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Immunology and Infection

Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T

doi: 10.3791/3986 Published: May 14, 2012

Summary

Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de cualquiera

Abstract

La transferencia de células adoptivo (ACT) de antígenos específicos de células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) es un tratamiento prometedor para una variedad de tumores malignos 1. CTL puede reconocer las células malignas mediante la interacción con los antígenos tumorales receptores de células T (TCR), y citotoxinas liberación de citoquinas, así como para matar las células malignas. Se sabe que menos disociados y central-memoria como-(denominado altamente reactivo) CTL son la población óptima para ACT basado en inmunoterapia, porque estos CTL tienen un potencial proliferativo alta, son menos propensos a la apoptosis que las células más diferenciadas y tienen un mayor capacidad para responder a las citoquinas homeostáticos 2-7. Sin embargo, debido a las dificultades en la obtención de un elevado número de linfocitos T citotóxicos tales de los pacientes, hay una necesidad urgente de encontrar un nuevo enfoque para generar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para el éxito a base de ACT-terapias.

TCR transducción del vástago auto-renovablecélulas para la reconstitución inmune tiene un potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades 8-10. Sin embargo, el enfoque para obtener células madre embrionarias (CME) de los pacientes no es factible. Aunque el uso de células madre hematopoyéticas (HSC) con fines terapéuticos ha sido ampliamente aplicado en la clínica de 11-13, las CMH se han reducido la capacidad de diferenciación y proliferación, y las CMH son difíciles de crecer en cultivo celular in vitro 14-16. La tecnología reciente de células iPS y el desarrollo de un sistema in vitro para la entrega de genes son capaces de generar células iPS de pacientes sin ningún tipo de abordaje quirúrgico. Además, como CME, las células iPS poseen la capacidad proliferativa indefinida in vitro, y se ha demostrado que se diferencian en células hematopoyéticas. De este modo, las células iPS tienen un mayor potencial para ser utilizado en el ACT basado en inmunoterapia en comparación con los CES o HSCs.

Aquí, se presentan métodos para la generación de linfocitos Tcitos de las células iPS in vitro y en vivo de la programación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos de las células iPS para la promoción de la vigilancia del cáncer inmunológico. La estimulación in vitro con un ligando muesca impulsa la diferenciación de células T a partir de células iPS, y TCR resultados de transducción de genes en células iPS diferenciadores en antígenos específicos de células T in vivo, lo cual impide el crecimiento del tumor. De este modo, demostramos antígeno específico de la diferenciación de células T a partir de células iPS. Nuestros estudios proporcionan un enfoque potencialmente más eficientes para la generación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos para las terapias basadas en ACT y facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas para las enfermedades.

Protocol

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1. Cultivo Celular

  1. Preparación de células alimentadoras irradiados SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) para el cultivo.
    SNL76 / 7 células generalmente se mantienen en 10% de suero fetal bovino (SFB) de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) medios de comunicación.
    1. Un plato de cultivo o matraz se recubre con un 0,1% de solución de gelatina en 37 ° C; incubadora durante 30 minutos antes de recuperarse SNL76 / 7 células de nitrógeno líquido.
    2. Cuando SNL76 / 7 células alcanzan la confluencia, las células se tripsinizaron apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se resuspendieron en medio fresco.
    3. Resuspendidas SNL76 / 7 células se irradiaron en un irradiador 60 Co con una dosis de 5000 rads.
      Enfoque alternativo, las células SNL76 / 7 podría ser sustituido por fibroblastos de embriones de ratón (MEF) y mitomicina inactivación-podría reemplazar la irradiación.
    4. Después de la irradiación, las células se centrifugaron a 400 g durante 5 min y se resuspendió en 10% dimetilsulfóxido (DMSO) tampón de FBS congelación, en alícuotacrioviales y conservados en nitrógeno líquido para uso futuro.
  2. Preparación de OP9-DL1 células para la diferenciación in vitro.
    OP9-DL1 células se mantiene generalmente en un 20% de SFB α-medio esencial mínimo (α-MEM) los medios de comunicación. Cuando llegan a las células confluencia se dividirá en una dilución 1:5.
  3. Preparación de células de timoma E.G7.
    E.G7 células de timoma se mantiene generalmente en FBS al 10% de Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) -1640 medios. Al llegar a la confluencia, las células se dividen en una dilución de 1:10.
  4. Mantenimiento general de IPS y TCR-transduced células iPS.
    1. Una placa de cultivo se cubrirá con el 0,1% de solución de gelatina en 37 ° C durante 30 minutos antes de la siembra de células irSNL76 / 7 alimentadoras un día antes de la recuperación o la división de las células iPS.
    2. Para IPS división células, las células se tripsinizaron apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se resuspendió en 15% de SFB medios DMEM.
    3. IPS TrypsinizedLas células se incubaron en un plato de cultivo fresco durante 30 minutos en 37 ° C incubadora antes de la siembra en plato fresco celular irSNL76 / 7 alimentador prerrevestida para excluir las células diferenciadas y células alimentadoras de residuos.
    4. Después de la incubación, 4 x 10 6 células se sembraron en una placa de cultivo de 100 mm.

2. En Programación in vitro

  1. En el sistema de cocultivo in vitro.
    1. En el día 0, las células iPS 5x10 4 se sembraron sobre una placa de cultivo de 100 mm que contiene confluente OF9-DL1 monocapa celular en FBS 20% α-MEM medios.
    2. En el día 3, los medios de cultivo se cambió por otras nuevas.
      1. En el día 5, las células se tripsinizaron fuera y se centrifuga a 400 g durante 5 min antes de la incubación en un plato de cultivo de 100 mm fresco durante 30 minutos en 37 ° C incubadora.
      2. Células flotantes se recogieron y se contaron, 5x10 5 células se transfieren a un cultivo frescoplato que contiene confluente OF9-DL1 monocapa celular en FBS 20% α-MEM medios. Citoquinas mFlt-3L (concentración final: 5 ng / ml) se añadió en la cultura.
      1. En el día 8, las células poco adheridas se pipetear suavemente hacia abajo.
      2. Se lava la capa de alimentación OP9-DL1 con 10 ml de PBS una vez más para obtener la máxima recuperación de la parte diferenciadas las células iPS.
      3. Después de cosechar las células de la cocultivo, las células se centrifugaron a 400 g durante 5 min y se resuspendió en 20% de SFB alfa-MEM medios suplementados con mFlt-3L (5 ng / ml) y MIL-7 (1 ng / ml).
      4. Las células se transfieren a una placa de cultivo de 6 pocillos recubiertos con confluentes OP9-DL1 células. Por lo general, las células iPS recuperados de una placa de cultivo de 100 mm se transfirió a un pocillo de la placa 6-bien.
      1. A partir del día 10, los medios de cultivo se puede cambiar en cualquier otro día (20% de SFB α-MEM medios supplemented con mFlt-3L (5 ng / ml) y MIL-7 (1 ng / ml)).
      2. Placas de cultivo recubiertas con alimentador OF9-DL1 células se cambiaron en 4-6 días, dependiendo del crecimiento de las células alimentadoras.
  2. En la maduración in vivo de células iPS parcialmente diferenciadas.
    1. En el Día 22 de cocultivo, las células iPS se tripsinizaron apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se incubaron en un plato de cultivo fresco en 37 ° C durante 30 minutos.
    2. Células flotantes se recogen, pasa a través de 70 micras colador de nylon para excluir grupos de células que podrían causar embolia pulmonar a los ratones y se lavó tres veces en PBS frío.
    3. Las células se resuspendieron en PBS con una concentración de 1.5x10 7 células / ml.
    4. Las células se mantienen en hielo antes de la inyección.
    5. Antes de la inyección iv a través de la vena de la cola, los ratones se coloca bajo una luz infrarroja para dilatar la vena de la cola.
    6. Después de la vena dilatation, 200 l suspensión de células o células 3x10 6 se transfiere a un adoptiva de 4 semanas de edad B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J del ratón a través de su vena de la cola. Tres semanas son permitidos para la maduración in vivo de la parte diferenciadas las células iPS.
  3. Evaluación.
    1. Los cambios morfológicos de las células diferenciadas y las tasas de recuperación de las células. Figura 1.
      1. En diferentes días de cocultivo con células OP9-DL1, imágenes de células vivas se tomarán bajo el microscopio convencional.
      2. Tasas de recuperación de células se calcula basándose en el número de células que cosechadas a partir de cultivo.
    2. Citometría de flujo análisis de los cambios de marcadores de superficie. Figura 2a.
      1. En diferentes días de cocultivo, las células se eliminará de cultivo por tripsinización y se lavó con PBS frío antes de proceder a la tinción de la superficie celular.
      2. Antes de teñir el ingenioh diferentes anticuerpos conjugados con fluorocromo, las células se bloquearon por bloqueador Fc 24G2 en 4 ° C durante 20 minutos.
      3. Después de 20 minutos de tinción en 4 ° C, las células se lavaron tres veces en PBS frío antes del examen de citometría de flujo.
    3. La activación de células in vitro diferenciadas iPS la figura 2b..
      1. Un día antes del ensayo de activación, precapa una placa de 24 pocillos con anti-CD3 (concentración final: 4 mg / ml, en PBS) a 4 ° C durante la noche.
      2. El día 22 de co-cultivo, las células iPS derivadas células T se recogerá a partir de la cultura y se lavó con PBS antes de la estimulación con una placa recubierta con anti-CD3 y soluble anti-CD28 anticuerpos (concentración final: 4 mg / mL).
      3. La incubación se llevó a cabo en 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 40 horas y luego Befeldin A se añadió en cultivo durante otras 4 horas.
      4. Al final de cocultivo, las células serán Harlavó creados, y bloqueado por bloqueador Fc como se describió anteriormente. Células bloqueados se tiñeron para los marcadores de superficie como la cadena Vβ CD8 y TCR mediante el uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos.
      5. Después de la tinción de la superficie celular, las células se fijará mediante el uso de formaldehído al 4% y permeabilized mediante el uso de equipo de BioLegend de permeabilizante.
      6. Después de permeabilización, las moléculas intracelulares como la IL-2 y IFN-γ se tiñeron mediante fluorocromo anticuerpos conjugados.
      7. Antes de examen de citometría de flujo final, las células se lavaron tres veces en PBS frío para excluir anticuerpos excesivas.
    4. La maduración en Rag-/ - ratones.
      1. Después de tres semanas de desarrollo in vivo, Rag-/ - ratones se sacrificaron, el bazo y los ganglios linfáticos serán removidos de los ratones.
      2. Las células individuales se procesan a través de avería mecánica. Los glóbulos rojos se lisaron mediante un tampón de lisis y ACKmononucleocitos se recogió y se lavó dos veces en PBS frío.
      3. Después del lavado, las células se bloquearon con bloqueador Fc 24G2 en 4 ° C durante 20 minutos y al final de bloqueo, las células se tiñeron con diferentes fluorocromo conjugados anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 y los anticuerpos anti-TCRβ en 4 ° C durante 20 minutos.
      4. Al final de la tinción, las células se lavaron tres veces en PBS frío antes del examen de citometría de flujo.

3. En Programación in vivo

  1. Generación de construcción retroviral.
    1. MSCV-IRES-DsRed (MIDR) vector se construye sobre la base de MSCV-IRES-GFP vector sustituyendo el gen de la GFP con el gen DsRed.
    2. OT-I de células T del gen del receptor se subclonó en el vector MIDR para hacer OT-I/MiDR construir.
  2. Transducción retroviral y la clasificación de células.
    1. Plat-E células embalaje are utiliza para generar pseudovirus que se utilizará para la transducción siguiente.
      1. 3x10 6 E-Plat células se siembran en una cápsula de 100 mm cultura un día antes de la transfección.
    2. En el día 0, Plat-E células se transfectaron con OT-I MIDR plásmido mediante el uso de reactivo GeneJamma transfección.
    3. El día 1, 1x10 6 células iPS se sembraron en un pozo de un 0,1% de gelatina prerrevestida placa de 24 pocillos.
      1. El día 2, pseudovirus sobrenadante que contiene desde Plat-E la cultura se recogerán y se pasa a través de un 0,4 micras de filtro para excluir a posibles contaminantes.
      2. La transducción se llevará a cabo bajo la condición de 32 ° C centrífuga a 1400 rpm durante 1 hora en presencia de 5 g / ml de polibreno.
      3. Después de centrifugar basado en la transducción, las células se colocan en 32 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante la noche.
    4. El día 3, repetir el día 2 transduction procedimiento como se describió anteriormente. Una placa de 6 pocillos se pre-revestido con células irSNL76 / 7 de conexión para su uso futuro.
    5. En el día 4, las células transducidas iPS se tripsinizaron apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se sembraron en precubiertos células alimentadoras irSNL76 / 7.
    6. En la confluencia, las células se tripsinizaron apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se procesaron para la clasificación de células. Las buenas prácticas agrarias y DsRed células doble positivas, serán ordenados por clasificador de células MoFlo. Células clasificadas se cultivaron en células alimentadoras irSNL76 / 7 para su uso futuro.
  3. La transferencia adoptiva y el desafío del tumor.
    OT-I TCR transducidas iPS (OT-I/iPS) las células se mantiene generalmente en células alimentadoras irSNL76 / 7 como se describe anteriormente.
    1. En el día de la transferencia adoptiva, las células se tripsinizan OT-I/iPS apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se resuspendieron en medio fresco.
    2. 30 minutos de incubación en una placa de cultivo fresco en la incubadora de 37 ° C se requiere para eliminar células diferenciadasy remanentes de células alimentadoras.
    3. Al final de la incubación, las células flotantes se recogen y se centrifuga a 400 g durante 5 min.
    4. Sedimento celular se lavó en PBS frío durante tres veces, y las células se hace pasar por un tamiz de nylon 70 micras entre dos lavados de excluir grupos de células (2X filtración).
    5. Después del lavado, las células se contaron y se resuspendieron en PBS frío en una concentración de 1.5x10 7 células / ml.
    6. Las células se mantienen en hielo antes de la inyección.
    7. Para la transferencia adoptiva, 4-6 semanas de edad ratones hembra C57BL/6J se utilizará. Antes de la inyección iv a través de la vena de la cola, los ratones se coloca bajo una luz infrarroja para dilatar las venas de la cola.
    8. Después de la dilatación venosa, 200 l suspensión de células o células 3x10 6 se adoptivamente transferido a través de la vena de la cola. Seis semanas será permitido para la maduración in vivo de OT-I TCR transducidas células iPS.
      1. Después de seis semanas de la inyección iv, 4x10 6 células E.G7 timoma se inocularon por vía intraperitoneal.
      2. E.G7 células de timoma se recogerán a partir de cultivo y se lavó tres veces en PBS.
      3. Al final del lavado, las células se suspendieron en PBS frío en una concentración de 8x10 7 células / ml.
      4. 50 l suspensión de células o 4x10 6 células se inyecta en la cavidad peritoneal.
  4. Evaluación.
    1. In vitro, la caracterización de OT-I TCR transducidas células iPS.
      1. Fluorescente examen microscópico de DsRed, las buenas prácticas agrarias de células positivas dobles se llevará a cabo bajo microscopio de fluorescencia convencional con células vivas no fijadas.
      2. La integración de la expresión génica y serán analizados por PCR y análisis de RT-PCR.
        1. Cellular DNA o RNA se aisló por separado a partir de muestras mediante el uso de ADN de Qiagen oKit de aislamiento de ARN.
        2. PCR y RT-PCR se realizó mediante el uso de cebadores que reconocen específicamente la región VDJ recombinada del TCR Vβ5 cadena.
    2. El desarrollo de células T y la maduración. Figura 3a.
      1. En la semana 2, 4 y 6 de la célula después de la transferencia, los animales se sacrificaron y los nodos de bazo, nódulos será eliminado de los animales.
      2. Única suspensión celular se realiza a través de avería mecánica. Los glóbulos rojos se lisaron mediante un tampón de lisis ACK y mononucleocitos se recogió y se lavó dos veces en PBS frío.
      3. Después del lavado, las células se bloquearon con bloqueador Fc 24G2 en 4 ° C durante 20 minutos y al final de bloqueo, las células se aliquotted y teñidas con diferentes anticuerpos conjugados fluorocromo en 4 ° C durante 20 minutos.
      4. Al final de la tinción, las células se lavaron tres veces en PBS frío antes de cargar el citómetro de flujo.
    3. Estimulación de péptidos. Figura 3b.
      1. El día 50 de reto tumoral, los animales serán sacrificados y los ganglios del bazo, nódulos se hayan extraído de animales.
      2. Única suspensión celular se realiza a través de avería mecánica. Los glóbulos rojos se lisaron mediante un tampón de lisis ACK y mononucleocitos se recogió y se lavó dos veces en PBS frío.
      3. Linfocitos T CD8 + se aisló mediante el uso de células CD8 + de Miltenyi Biotec de células T Kit de aislamiento. Aisladas células T CD8 + se mezclará con esplenocitos irradiados aisladas de los ratones no tratados C57BL/6J en la proporción de 1:10 y se pulsan con 0,5 mmol / ml OVA 257-264 péptido durante 40 horas. A partir de entonces, Brefeldina A se añadirá a la cultura de otras 4 horas.
      4. Al final de cocultivo, las células se recogen, se lavan y se bloquearon por bloqueador Fc como se describió anteriormente.
      5. Células bloqueados se tiñeron para la marca de la superficieres como CD8 y TCR Vβ5 la cadena mediante el uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos.
      6. Después de la tinción de la superficie celular, las células se fijará mediante el uso de formaldehído al 4% y permeabilized mediante el uso de equipo de permeabilización celular.
      7. Después de permeabilización, las moléculas intracelulares como la IL-2 y IFN-γ se tiñeron mediante fluorocromo anticuerpos conjugados.
      8. Antes de examen de citometría de flujo final, las células se lavaron tres veces en PBS frío para excluir anticuerpos excesivas.
    4. In vivo matando ensayo. Figura 3C.
      1. Los esplenocitos de los ratones no tratados C57BL/6J serán aislados y marcados con carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) como células diana.
      2. Las células marcadas con 5 mol / ml CFSE (células CFSE hi) se pulsaron con 10 mg / ml OVA 257-264 péptido y las células marcadas con 0,5 mol / ml CFSE (CFSE células LO) ​​no se pulsaron. Una mezcla de 2.5x10 6 células CFSE hi más 2.5x10 6 células CFSE LO será adoptively transferido por vía iv en destinatario indicado.
      3. Después de 16 horas, esplenocitos de los ratones se aisló y células CFSE + se analizaron por citometría de flujo.
    5. Tumoral intraperitoneal recuento de células. Figura 4.
      Al día 20 de desafío del tumor, los ratones se sacrificaron y lavado cavidad peritoneal se realiza mediante el uso de PBS frío. El lavado peritoneal se recuperó las células tumorales se contará.
    6. Tumor de células T infiltrantes de identificación. Figura 5.
      1. En la última etapa de desafío del tumor, los ratones se sacrificaron y el tumor se retira de la cavidad peritoneal de los diferentes grupos.
      2. El tumor se corta en trozos, de una sola pieza se pondrá en un criovial y se coloca en hielo seco de inmediato, la otra mitad se fija en laformaldehído y una tercera pieza se conserva en RPMI acondicionado-1640 para uso futuro.
      3. Tinción H & E se llevará a cabo según el protocolo general de formaldehído y fija las muestras de parafina envueltos.
      4. Tinción por inmunofluorescencia se llevará a cabo en muestras criopreservadas.
        1. Tejido será seccionada y en conserva a -20 ° C antes de su uso.
        2. Las secciones de tejido será secó al aire 15 minutos antes de los 15 minutos fijación acetona fría.
        3. Después de la fijación, las secciones será seca al aire durante otros 15 minutos antes de 5 minutos de lavado PBS.
        4. Después de diapositivas de lavado lugar, en una cámara húmeda y cubrir la sección de tejido con 30 l 3% de BSA en PBS durante 30 minutos para bloquear la unión no específica.
        5. Al final del bloqueo, borra de tampón de bloqueo y cubrir las secciones de tejido con una mezcla de 50 l de PE-anti-TCR Vα2 anticuerpos y anticuerpos FITC anti-OVA diluidas en 3% de BSAen PBS.
        6. Incubar en una cámara húmeda durante 2 horas y al final de la incubación, los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS frío y se monta con un medio a base de agua de montaje antes fluorescente examen microscópico.
      5. Citometría de flujo análisis de las células T tumor infiltrante.
        1. El tumor será aplastado en suspensión de células individuales y los glóbulos rojos se lisaron con el tampón de lisis ACK.
        2. Después de lavar y de bloqueo, las células se etiqueta con diferentes anticuerpos conjugados fluorocromo que reconocen específicamente CD8, TCR Vα2 y TCR V β5 moléculas que expresadas en la superficie celular.
    7. Supervivencia de los ratones. Figura 6.
      Después de la exposición del tumor, la supervivencia del ratón se vigilará de cerca.

4. Los resultados representativos

CD3 y TCRβ se utilizan como marcadores de Tcélulas. Para determinar si la estimulación de las células iPS con la muesca DL1 ligando podría contribuir a la diferenciación de células T, se evaluó la expresión de CD3 y + TCRβ en iPS células derivadas de células, y la expresión más analizado de CD4 y CD8, apertura de puerta en CD3 + y + TCRβ población. Como se muestra aquí, el día 22, CD3 + CD4 + TCRβ - CD8 + individuales positivos (SP) las células T se generaron a partir de células iPS in vitro. Además, los derivados de células iPS células SP-fueron capaces de producir IL-2 y IFN-γ cuando se estimulan in vitro mediante la placa recubierta con anti-CD3 y CD28 solubles anticuerpos anti-(fig. 2), lo que sugiere las iPS derivadas de células Las células T son funcionales.

Después de la transferencia adoptiva en ratones receptores, la mayoría de TCR-gen células transducidas iPS sometió a la diferenciación en células CD8 + CTL, que respondían a la estimulación in vitro de péptido por síhormigonado de IL-2 y IFN-γ (fig. 3). Lo más importante es la transferencia adoptiva de TCR-transduced células iPS provocado la infiltración de linfocitos T citotóxicos OVA-reactivas en los tejidos tumorales y animales protegidas del reto tumoral (Fig. 5-6). Por lo tanto, el gen TCR transducidas células iPS pueden diferenciarse en funcionales específicas de antígeno-CTL in vivo.

Figura 1
Figura 1. Morfología de diferenciación de las células iPS. En varios días, las células iPS de ratón fueron co-cultivadas con OF9-DL1 células en α-MEM suplementado con 20% de FCS y 2,2 g / l de bicarbonato de sodio en presencia de 5 ng / ml mFlt3L y 1 ng / ml de mIL-7 .

Figura 2
Figura 2. Diferenciación de las células T a partir de células iPS. Ratones células iPS fueron co-cultivadas con OF9-DL1 células como se describe en la Figura 1. En el díaay 22, derivadas de células iPS células se aislaron y analizaron. A) CD4 + CD8 - o CD4 - CD8 + después de la inyección en CD3 + y + TCRβ poblaciones. B) Las células se estimularon con la placa revestida con anti-CD3 y anti-CD28 soluble anticuerpos durante 5 horas a 37 ° C en 5% de CO 2. IL-2 e IFN-γ-fueron analizados por tinción intracelular, después de la inyección en células CD4 en vivo - linfocitos T CD8 +.

Figura 3
Figura 3. Antígeno CD8 + específicas de desarrollo de células T a partir de células iPS en vivo. OT-I-gen TCR transducidas células iPS fueron inyectados iv en ratones C57BL / 6. Después de seis a diez semanas, OVA-CD8 + específicas Vβ5 + desarrollo de células T se determinó. A) CD8 + Vβ5 + células T de LN agrupados y el bazo fueron analizadas por citometría de flujo, después de la inyección en CD8 poblaciones +. B) la IL-2 e IFN-γ producción (líneas oscuras, áreas sombreadas corresponden a controles de isotipo) se determinaron por tinción intracelular de citoquinas, después de la inyección en los CD8 + + Vβ5 poblaciones. C) En vivo proliferación / citotoxicidad del ensayo. CFSE alta (picos de la derecha) y he aquí CFSE (picos de izquierdas) las células diana fueron pulsadas con OVA 257-264 péptido y el control, respectivamente, y se inyectaron en ratones diez semanas después de la transferencia de células iPS o un día después de que la transferencia de OT-CTL.

Figura 4
La transferencia de la figura 4. Adoptivo de OT-I gen TCR-transduced células iPS suprime el crecimiento tumoral. OT-I-gen TCR transducidas células iPS fueron trasladados adoptiva en ratones C57BL / 6. Un grupo de ratones fue inyectado con OVA-reactiva células T CD8 + de OT-I TCR ratones transgénicos, y un grupo de ratones no tenía la transferencia de células. Después de seis semanas, ya sea o el día siguiente después de la transferencia de células, los ratones fueron sometidos a desafiar con las células tumorales E. G-7. El día 20, las células tumorales en la cavidad peritoneal se enumeran.

Figura 5
IPS Figura 5. Derivado de células antígeno-específica CTL infiltrarse en los tejidos tumorales. En el día 30 a 35 después del desafío del tumor, los tejidos tumorales fueron examinados para el tumor reactiva infiltración de células T. A) H & E tinción. Las células inflamatorias infiltrado en los tejidos tumorales (↓). B) Marcaje inmunohistoquímico. OVA específica Vα2 CTL + (rojo) se infiltraron en OVA-que expresan los tejidos tumorales (verde). C) Single-suspensiones de células de los tejidos tumorales se analizaron para la expresión de Vα2 + y + Vβ5 por citometría de flujo, después de la inyección en la población CD8 +.

"Figura Figura 6. La transferencia adoptiva de OT-I gen TCR-transduced células iPS sostiene supervivencia de los ratones. OVA gen TCR-transduced células iPS fueron trasladados adoptiva en ratones C57BL / 6 que fueron sometidos a desafío con E. células tumorales del G-7 como se describe en la figura. 4. Supervivencia de los ratones el día 50 fue mostrado por las curvas de supervivencia Kaplan-Meier (n = 6).

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Para ACT terapias basadas en la generación in vitro de un gran número de Ag altamente reactivos específicos de las células T in vivo para la re-perfusión es una solución óptima. Aunque nuestro método in vitro da lugar funcional de las células T a partir de células iPS, un gran número de células iPS derivadas de las células mueren en cuatro semanas, sobre todo en la cuarta semana. Se concluye que las señales de supervivencia de señalización Notch mediada por el DL1 así como la IL-7 y Flt3L no son suficientes para mantener la supervivencia de iPS derivadas de células T-células progenitoras, otros factores de supervivencia puede ser cooperativa para regular estos maduración de las células. TCR transducción de genes y la estimulación in vitro con el ligando muesca diferenciación de células T en gran medida directa de las células iPS, sin embargo, las iPS derivadas de células antígeno de células T específicas todavía no puede sobrevivir más tiempo, lo que impide obtener un número adecuado de iPS derivado de células antígeno- las células T específicas para el ACT basado en inmunoterapia.

ve_content "> El desarrollo de los linfocitos T en el timo es un proceso bien ordenado. Los timocitos inmaduros que carecen de expresión de CD4 y CD8 se conocen como dobles negativos (DN) de las células. precursores de DN se dividen en subgrupos de desarrollo basado en la expresión de CD44 y CD25. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) y DN4 (CD44 - CD25 -) Sólo DN3 células que han generado una cadena de TCRβ funcional, que se empareja con la invariantes de pre-Tα y las cadenas CD3 para formar una pre-TCR y se seleccionan para la diferenciación adicional. Este evento, denominado β-selección, representa el primer puesto de control durante el desarrollo de células T. pre-TCR formación proliferación señales, la terminación de reordenamiento lugar TCRβ , y la diferenciación de los timocitos DN a los CD4 + CD8 + doble positiva (DP), la etapa 17. Nuestra estimulación in vitro won el ligando de Notch DL1 impulsa las células iPS que pasar por el puesto de control de β-selección en 2 semanas, y se convierten en pre-células T (CD3 + + TCRβ; CD25 - CD44 -, CD4-CD8 -). Adicional de 2 semanas antes de la estimulación permite que las células T maduras de tránsito en linfocitos T CD8 + (CD3 + CD4 +; TCRβ - CD8 +, CD62L + CCR7 + CD27 + CD127 +). Las células T maduras SP morirán en la ausencia de una estimulación adicional por el TCR y complejo CD3.

En la programación in vivo de antígenos específicos de los CTL de células iPS puede superar la deficiencia de obtener un número suficiente de células T para la ACT a base de terapias. A pesar del control observada de crecimiento del tumor, hemos identificado algunas limitaciones de la ACT con TCR genes transduced las células iPS. En primer lugar, al menos seis semanas en el desarrollo in vivo es esencial para la diferenciación de células T derivado del transferred las células iPS. En segundo lugar, nos dimos cuenta de pérdida de la piel, la osteoporosis y otras manifestaciones autoinmunes menores en los ratones que recibieron TCR-transduced células iPS como se observa en algunos ensayos clínicos que administran las células T basada en la inmunoterapia del cáncer. Estos efectos pueden ser causados ​​por la generación de otros tipos de células inmunes de las células transferidas iPS. Sin embargo, cómo estas células se generan in vivo sigue siendo desconocido. Transferencia tercer lugar, adoptivo de TCR genes transduced células iPS tiene el riesgo de generar teratomas, debido a su fenotipo tallo. Sin embargo, hasta ahora en nuestro estudio, sólo se identifica la masa en una extrathymic Rag1 - / - ratones y no se han observado anomalías en C57BL convencional / 6 ratones. Por lo tanto, le sugerimos que, para obtener la máxima eficiencia, es mejor para obtener partido de fondo genético para la diferenciación in vivo iPS.

En contraste con los derivados de la CES, la expresión de genes anormales en algunas células diferenciadas a partir de células iPS tienen la potential para inducir células T dependiente de la respuesta inmune en los receptores singénicos 18. Por lo tanto, la inmunogenicidad de las células derivadas de pacientes específicos de las células iPS deben ser evaluados antes de cualquier aplicación clínica de estas células autólogas se contempla. Mediante el análisis de los perfiles de expresión génica de las células iPS derivadas de las células, se ha demostrado que un grupo de 9 genes (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, SPT1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, Retn) se expresaron en niveles anormalmente altos . Además, induce la expresión de tres de estos genes (Hormad1, Zg16 y Cyp3a11) en células madre embrionarias aumentó significativamente la inmunogenicidad en el trasplante en receptores genéticamente compatibles 18. Así, el grupo de 9 proteínas tiene el potencial para causar el rechazo inmunológico de las células iPS derivadas de las células después de la transferencia adoptiva, y pueden representar marcadores inmunogénicas. No obstante, la inmunogenicidad potencial de iPS De célulasRIVED linfocitos T no ha sido determinada.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Shinya Yamanaka (Universidad de Kyoto) para proporcionar iPS-MEF-Ng-20D-17 línea celular, el Dr. Darío Vignali (Hospital St. Jude Childrens Research) para apoyar la OT1-2A • pMig II construcción, el Dr. Juan Carlos Zúñiga Pflucker (Departamento de Inmunología de la Universidad de Toronto) para el apoyo a la línea celular OP9-DL1, y el Dr. Kent Vrana E (Departamento de Farmacología de la Universidad de Penn State College of Medicine) para ayudar al diseño de este estudio. Este proyecto está financiado, en virtud de concesiones con el número de concesión K18CA151798 del Instituto Nacional del Cáncer, la Fundación Barsumian y el Melanoma Research Foundation (canción J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

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References

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Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T
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Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).More

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

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