CD4 - CD8 -). Er werd extra 2 weken stimulatie het vooraf T cellen doorvoer in volwassen CD8 + T cellen (CD3 + + TCRβ; CD4 - CD8 +; CD62L + CCR7 + CD27 CD127 + +). De volwassen SP T cellen doodgaan in afwezigheid van een verdere stimulatie door de TCR en CD3 complex.

In vivo programmering van antigeen-specifieke CTL's van IPS-cellen kunnen overwinnen van de gebreken in voldoende aantallen T-cellen te verkrijgen voor ACT-gebaseerde therapieën. Ondanks de waargenomen controle van de groei van de tumor, hebben we een aantal beperkingen van ACT geïdentificeerd met TCR gen-getransduceerde iPS cellen. Eerst ten minste zes weken in vivo ontwikkeling is essentieel voor T-celdifferentiatie afgeleid van de transferred iPS cellen. Ten tweede merkten we bont verlies, osteoporose en andere kleine auto-uitingen in muizen die ontvangen TCR-getransduceerde iPS cellen, zoals waargenomen in een aantal klinische onderzoeken het beheer van T-cel-gebaseerde immunotherapie van kanker. Deze effecten worden veroorzaakt door de vorming van andere celtypes immuun van het overgedragen iPS cellen. Echter, hoe deze cellen in vivo gevormd onbekend. Derde adoptieve overdracht van TCR gen-getransduceerde cellen iPS heeft het risico dat teratoma vanwege de steel fenotype. Maar tot nu toe in onze studie hebben we alleen maar geïdentificeerd extrathymic massa in een Rag1 - / - muis en zijn niet waargenomen afwijking in conventionele C57BL / 6 muizen. Daarom hebben we voorstellen, de maximale efficiëntie te krijgen, is het beter om genetische achtergrond match in vivo iPS differentiatie.

In tegenstelling tot derivaten van de SER, abnormale genexpressie in sommige cellen onderscheiden van iPS cellen hebben de potential tot T-cel-afhankelijke immuunrespons bij syngene ontvangers 18 induceren. Daarom moet de immunogeniciteit van cellen afgeleid van patiënt specifiek IPS cellen worden voordat klinische toepassing van deze autologe cellen wordt overwogen. Door het analyseren van de gen-expressie profielen van iPS-cel-afgeleide cellen, is aangetoond dat een groep van 9 genen (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, Retn) werden geuit tegen abnormaal hoge niveaus . Bovendien induceren expressie van drie van deze genen (Hormad1, Zg16 en Cyp3a11) in ES-cellen significant toegenomen immunogeniciteit van transplantatie van genetisch gekoppeld ontvangers 18. Zo is de groep van 9 eiwitten heeft de potentie om afstoting van de iPS cel afkomstige cellen na adoptieve overdracht veroorzaken, en kunnen een immunogeen markers. Niettemin de potentiële immunogeniteit van iPS cel-derived T-lymfocyten is niet vastgesteld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken dr. Shinya Yamanaka (Kyoto University) voor het leveren van iPS-MEF-Ng-20D-17 cellijn, Dr Dario Vignali (St. Jude Children's Research Hospital) voor het ondersteunen van de OT1-2A • pMig II constructie, dr. Juan carlos Zuniga-Pflucker (afdeling Immunologie van de Universiteit van Toronto) voor het ondersteunen van de OP9-DL1 cellijn, en Dr Kent E Vrana (Vakgroep Farmacologie, Penn State University College of Medicine) voor het helpen van het ontwerp van deze studie. Dit project wordt gefinancierd op grond van subsidies met het licentienummer K18CA151798 van het National Cancer Institute, de Barsumian Trust en de Melanoma Research Foundation (J. Song).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Tags

Immunologie T-cellen geïnduceerde pluripotente stamcellen differentiatie Notch signalering T-cel-receptor adoptie-cel overdracht
Geregisseerd Differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar T lymfocyten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, … More

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter