Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

doi: 10.3791/3986 Published: May 14, 2012

Summary

הדור של לימפוציטים T מ המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים נותן גישה חלופית של שימוש בתאי גזע עובריים על חיסוני מבוססי תאים T. השיטה מלמדת כי על ידי ניצול או

Abstract

העברת תא המאמצת (ACT) של אנטיגן ספציפי CD8 + לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים (ההרג) הוא טיפול מבטיח עבור מגוון רחב של מחלות ממאירות 1. ההרג יכול לזהות תאים ממאירים על ידי אינטראקציה אנטיגנים סרטניים עם קולטני תא ה-T (TCR) ו cytotoxins השחרור, כמו גם ציטוקינים להרוג תאים ממאירים. ידוע כי פחות מובחן ומרכז זיכרון (כמו שמכונה תגובתי) ההרג הם האוכלוסייה האופטימלי עבור חיסוני ACT מבוסס, כי ההרג האלה יש פוטנציאל שגשוג גבוהה, נוטים פחות אפופטוזיס מאשר תאים מובחנים יותר יש יכולת גבוהה יותר להגיב ציטוקינים homeostatic 2-7. עם זאת, בשל קשיים בהשגת מספר רב של ההרג של חולים כאלה, יש צורך דחוף למצוא גישה חדשה ליצירת תגובתי Ag-ספציפיים ההרג עבור ACT מבוססי טיפולים מוצלחים.

TCR התמרה של גזע עצמית מתחדשתתאים עבור הכינון מחדש החיסון יש פוטנציאל תרפויטי בטיפול במחלות 8-10. עם זאת, הגישה להשיג תאים עובריים (ESCs) מן החולים הוא לא ריאלי. למרות השימוש בתאי גזע hematopoietic (HSCs) למטרות טיפוליות הוחל נרחב במרפאה 11-13, HSCs צמצמו בידול יכולות שגשוג, ו HSCs קשה להתרחב ב תרבית תאים במבחנה 14-16. הטכנולוגיה iPS האחרונה התא ופיתוח במערכת במבחנה למסירה גן מסוגלים לייצר תאים iPS מחולים ללא כל גישה ניתוחית. בנוסף, כמו ESCs, תאים iPS בעלי יכולת שגשוג בלתי מוגבלת במבחנה, הוכחו להתמיין לתאי היווצרות הדם. לכן, תאים iPS יש פוטנציאל גדול לשימוש חיסוני ACT מבוסס לעומת ESCs או HSCs.

כאן, אנו מציגים שיטות לייצור T lymphocytes מתאי שב"ס במבחנה, בתכנות vivo של אנטיגן ספציפי ההרג של התאים iPS לקידום מעקב סרטן החיסונית. גירוי במבחנה עם ליגנד Notch מניע התמיינות תאים מתאי T IPS, ו - התמרה TCR תוצאות גנים בתאים שב"ס הבחנה לתוך אנטיגן ספציפי בתאי T in vivo, אשר מונע את צמיחת הגידול. לכן, אנחנו מדגימים אנטיגן ספציפי התמיינות תאים מתאי T שב"ס. המחקרים שלנו לספק גישה פוטנציאל יעיל יותר להפקת אנטיגנים ספציפיים ההרג עבור ACT טיפולים מבוססי ולאפשר פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות למחלות.

Protocol

1. תא תרבות

  1. הכנת תאים מזין מוקרן SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) עבור התרבות.
    SNL76 / 7 תאים נשמרים בדרך כלל סרום 10% שור עוברית (FBS) שינוי Dulbecco הנשרים בינוני (DMEM) התקשורת.
    1. מנה תרבות או הבקבוק יהיה מצופה פתרון ג'לטין 0.1% ב 37 ° C; החממה במשך 30 דקות לפני התאוששות SNL76 / 7 תאים של חנקן נוזלי.
    2. כאשר SNL76 / 7 תאים להגיע confluency, תאים ייכללו trypsinized כבוי, centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו resuspended בתקשורת טריים.
    3. Resuspended SNL76 / 7 תאים ייכללו מוקרן ב irradiator 60 בשיתוף עם מינון של 5000 ראד.
      גישה חלופית, תאים SNL76 / 7 יכול להיות מוחלף על ידי fibroblasts העכבר עובריים (MEF) ו-mitomycin איון יכול להחליף קרינה.
    4. לאחר ההקרנה, תאים ייכללו centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו resuspended ב sulfoxide דימתיל 10% (DMSO) FBS חיץ מקפיא, aliquot אלcryovials ו שנשתמרו חנקן נוזלי לשימוש עתידי.
  2. הכנת OP9-DL1 עבור תאים במבחנה של בידול.
    OP9-DL1 התאים יישמר בדרך כלל בינונית 20% α-FBS מינימום הכרחי (α-ממ) התקשורת. כאשר הם מגיעים לתאי confluency תפוצל בדילול 01:05.
  3. הכנת E.G7 תאים thymoma.
    E.G7 תאים thymoma יישמר בדרך כלל 10% FBS Roswell Park Memorial Institute בינוני (RPMI) התקשורת -1640. כאשר הם מגיעים אל confluency, תאים תפוצל בדילול 1:10.
  4. תחזוקה כללית של השב"ס TCR-transduced תאים שב"ס.
    1. מנה התרבות יהיה מצופה פתרון ג'לטין 0.1% ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני זריעת irSNL76 / 7 תאים מזין יום אחד לפני התאוששות או פיצול של תאים שב"ס.
    2. לשבריר תאים IPS, התאים יהיה trypsinized כבוי, centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו resuspended ב 15% FBS DMEM התקשורת.
    3. Trypsinized iPSתאים ייכללו מודגרות על צלחת תרבות טריים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לפני זריעה על צלחת מתוקים תא irSNL76 / 7 מזין precoated להוציא תאים מבודל מזין תאים שאריות.
    4. לאחר הדגירה, 4 × 10 6 תאים ייכללו זרע בצלחת תרבות 100mm.

2. בתכנות חוץ גופית

  1. במערכת coculture חוץ גופית.
    1. בכל יום 0, תאים 5x10 4 שב"ס יהיה זרע על צלחת תרבות 100mm המכיל monolayer confluent OP9-DL1 תא 20% FBS α-ממ התקשורת.
    2. בכל יום 3, התקשורת והתרבות ישתנו עם נרות חדשים.
      1. בכל יום 5, תאים ייכללו trypsinized לסירוגין centrifuged ב 400 גרם של 5 דקות לפני דוגרים על צלחת תרבות טרי 100mm במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה.
      2. תאים צפים ייאספו וספר, 5x10 5 תאים יועברו לתרבות חדשהמנה המכילה monolayer confluent OP9-DL1 תא 20% FBS α-ממ התקשורת. ציטוקינים mFlt-3L (הריכוז הסופי: 5 ng / mL) יתווספו בתרבות.
      1. בכל יום 8, תאים המחוברים באופן רופף תהיה טפטפת בעדינות כלפי מטה.
      2. לשטוף את שכבת OP9-DL1 האכלה עם 10 מ"ל פעם 1 PBS יותר כדי לקבל את מרבית ההתאוששות של תאים iPS נבדלות באופן חלקי.
      3. לאחר איסוף תאים coculture, תאים ייכללו centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו resuspended ב 20% FBS אלפא למוצרי ממ התקשורת השלימו עם mFlt-3L (5 ng / mL) ו - MIL-7 (1 ng / mL).
      4. התאים יועברו לתוך צלחת 6-גם תרבות מצופה בתאים confluent OP9-DL1. בדרך כלל תאים iPS שהתגלו 1 מנה 100 מ"מ התרבות יועבר לאחד גם צלחת 6 היטב.
      1. מיום 10, התקשורת והתרבות ישתנו כל יום שני (20% FBS α-MEM התקשורת supplementeד עם mFlt-3L (5 ng / mL) ו - MIL-7 (1 ng / mL)).
      2. צלחות תרבות מצופה מזין OP9-DL1 תאים ישתנו ב 4-6 ימים, בהתאם לצמיחה של תאים מזין.
  2. בשנת התבגרות vivo של תאים iPS נבדלות באופן חלקי.
    1. ביום 22 של coculture, תאים iPS יהיה trypsinized כבוי, centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו מודגרות על צלחת תרבות טרי 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
    2. תאים צפים ייאספו, עבר דרך מסננת ניילון 70 מיקרומטר להוציא גושי תאים העלולים לגרום לתסחיף ריאתי לעכברים ורחץ שלוש פעמים PBS קר.
    3. תאים ייכללו resuspended ב PBS עם ריכוז של 1.5x10 7 תאים למ"ל.
    4. התאים ישמרו על קרח לפני ההזרקה.
    5. לפני הזרקת IV דרך וריד הזנב, עכברים יוצב תחת אור אינפרא אדום להתרחב וריד הזנב שלהם.
    6. לאחר וריד ד, ilatation 200 ההשעיה μl התא או 3x10 6 תאים יועברו adoptively לתוך בשבוע 4 הישן B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J-העכבר דרך וריד הזנב. שלושה שבועות מותר עבור vivo ב ההבשלה של תאים iPS נבדלות באופן חלקי.
  3. הערכה.
    1. שינויים מורפולוגיים של תאים מבודל התאוששות שיעורי סלולריים. באיור 1.
      1. על ימים שונים של coculture עם OP9-DL1 תאים, תמונות תאים חיים יילקחו תחת מיקרוסקופ רגיל.
      2. התאוששות שיעורי סלולריים יחושב על פי מספר התאים שנקטפו מן התרבות.
    2. ניתוח תזרים cytometric השינויים הסמן על פני השטח. איור 2 א.
      1. על ימים שונים של coculture, תאים יוסרו מן התרבות ידי trypsinization ורחץ מקור PBS לפני שתמשיך מכתים שטח פני התא.
      2. לפני מכתים שנינותש נוגדנים שונים מצומדות fluorochrome, תאים ייחסמו על ידי FC חוסם 24G2 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
      3. אחרי 20 דקות מכתים ב 4 ° C, תאים ייכללו שטף שלוש פעמים בקור PBS לפני הבדיקה זרימת cytometric.
    3. ההפעלה של 2b. חוץ גופית תאים הבדיל שב"ס איור.
      1. יום אחד לפני assay ההפעלה, precoat צלחת 24 גם עם אנטי CD3 (ריכוז סופי: 4 מיקרוגרם / מ"ל, ב PBS) בשעה 4 ° C במשך הלילה.
      2. ביום 22 של coculture, תאים iPS ותאי T הנגזרות יהיה לקצור מתרבות ורחץ מקור PBS לפני גירוי עם נוגדנים נגד CD28 צלחת מצופה אנטי CD3 ו מסיסים (ריכוז סופי: 4 מיקרוגרם / מ"ל).
      3. הדגירה יבוצע ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 40 שעות ולאחר מכן Befeldin יתווספו בתרבות עוד 4 שעות.
      4. בסוף coculture, התאים יהיה הרמוקנה, רחוץ נחסם על ידי חוסם Fc כמתואר לעיל. תאים חסומים יהיה מוכתם עבור סמנים פני השטח כמו שרשרת Vβ CD8 ו TCR באמצעות נוגדנים מצומדות fluorochrome.
      5. לאחר צביעת שטח פני התא, התאים יהיה קבוע באמצעות פורמלין 4% ו permeabilized באמצעות ערכת Permeabilizing של Biolegend.
      6. לאחר permeabilization, מולקולות תאיים כמו IL-2 ו - IFN-γ יהיה מוכתם באמצעות נוגדנים מצומדות fluorochrome.
      7. לפני הבדיקה הסופית זרימת cytometric, התאים יהיה שטף שלוש פעמים PBS קר להוציא נוגדנים מוגזמות.
    4. ההתבגרות של סמרטוט, / - עכברים.
      1. אחרי שלושה שבועות של פיתוח vivo, סמרטוטים, / - טחול, עכברים יהיה להקריב ובלוטות לימפה יוסר עכברים.
      2. תאים בודדים יעובדו באמצעות פירוק מכני. כדוריות דם אדומות יהיה lysed באמצעות חיץ תמוגה ACK וmononucleocytes ייאספו ורחץ פעמיים PBS קר.
      3. לאחר הכביסה, תאים ייחסמו עם Fc חוסם 24G2 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ובסוף של חסימה, התאים יהיה מוכתם שונים fluorochrome מצומדות אנטי CD3, אנטי CD4, CD8 אנטי ואנטי TCRβ נוגדנים 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
      4. בסוף צביעה, התאים יהיה שטף שלוש פעמים PBS קר לפני בדיקת זרימת cytometric.

3. בתכנות vivo

  1. דור של מבנה retroviral.
    1. MSCV-IRES-DsRED (MiDR) וקטור בנוי על בסיס וקטור MSCV-IRES-GFP על ידי החלפת גנים GFP עם הגן DsRED.
    2. OT-אני קולטן T הגן התא subcloned לתוך וקטור MiDR לעשות OT-I/MiDR לבנות.
  2. התמרה retroviral ומיון תאים.
    1. Plat-E תאים אריזה arדואר המשמש לייצור pseudovirus כי ישמש התמרה הבאה.
      1. 3x10 6 Plat-E תאים זרע על צלחת 100 מ"מ תרבות יום לפני transfection.
    2. ביום 0, Plat-E תאים ייכללו transfected עם OT-אני MiDR פלסמיד באמצעות מגיב GeneJamma transfection.
    3. ביום 1, 1x10 6 תאים iPS יהיה זרע לתוך אחד טוב של צלחת 0.1% ג'לטין 24 גם precoated.
      1. ביום 2, pseudovirus המכילים supernatant מתרבות Plat-E ייאספו ועבר דרך מספר 0.4 מיקרומטר סינון להוציא מזהמים פוטנציאליים.
      2. התמרה יבוצע בתנאים של צנטריפוגות 32 ° C בסל"ד 1400 שעה 1 בנוכחות מיקרוגרם 5 / polybrene מ"ל.
      3. לאחר התמרה צנטריפוגות מבוסס, התאים ימוקמו 32 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך הלילה.
    4. ביום 3, חזרו היום 2 טרהnsduction ההליך כמתואר לעיל. צלחת 6 גם יהיה precoated עם תאים irSNL76 / 7 מזין לשימוש עתידי.
    5. ביום 4, transduced תאים iPS יהיה trypsinized כבוי, centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו זרע על תאים irSNL76 / 7 precoated מזין.
    6. ב confluency, תאים ייכללו trypsinized כבוי, centrifuged ב 400 גרם של 5 דקות ומעובדים עבור מיון התא. GFP ותאי חיוביות כפול DsRED ימוינו על ידי סדרן התא MoFlo. תאים ממוינים בתרבית יהיה על irSNL76 / 7 תאים מזין לשימוש עתידי.
  3. העברת המאמץ והאתגר הגידול.
    OT-אני TCR transduced שב"ס (OT-I/iPS) התאים נשמרים בדרך כלל על תאים irSNL76 / 7 מזין כפי שתואר לעיל.
    1. ביום העברת המאמצת, תאים OT-I/iPS הם trypsinized כבוי, centrifuged ב 400 גרם דקות 5 ו resuspended בתקשורת טריים.
    2. 30 דקות הדגירה על צלחת תרבות טרי 37 ° C חממה נדרש לחסל תאים הבדילו שריד תאים מזין.
    3. בסוף הדגירה, תאים צפים ייאספו ו centrifuged ב 400 גרם של 5 דקות.
    4. תא גלולה יהיה שטף בקור PBS שלוש פעמים, התאים יועברו דרך מסננת 70 מיקרומטר ניילון בין שתי שוטף להוציא גושי תאים (2X סינון).
    5. לאחר הכביסה, תאים ייספרו ו resuspended בקור PBS בריכוז של 1.5x10 7 תאים למ"ל.
    6. התאים ישמרו על קרח לפני ההזרקה.
    7. להעברת המאמצת, 4-6 שבועות עכברים נקבה בת C57BL/6J ישמש. לפני הזרקת IV דרך וריד הזנב, עכברים יוצב תחת אור אינפרא אדום להתרחב ורידים הזנב שלהם.
    8. לאחר התרחבות וריד, 200 ההשעיה התא μl או 3x10 6 תאים יועברו adoptively דרך וריד הזנב. שישה שבועות יורשו של התבגרות ב vivo של OT-אני TCR transduced תאים שב"ס.
      1. לאחר שישה שבועות של הזרקה IV, 6 4x10 E.G7 תאים thymoma יהיה מחוסן intraperitoneally.
      2. E.G7 תאים thymoma יהיה שנקטפו מן התרבות שטף שלוש פעמים PBS.
      3. בסיום הרחצה, תאים יושעה ב PBS קר בריכוז של 8x10 -7 תאים למ"ל.
      4. 50 השעיה תא μl או 4x10 6 תאים ייכללו מוזרק לתוך חלל הצפק.
  4. הערכה.
    1. במבחנה ואפיון של OT-אני TCR transduced תאים שב"ס.
      1. בדיקה מיקרוסקופית של פלורסנט DsRED, תאים GFP חיוביות כפולות יבוצעו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי עם תאים חיים יתבטל.
      2. שילוב גנים ביטוי ינותחו על ידי שני PCR ו RT-PCR ניתוחים.
        1. נייד דנ"א או רנ"א יהיה מבודד בנפרד באמצעות ה-DNA של Qiagen או דגימותערכת בידוד RNA.
        2. PCR ו RT-PCR יבוצע באמצעות primers ספציפית לזהות את האזור VDJ המוצרף של שרשרת Vβ5 TCR.
    2. T פיתוח התא ההתבגרות. איור 3 א.
      1. בכל שבוע 2, 4 ו 6 תאים הודעה, העברה, בעלי חיים יהיה הקריבו צמתים, הלימפה והטחול יוסר בעלי חיים.
      2. ההשעיה תא בודד ייעשה באמצעות פירוק מכני. כדוריות דם אדומות יהיה lysed באמצעות חיץ תמוגה ACK ו mononucleocytes ייאספו ורחץ פעמיים PBS קר.
      3. לאחר הכביסה, תאים ייחסמו עם Fc חוסם 24G2 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ובסוף של חסימה, תאים ייכללו aliquotted ומוכתמת עם נוגדנים שונים מצומדות fluorochrome ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
      4. בסוף צביעה, התאים יהיה שטף שלוש פעמים PBS קר לפני טעינת על cytometer הזרימה.
    3. גירוי פפטיד. איור 3 ב.
      1. ביום 50 של אתגר הגידול, בעלי החיים יהיו קורבנות, צמתים, הלימפה והטחול יוסר חיות.
      2. ההשעיה תא בודד ייעשה באמצעות פירוק מכני. כדוריות דם אדומות יהיה lysed באמצעות חיץ תמוגה ACK ו mononucleocytes ייאספו ורחץ פעמיים PBS קר.
      3. CD8 + T תאים יהיה מבודד באמצעות CD8 Miltenyi BIOTEC של + T ערכת בידוד התא. מבודדים CD8 + T תאים יהיה מעורב splenocytes מוקרן מבודד נאיביות עכברים C57BL/6J ב יחס של 1:10 ו פעמו עם 0.5 μmol / OVA 257-264 מ"ל פפטיד במשך 40 שעות. לאחר מכן, Brefeldin יתווספו בתרבות למשך 4 שעות.
      4. בסוף coculture, התאים יהיה לקצור, רחוץ נחסם על ידי חוסם Fc כמתואר לעיל.
      5. תאים חסומים יהיה מוכתם על פני מארקERS כשרשרת Vβ5 CD8 ו TCR באמצעות נוגדנים מצומדות fluorochrome.
      6. לאחר צביעת שטח פני התא, התאים יהיה קבוע באמצעות פורמלין 4% ו permeabilized באמצעות permeabilization ערכת התא.
      7. לאחר permeabilization, מולקולות תאיים כמו IL-2 ו - IFN-γ יהיה מוכתם באמצעות נוגדנים מצומדות fluorochrome.
      8. לפני הבדיקה הסופית זרימת cytometric, התאים יהיה שטף שלוש פעמים PBS קר להוציא נוגדנים מוגזמות.
    4. In vivo להרוג assay. איור 3 ג.
      1. Splenocytes מתוך נאיביות עכברים C57BL/6J יהיה מבודד ומסומן עם carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE) כמו תאים היעד.
      2. תאים תווית עם 5 μmol / CFSE מ"ל (HI תאים CFSE) יהיה פעמו עם 10 מיקרוגרם / מ"ל OVA 257-264 פפטיד ותאי שכותרתו עם 0.5 μmol / CFSE מ"ל (CFSE תאים LO) לא יהיה פעמו. תערובת של 2.5x10 6 תאים היי CFSE בתוספת 2.5x10 6 תאים CFSE וראה זה יועבר adoptively אל הנמען המצוין בזריקה IV.
      3. לאחר 16 שעות, splenocytes מעכברים אלה יהיו מבודדים תאים + CFSE ינותחו על ידי cytometry הזרימה.
    5. הגידול Intraperitoneal ספירת תאים. איור 4.
      ביום 20 של אתגר הגידול, עכברים יהיו קורבנות, שטיפת חלל הצפק יבוצע באמצעות PBS קר. שטיפה פריטוניאלית התאושש תאים סרטניים ייספרו.
    6. הגידול חדירה לתאי T זיהוי. איור 5.
      1. בשלב מאוחר של אתגר הגידול, עכברים יהיה הקריבו הגידול יוסר חלל הצפק מקבוצות שונות.
      2. הגידול יהיה לחתוך לחתיכות, חלק אחד יהיה להכניס cryovial והניח על קרח יבש מיד, בחצי השני יהיה קבוע עבורmaldehyde וחתיכת 3 תישמר מיזוג RPMI-1640 התקשורת לשימוש עתידי.
      3. צביעת H & E יבוצעו על פי כללי הפרוטוקול מ קבוע פורמלדהיד ועטף דגימות פרפין.
      4. מכתים Immunofluorescent יבוצעו על דגימות cryopreserved.
        1. רקמת יהיה מחולק לגובה של -20 ° C לפני השימוש.
        2. קטעי רקמות יהיה אוויר יבש 15 דקות לפני 15 דקות קיבעון אצטון קר.
        3. לאחר קיבוע, חלקים יהיו באוויר יבש למשך 15 דקות לפני שטיפה PBS 5 דקות.
        4. אחרי, לשטוף במקום שקופיות בתא לח לכסות את הרקמה עם סעיף 30 BSA 3% μl ב PBS במשך 30 דקות כדי לחסום את הלא ספציפית מחייב.
        5. בסופו של חסימה, למחוק את חסימת חיץ ולכסות חלקים רקמות בתערובת 50 μl של PE-אנטי TCR Vα2 נוגדנים FITC אנטי-OVA נוגדנים בדילול ב BSA 3%ב PBS.
        6. דגירה בתא לח למשך 2 שעות, בסוף הדגירה, שקופיות יהיה שטף שלוש פעמים בקור PBS ועלה עם מים מבוססי מדיה הרכבה לפני בדיקה מיקרוסקופית ניאון.
      5. ניתוח תזרים cytometric של הגידול חדירה לתאי T.
        1. הגידול יהיה דחוס ההשעיה תא בודד ותאי הדם האדומים יהיה lysed ידי חיץ תמוגה ACK.
        2. לאחר השטיפה חסימה, תאים תסווג נוגדנים שונים מצומדות fluorochrome ספציפית לזהות CD8, TCR Vα2 ו TCR-V β5 מולקולות לידי ביטוי על פני התא.
    7. הישרדות העכבר. איור 6.
      אחרי אתגר הגידול, ההישרדות העכבר יהיה במעקב צמוד.

4. נציג תוצאות

CD3 ו TCRβ משמשים כסמנים של Tתאים. כדי לקבוע אם גירוי של תאים iPS עם ליגנד Notch DL1 יכול לתרום התמיינות תאים T, החוקרים העריכו ביטוי CD3 ו + TCRβ על שב"ס תאים שמקורם בתאי, וביטוי ניתוח נוסף של CD4 ו CD8, gating על CD3 + ו + TCRβ האוכלוסייה. כפי שניתן לראות כאן, ב -22 יום, CD3 CD4 + + TCRβ - CD8 + יחיד חיוביות (SP) ותאי T נוצרו מתאי שב"ס במבחנה. בנוסף, תאים שמקורם בתאי שב"ס-SP הצליחו לייצר IL-2 ו - IFN-γ כאשר מומרץ במבחנה על ידי צלחת מצופה אנטי CD3 ו מסיסים נוגדנים נגד CD28 (איור 2), דבר המצביע על שב"ס תאים שמקורם ותאי T הם פונקציונליים.

לאחר העברת המאמצת לעכברים הנמענים, רוב TCR גנים transduced עברו התמיינות התאים iPS אל CD8 + ההרג, אשר הגיבו במבחנה לגירוי פפטיד על ידי secreting IL-2 ו - IFN-γ (איור 3). והכי חשוב, העברת המאמצת של TCR-transduced תאים iPS מופעלות חדירת OVA-reactive ההרג לרקמות גידול ובעלי חיים מוגנים מן האתגר הגידול (איור 5-6). לכן, TCR גנים transduced תאים iPS יכול להתמיין אנטיגן ספציפי ההרג תפקודית in vivo.

איור 1
באיור 1. מורפולוגיה של התמיינות תאים iPS. על ימים שונים, עכבר לתאי iPS היו שיתוף תרבותי עם OP9-DL1 תאים במדיום α-MEM השלימו עם FCS 20% ו - 2.2 גר '/ ל סודיום ביקרבונט בנוכחות mFlt3L 5 ננוגרם / מ"ל ​​ו - 1 ng / mL MIL-7 .

איור 2
איור 2. T התמיינות תאים מתאי שב"ס. עכבר לתאי iPS היו שיתוף תרבותי עם OP9-DL1 תאים כמתואר באיור 1. ביום דאיי 22, IPS תאים שמקורם בתאי בודדו ונותחו. א) CD4 + CD8 - או CD4 - CD8 + תאים לאחר gating על CD3 + ו + TCRβ אוכלוסיות. ב) היו תאים מגורה עם נוגדנים נגד CD28 צלחת מצופה אנטי CD3 ו מסיסים במשך 5 שעות על 37 ° C 5% CO 2. IL-2 ו - IFN-γ נותחו על ידי צביעה תאיים, לאחר gating על CD4 חיים - CD8 + T תאים.

איור 3
איור 3. Antigen ספציפי CD8 + T-cell פיתוח מתאי שב"ס in vivo. OT-אני TCR גנים transduced תאים iPS הוזרקו לתוך IV C57BL / 6 עכברים. לאחר שישה עד עשרה שבועות, OVA ספציפי CD8 + + פיתוח Vβ5 T התא נקבע. א) CD8 + + Vβ5 בתאי T של LNs אספו וטחול נותחו על ידי cytometry הזרימה, לאחר gating על CD8 + אוכלוסיות. ב) IL-2 ו - IFN-γ הייצור (קווים כהים, אזורים מוצלים מצביעים שולטת isotype) נקבעו על ידי צביעה ציטוקינים תאיים, לאחר gating על CD8 + + Vβ5 אוכלוסיות. ג) assay התפשטות / cytotoxicity vivo. CFSE היי (פסגות מימין) Lo CFSE פסגות (שמאל) היו תאים היעד פעמו עם פפטיד 257-264 OVA ואת הבקרה, בהתאמה, הוזרקו לעכברים עשרה שבועות לאחר העברת תא iPS או יום לאחר העברת CTL OT-I.

איור 4
איור 4. העברת המאמצת של OT-אני TCR גנים transduced תאים iPS מדכא את צמיחת הגידול. OT-אני TCR גנים transduced תאים iPS הועברו adoptively לעכברים C57BL / 6. קבוצה אחת של עכברים שהוזרק עם OVA-reactive CD8 + T תאים מן OT-TC אנימחקר העכברים הטרנסגניים, וכן קבוצה אחת של עכברים לא העברת התא. בין אם לאחר שישה שבועות או ביום הבא לאחר העברת תאים, עכברים סבלו האתגר עם תאים E. גידול ה-G7. ביום 20, תאים סרטניים בחלל הצפק פורטו.

איור 5
IPS איור 5. תא הנגזרות אנטיגן ספציפי ההרג לחדור לרקמות הגידול. ביום 30-35 לאחר אתגר הגידול, רקמות הגידול נבדקו על חדירת הגידול-reactive תא T. א) H & E מכתים. תאים דלקתיים הסתננו ברקמות הגידול (↓). ב) Immunohistological מכתים. OVA ספציפי Vα2 + ההרג (אדום) הסתננו ב OVA-לבטא רקמות הגידול (ירוק). ג) מתא בודד השעיות מרקמות הגידול נותחו לביטוי של Vα2 + ו + Vβ5 ידי cytometry הזרימה, לאחר gating על אוכלוסייה CD8 +.

"איור איור 6. העברת המאמצת של OT-אני TCR גנים transduced תאים iPS מקיימת הישרדות העכבר. TCR OVA גנים transduced תאים iPS הועברו adoptively לעכברים C57BL / 6, כי היו נתונים האתגר עם תאים E. גידול ה-G7, כמתואר בתרשים. 4. הישרדות עכבר ביום 50 הוצגה על ידי Kaplan-Meier עקומות ההישרדות (n = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עבור ACT מבוססי טיפולים, בדור חוץ גופית של מספרים גדולים הפערים תגובתי Ag ספציפית בתאי T עבור in vivo מחדש עירוי היא גישה אופטימלית. אמנם שיטה במבחנה שלנו מעורר של תאים T תפקודית של תאים iPS, מספרים גדולים של שב"ס תאים שמקורם בתאי למות ארבעה שבועות, במיוחד בשבוע האחרון. אנו מסיקים כי האותות ההישרדות של Notch איתות בתיווך DL1 וכן IL-7 ו FLt3L אינם מספיקים כדי לשמור על הישרדותו של שב"ס תאים שמקורם בתאי T אב, גורמים אחרים עשויים להיות הישרדות שיתופית להסדיר אלה התבגרות התא. TCR התמרה גנים בגירוי חוץ גופית עם ליגנד Notch ישירה בעיקר בידול T תא מתאי IPS, לעומת זאת, תא הנגזרות שב"ס אנטיגן ספציפי לערמונית ותאי T עדיין לא יכולה לשרוד זמן רב יותר, מה שמונע לקבל מספרים מתאימים של התא הנגזרות iPS אנטיגן- שתאי T ספציפיים עבור חיסוני ACT מבוסס.

ve_content "> פיתוח של לימפוציטים-T ב התימוס הוא תהליך מסודר. את thymocytes מפותחים חסרי ביטוי של CD4 ו CD8 מכונים כפולים (DN) תאים שליליות. מבשרי ד.נ. מחולקים תת התפתחות המבוססת על ביטוי של CD44 ו CD25. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) ו DN4 (CD44 - CD25 -) רק DN3 התאים יצרו שרשרת TCRβ תפקודית, אשר זוגות עם וקבועות מראש Tα ואת CD3 רשתות להקים מראש TCR ו נבחרים בידול נוסף. אירוע זה, כינה β-הבחירה, מייצג את המחסום 1 במהלך התפתחות תא T. Pre-TCR אותות היווצרות התרבות, סיום התארגנות מחודשת לוקוס TCRβ , והבחנה של thymocytes ד.נ. את CD4 + CD8 + חיובית כפולה (DP) שלב 17. שלנו במבחנה גירוי With Notch ליגנד DL1 שמניע תאים iPS לעבור במחסום β-הבחירה ב 2 שבועות, ולהיות קדם-T (התאים CD3 + + TCRβ: CD25 - CD44 -; - CD4 CD8 -). גירוי נוסף 2 שבועות מראש מאפשרת-T לתאים מעבר אל בוגרת CD8 + T תאים (CD3 + +; TCRβ - CD4 CD8 +; CD62L + + CD27 + CCR7 CD127 +). את בוגרים ותאי T-SP ימותו בהיעדר גירוי נוסף על ידי TCR ומורכב CD3.

בתכנות vivo של אנטיגן ספציפי ההרג של התאים iPS יכול להתגבר על חוסר להשיג בכמות מספקת של תאים T עבור ACT מבוססי טיפולים. למרות השליטה הנצפה של הגידול, זיהינו מספר מגבלות חוק עם TCR גנים transduced תאים שב"ס. ראשית, לפחות שישה שבועות בפיתוח vivo חיונית ההבחנה T-cell נגזר לאransferred תאים שב"ס. שנית, הבחנו אובדן פרווה, אוסטיאופורוזיס ועוד תופעות אוטואימוניות קלים בעכברים שקיבלו TCR-transduced תאים iPS כפי שנצפה בכמה ניסויים קליניים בניהול חיסוני T מבוססי תאים סרטן. תופעות אלה עלולות להיגרם על ידי הדור של סוגי תאים חיסוניים אחרים מתאי שב"ס המועברים. עם זאת, כמה תאים אלה נוצרים in vivo נותר עלום. העברה שלישית, המאמצת של TCR גנים transduced תאים iPS יש את הסיכון של יצירת תפלצת רוחנית בשל פנוטיפ גזע שלו. אבל עד כה במחקר שלנו, אנחנו רק לזהות מסת extrathymic באחד Rag1 - / - העכבר לא נצפתה הפרעה C57BL קונבנציונאלי / 6 עכברים. לכן, אנו מציעים, כדי להשיג יעילות מרבית, עדיף לקבל התאמה רקע גנטי של בידול iPS vivo.

בניגוד נגזרות של ESCs, ביטוי גנים לא תקין בחלק להבדיל מתאי שב"ס יש בפוטנציהאני לגרום T-cell תלוי בתגובה החיסונית מקבלי syngeneic 18. לכן, immunogenicity של תאים שמקורם בחולה ספציפי בתאי iPS יש להעריך לפני כל יישום קליני של תאים אלה עצמיים מוסכם. על ידי ניתוח גנטי ביטוי פרופילים של שב"ס תאים שמקורם בתאי, הוכח כי קבוצה של 9 גנים (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, Retn) באו לידי ביטוי ברמות גבוהות באופן חריג . בנוסף, גרימת ביטוי של 3 גנים אלה (Hormad1, Zg16 ו Cyp3a11) בתאי גזע עובריים משמעותית immunogenicity על השתלת אל מקבלי בהתאמה גנטית 18. לכן, קבוצה של 9 חלבונים יש פוטנציאל לגרום דחייה חיסונית של תאים שמקורם בתאי iPS לאחר העברת המאמצת, עשוי לייצג סמנים immunogenic. ובכל זאת, immunogenicity הפוטנציאל של התא iPS-deמבותק לימפוציטים מסוג T טרם נקבע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר Shinya יאמאנאקה (אוניברסיטת קיוטו) למתן iPS-MEF-NG-20D-17 תאים בשורה, ד"ר דריו Vignali (בית החולים למחקר סנט ג'וד ילדים) לתמיכה OT1-2A • pMig השנייה מבנה, ד"ר חואן קרלוס Zuniga-Pflucker (המחלקה לאימונולוגיה, אוניברסיטת טורונטו) על תמיכתה קו OP9-DL1 התא, וד"ר קנט E Vrana (המחלקה לפרמקולוגיה, פן סטייט קולג' לרפואה) על העזרה את העיצוב של מחקר זה. פרויקט זה ממומן, תחת מענקים עם מספר גרנט K18CA151798 מן המכון הלאומי לסרטן, אמון Barsumian ואת קרן מחקר מלנומה (שיר ג').

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).
התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).More

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter