Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter

Published: May 14, 2012 doi: 10.3791/3986
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

Generering av T-lymfocyter från inducerade (IPS) pluripotenta stamceller ger ett alternativt tillvägagångssätt att använda embryonala stamceller för T-cell-baserad immunterapi. Metoden visar att genom användning av antingen

Abstract

Adoptiv cellöverföring (ACT) av antigen-specifika CD8 + cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) är en lovande behandling för en mängd olika maligniteter 1. CTL kan känna igen maligna celler genom att interagera tumörantigener med de T-cellreceptorer (TCR), och cytotoxiner frisättning samt cytokiner för att döda maligna celler. Det är känt att mindre differentierade och centralt-minne-liknande (benämnda högreaktiva) CTL är den optimala populationen för ACT-baserade immunterapi, eftersom dessa CTL har en hög proliferativ potential, är mindre benägna att apoptos än mer differentierade celler och har en högre förmåga att svara på homeostatiska cytokiner 2-7. På grund av svårigheter att erhålla ett stort antal sådana CTL från patienter, finns det ett akut behov av att hitta en ny strategi för att generera mycket reaktiva Ag-specifika CTL för framgångsrika ACT-baserade behandlingar.

TCR transduktion av själv-förnybara stamceller för immunrekonstituering har en terapeutisk potential för behandling av sjukdomar 8-10. Emellertid är metoden för att erhålla embryonala stamceller (ESC) från patienter inte genomförbart. Även om användningen av hematopoietiska stamceller (HSCs) för terapeutiska ändamål har i stor utsträckning i klinik 11-13, har minskat HSCs differentiering och proliferativa kapacitet, och HSCs är svåra att expandera i cellodling in vitro 14-16. Nya iPS cell teknik och utveckling av ett in vitro-system för gentillförsel kan generera iPS-celler från patienter utan kirurgisk metod. Dessutom, liksom ekonomiska och sociala råd, iPS-celler har obestämd proliferativ kapacitet in vitro och har visats differentiera till hematopoietiska celler. Således iPS-celler har större potential att användas i ACT-baserade immunterapi jämfört med ekonomiska och sociala råd eller HSCs.

Här presenterar vi metoder för generering av T-lymfocyter från iPS-celler in vitro och in vivo-programmering av antigenspecifika CTL från iPS-celler för att främja cancer immun övervakning. Stimulering in vitro med en Notch-ligand driver T-cell differentiering från iPS-celler, och TCR-genen resulterar i transduktion iPS-celler differentiera till antigen-specifika T-celler in vivo, vilket förhindrar tumörtillväxt. Sålunda, visar vi antigenspecifik differentiering T-cell från iPS-celler. Våra studier ger en potentiellt mer effektiv metod för att generera antigenspecifika CTL för ACT-baserade behandlingar och underlätta utvecklingen av terapeutiska strategier för sjukdomar.

Protocol

1. Cellodling

  1. Beredning av bestrålade SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) matarceller för kultur.
    SNL76 / 7 celler bibehålls generellt i 10% fetalt bovint serum (FBS) Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) medium.
    1. En odlingsskål eller kolv skall beläggas med 0,1% gelatinlösning i 37 ° C, inkubator under 30 minuter innan den återhämtar SNL76 / 7 celler från flytande kväve.
    2. När SNL76 / 7 cellerna når sammanflytning, kommer celler trypsiniserades bort, centrifugerades vid 400 g under 5 min och återsuspenderades i färskt medium.
    3. Återsuspenderades SNL76 / 7 celler kommer att bestrålas i en 60 Co-bestrålningsanordningen med en dos av 5000 Rad.
      Alternativa tillvägagångssätt skulle SNL76 / 7 celler ersätts med mus embryonala fibroblaster (MEF) och mitomycin-inaktivering kan ersätta bestrålning.
    4. Efter bestrålning kommer celler centrifugeras vid 400 g under 5 min och återsuspenderades i 10% dimetylsulfoxid (DMSO) FBS frysning buffert, alikvot tillkryokärl och konserverade i flytande kväve för framtida bruk.
  2. Beredning av OP9-DL1 celler för in vitro-differentiering.
    OP9-DL1 celler kommer i allmänhet bibehållas i 20% FBS α-minimalt essentiellt medium (α-MEM) media. När de når till konfluens celler delas i en 1:5 utspädning.
  3. Beredning av E.G7 tymom celler.
    E.G7 thymoma celler kommer i allmänhet bibehållas i 10% FBS Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium. När de når till konfluens, kommer celler delas i en 1:10 spädning.
  4. Allmänt underhåll av IPS och TCR-transducerade iPS-celler.
    1. En kultur maträtt kommer att beläggas med 0,1% gelatin lösning i 37 ° C i 30 minuter innan sådd irSNL76 / 7 matarceller en dag före återvinning eller uppdelning av iPS-celler.
    2. För IPS-celler split kommer cellerna trypsinerades bort, centrifugerades vid 400 g under 5 min och återsuspenderades i 15% FBS DMEM-medium.
    3. Trypsinerade iPSceller kommer att inkuberas på en ny kultur skålen för 30 minuter i 37 ° C inkubator innan sådd på färsk irSNL76 / 7 feeder cells förbelagda maträtt att utesluta differentierade celler och rester celler feeder.
    4. Efter inkubation kommer 4 × 10 6 celler seedas i en 100 mm odlingsskål.

2. In vitro programmering

  1. In vitro-samodling systemet.
    1. På dag 0, kommer 5x10 4 iPS-celler ympas på en 100 mm kultur maträtt med konfluenta OP9-DL1 cellmonoskikt i 20% FBS α-MEM medier.
    2. På dag 3, kommer odlingsmedier bytas mot nya.
      1. På dag 5, kommer celler trypsineras bort och centrifugerades vid 400 g under 5 minuter före inkubering på en ny 100 mm odlingsskål i 30 minuter i 37 ° C inkubator.
      2. Flytande celler samlas och räknas, kommer 5x10 5 celler överföras till en ny kulturskål med konfluenta OP9-DL1 cellmonoskikt i 20% FBS α-MEM medier. Cytokin mFlt-3L (slutlig koncentration: 5 ng / ml) kommer att tillsättas i kulturen.
      1. På dag 8, kommer löst fastsatta celler försiktigt pipettera ned.
      2. Tvätta OP9-DL1 utfodring lager med 10 ml PBS en gång för att få den maximala återvinning av delvis differentierade iPS-celler.
      3. Efter skördning celler från samodling, kommer celler centrifugeras vid 400 g under 5 min och återsuspenderades i 20% FBS α-MEM-medium kompletterat med mFlt-3L (5 ng / ml) och mIL-7 (1 ng / ml).
      4. Celler kommer att överföras till en 6-brunnars odlingsplatta belagd med konfluenta OP9-DL1 celler. Vanligtvis iPS-celler som återvunnits från ett 100 mm odlingsskål överförs till en brunn av 6-brunnars platta.
      1. Från dag 10, kommer odlingsmedier ändras varannan dag (20% FBS α-MEM-medium supplemented med mFlt-3L (5 ng / ml) och mIL-7 (1 ng / ml)).
      2. Odlingsplattor belagda med matare OP9-DL1 cellerna kommer att ändras i 4-6 dagar, beroende på tillväxten av matarceller.
  2. In vivo-mognad av partiellt differentierade iPS-celler.
    1. På dag 22 av samodling, kommer iPS celler trypsiniserades bort, centrifugerades vid 400 g under 5 minuter och inkuberades på en ny odlingsskål i 37 ° C under 30 minuter.
    2. Flytande celler kommer att samlas, passera genom 70 ^ m nylon sil att utesluta cellklumpar som kan orsaka lungemboli till möss och tvättades tre gånger i kall PBS.
    3. Cellerna kommer att återsuspenderas i PBS med en koncentration av 1.5x10 7 celler / ml.
    4. Celler kommer att bibehållas på is före injektion.
    5. Innan intravenös injektion genom svansvenen kommer möss placeras under ett infrarött ljus för att vidga sin svansvenen.
    6. Efter ven dilatation, 200 ul cellsuspension eller 3x10 6 celler kommer att adoptivt överföras till en 4 veckor gammal B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J-mus genom svansvenen. Tre veckor är tillåtna för in vivo mognaden av delvis differentierade iPS-celler.
  3. Utvärdering.
    1. Morfologiska förändringar av differentierade celler och cell återvinningen. Figur 1.
      1. Vid olika dagar samodling med OP9-DL1 celler kommer levande cell bilder tas under konventionell mikroskop.
      2. Cell återvinningsgraderna kommer att beräknas baserat på antalet celler som skördades från kulturen.
    2. Flödescytometrisk analys av förändringar ytmarkör. Figur 2a.
      1. Vid olika dagar av samodling, kommer celler avlägsnas från kulturen genom trypsinering och tvättades med kall PBS innan man går vidare till cell ytfärgning.
      2. Innan färgning with olika fluorokroma konjugerade antikroppar, kommer celler blockeras av Fc-blockerare 24G2 i 4 ° C i 20 minuter.
      3. Efter 20 minuter färgning i 4 ° C kommer cellerna att tvättas tre gånger i kall PBS före flödescytometrisk undersökning.
    3. Aktivering av in vitro differentierade iPS-celler. Figur 2b.
      1. En dag före aktivering analysen, förbeläggning en 24-brunnsplatta med anti-CD3 (slutlig koncentration: 4 pg / ml, i PBS) vid 4 ° C över natten.
      2. På dag 22 av samodling, härledda T-celler iPS-celler kommer att skördas från kultur och tvättas med kall PBS innan stimulering med platta belagd anti-CD3 och löslig anti-CD28-antikroppar (slutlig koncentration: 4 pg / ml).
      3. Inkubationen genomförs i 37 ° C, 5% CO-2-inkubator under 40 timmar och sedan Befeldin A kommer att läggas till odling under ytterligare 4 timmar.
      4. Vid slutet av samodlingen, kommer celler att vara harmoniintjänade, tvättades och blockerades av Fc-blockerare, såsom beskrivits ovan. Blockerade celler kommer att färgas för ytmarkörer som CD8 och TCR Vp-kedja med fluorokroma konjugerade antikroppar.
      5. Efter cellytan färgning kommer celler fastställas genom att använda 4% formaldehyd och permeabiliserades med Biolegend s permeabilisering kit.
      6. Efter permeabilisering, kommer intracellulära molekyler som IL-2 och IFN-γ färgas genom användning fluorokroma konjugerade antikroppar.
      7. Före slutlig flödescytometrisk undersökning, kommer celler tvättades tre gånger i kall PBS för att utesluta alltför antikroppar.
    4. Mognad i Rag-/ - möss.
      1. Efter tre veckor in vivo utveckling, Rag-/ - möss kommer att offras, mjälte och lymfkörtlar tas bort från möss.
      2. Enstaka celler kommer att behandlas genom mekanisk nedbrytning. Röda blodkroppar kommer att lyseras genom att använda ACK-lysbuffert ochmononucleocytes kommer att samlas och tvättas två gånger i kall PBS.
      3. Efter tvätt, kommer celler blockeras med Fc-blockerare 24G2 i 4 ° C i 20 minuter och vid slutet av blockering, kommer celler färgas med olika fluorokrom konjugerade anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 och anti-TCRβ antikroppar i 4 ° C under 20 minuter.
      4. Vid slutet av färgningen, kommer celler tvättades tre gånger i kall PBS före flödescytometrisk undersökning.

3. In vivo-programmering

  1. Generering av retroviralt konstrukt.
    1. MSCV-IRES-DsRED (Midr) vektorn konstrueras utifrån MSCV-IRES-GFP-vektorn genom att ersätta GFP-genen med den DsRED genen.
    2. OT-I T-cell-receptor-genen subklonas in i vektorn Midr att OT-I/MiDR konstruera.
  2. Retroviral transduktion och cellsortering.
    1. Plat-E förpackning celler are används för att alstra pseudovirus som kommer att användas för följande transduktion.
      1. 3x10 6 Plat-E celler ympas på en 100 mm odlingsskål en dag före transfektion.
    2. På dag 0, kommer Plat-E celler transfekteras med OT-Jag Midr plasmid med GeneJamma transfektion reagens.
    3. På dag 1, kommer 1x10 6 iPS-celler ympas i en brunn av en 0,1% gelatin förbelagda 24-brunnars platta.
      1. På dag 2, pseudovirus-innehållande supernatant från Plat-E kultur kommer att samlas in och passera genom ett 0,4 | im filter för att utesluta eventuella föroreningar.
      2. Transduktion utförs under förutsättning av 32 ° C centrifug vid 1400 rpm under 1 timme i närvaro av 5 pg / ml polybren.
      3. Efter centrifug-baserad transduktion, kommer celler att placeras i 32 ° C, 5% CO 2 inkubator över natten.
    5. På dag 3, upprepa dag 2 transduction procedur som beskrivs ovan. En 6-brunnsplatta kommer förbelagd med irSNL76 / 7 matarceller för framtida användning.
    6. På dag 4, transducerade iPS-celler kommer att trypsiniserades bort, centrifugerades vid 400 g under 5 minuter och såddes på förbelagda irSNL76 / 7 matarceller.
    7. Vid konfluens, kommer celler trypsiniserades bort, centrifugerades vid 400 g under 5 min och bearbetades för cellsortering. GFP och DsRED dubbla positiva celler kommer att sorteras efter MoFlo cellsorterare. Sorterade celler ska odlas på irSNL76 / 7 matarceller för framtida användning.
  3. Adoptiv överföring och tumör utmaning.
    OT-I TCR transducerade iPS (OT-I/iPS) celler i allmänhet hålls på irSNL76 / 7 matarceller såsom beskrivits ovan.
    1. På dagen för adoptiv överföring, är OT-I/iPS celler trypsineras bort, centrifugerades vid 400 g under 5 min och återsuspenderades i färskt medium.
    2. 30 minuters inkubation på en ny odlingsskål i 37 ° C inkubator krävs för att eliminera differentierad celloch resterande matarceller.
    3. Vid slutet av inkuberingen, kommer flytande celler uppsamlades och centrifugerades vid 400 g under 5 minuter.
    4. Cellpellet kommer att tvättas i kall PBS tre gånger, och celler kommer att passera genom en 70 ^ m nylon sil mellan två tvättar att utesluta cellklumpar (2X filtrering).
    5. Efter tvätt, kommer celler räknas och återsuspenderas i kall PBS i en koncentration av 1.5x10 7 celler / ml.
    6. Celler kommer att bibehållas på is före injektion.
    7. För adoptiv överföring kommer 4-6 veckor gamla kvinnliga C57BL/6J-möss användas. Innan intravenös injektion genom svansvenen kommer möss placeras under ett infrarött ljus för att vidga sina svansvenerna.
    8. Efter ven dilatation, kommer 200 pl cellsuspension eller 3x10 6 celler adoptivt överförd genom svansvenen. Sex veckor kommer att tillåtas för in vivo mognad av OT-I TCR transducerade iPS-celler.
      1. Efter sex veckors intravenös injektion, kommer 4x10 6 E.G7 tymom celler ympas intraperitonealt.
      2. E.G7 thymoma celler kommer att skördas från kultur och tvättas tre gånger i PBS.
      3. Vid slutet av tvättningen, kommer celler suspenderas i kall PBS i en koncentration av 8x10 7 celler / ml.
      4. 50 pl cellsuspension eller 4x10 6 celler kommer att injiceras i den peritoneala håligheten.
  4. Utvärdering.
    1. In vitro karaktärisering av OT-I TCR transducerade iPS-celler.
      1. Fluorescerande mikroskopisk undersökning av DsRED kommer GFP dubbla positiva celler utföras under konventionella fluorescensmikroskop med ofixerade levande celler.
      2. Gene integration och uttryck kommer att analyseras av både PCR och RT-PCR-analyser.
        1. Cellulärt DNA eller RNA kommer att isoleras separat från prover genom användning av Qiagen DNA ellerRNA-isoleringskit.
        2. PCR och RT-PCR kommer att utföras med hjälp av primers som specifikt känner igen den rekombinerade VDJ regionen TCR Vβ5 kedjan.
    2. T-cell-utveckling och mognad. Figur 3a.
      1. Vid vecka 2, kommer 4 och 6 efter cellöverföring, djur offras och mjälte, lymfkörtlar tas bort från djur.
      2. Enkelcellsuspension sker genom mekanisk nedbrytning. Röda blodkroppar kommer att lyseras genom att använda ACK-lysbuffert och mononucleocytes kommer att samlas och tvättas två gånger i kall PBS.
      3. Efter tvätt, kommer celler blockeras med Fc-blockerare 24G2 i 4 ° C i 20 minuter och vid slutet av blockering, kommer celler alikvoterades och färgades med olika fluorokrom konjugerade antikroppar i 4 ° C under 20 minuter.
      4. Vid slutet av färgningen, kommer celler tvättades tre gånger i kall PBS före lastning på flödescytometer.
    3. Peptid stimulering. Figur 3b.
      1. På dag 50 av tumör utmaning, kommer djuren offras och mjälten, lymfknutor tas bort från djur.
      2. Enkelcellsuspension sker genom mekanisk nedbrytning. Röda blodkroppar kommer att lyseras genom att använda ACK-lysbuffert och mononucleocytes kommer att samlas och tvättas två gånger i kall PBS.
      3. CD8 + T-celler kommer att isoleras med användning av Miltenyi Biotec s CD8 + T-cell isoleringskit. Isolerade CD8 + T-celler kommer att blandas med bestrålade splenocyter isolerade från obehandlade C57BL/6J-möss i förhållandet 1:10 och pulserades med 0,5 | amol / ml OVA 257-264 peptid under 40 timmar. Därefter Ett Brefeldin läggs i kulturen under ytterligare 4 timmar.
      4. Vid slutet av samodlingen, kommer cellerna skördas, tvättas och blockeras av Fc-blockerare, såsom beskrivits ovan.
      5. Blockerade celler kommer att färgas för utanpåliggande märkeERS som CD8 och TCR Vβ5 kedja med hjälp fluorokroma konjugerade antikroppar.
      6. Efter cellytan färgning kommer celler fastställas genom att använda 4% formaldehyd och permeabiliserades med kit-cell permeabilisering.
      7. Efter permeabilisering, kommer intracellulära molekyler som IL-2 och IFN-γ färgas genom användning fluorokroma konjugerade antikroppar.
      8. Före slutlig flödescytometrisk undersökning, kommer celler tvättades tre gånger i kall PBS för att utesluta alltför antikroppar.
    4. In vivo dödande analys. Figur 3C.
      1. Splenocyter från naiva C57BL/6J-möss kommer att isoleras och märkas med karboxifluorescein succinimidylester (CFSE) som målceller.
      2. Celler märkta med 5 fimol / ml CFSE (CFSE hi celler) kommer att pulsas med 10 pg / ml OVA 257-264 peptid och celler märkta med 0,5 fimol / ml CFSE (CFSE lo celler) kommer inte att pulseras. En blandning av 2.5x10 6 celler CFSE hi plus 2.5x10 6 CFSE lo celler kommer att adoptivt överföras av intravenös injektion i angiven mottagare.
      3. Efter 16 timmar, kommer splenocyter från dessa möss isoleras och CFSE + celler kommer att analyseras genom flödescytometri.
    5. Intraperitoneal tumör cellräkning. Figur 4.
      Vid dag 20 av tumör utmaning, kommer möss offras och peritonealhålan sköljning utförs med användning av kall PBS. Peritoneal lavage återhämtade tumörceller räknas.
    6. Tumörinfiltrerande T-celler identifieras. Figur 5.
      1. Vid det sena stadiet av tumör utmaning, kommer möss offras och tumör kommer att avlägsnas från peritonealhålan från olika grupper.
      2. Tumör kommer att skäras i bitar, en bit kommer att sättas in i en köldkärlet och placeras på torris omedelbart kommer den andra hälften fastställas i förmaldehyde och en tredje del kommer att bevaras i luftkonditionerade RPMI-1640 medium för framtida bruk.
      3. H & E färgning kommer att utföras i enlighet med allmänna protokollet från formaldehyd fasta och paraffin prover inslagna.
      4. Immunfluorescensfärgning kommer att utföras på kryokonserverade prover.
        1. Vävnad kommer att vara sektioneras och bevaras i -20 ° C före användning.
        2. Vävnadssnitt blir lufttorkas 15 minuter innan 15 minuter kall aceton fixering.
        3. Efter fixering, kommer sektionerna att vara lufttorkas under ytterligare 15 minuter innan 5 minuter PBS-tvätt.
        4. Efter tvätt, placera objektglasen i en fuktig kammare och täcka vävnadssnittet med 30 pl 3% BSA i PBS under 30 minuter för att blockera icke-specifik bindning.
        5. Vid slutet av blockering, blot av blockerande buffert och täcker vävnadssnitt med en 50 pl blandning av PE-anti-TCR Vα2 antikroppar och FITC-anti-OVA-antikroppar utspädda i 3% BSAi PBS.
        6. Inkubera i en fuktig kammare i 2 timmar och vid slutet av inkubationen kommer presentationsmaterial att finnas tvättas tre gånger i kall PBS och monteras med en vattenbaserad montering media innan fluorescerande mikroskopisk undersökning.
      5. Flödescytometrisk analys av tumörinfiltrerande T-celler.
        1. Tumör blir klämd till enkelcellsuspension och röda blodkroppar kommer att lyseras genom ACK lysbuffert.
        2. Efter tvättning och blockering, kommer celler märkas med olika fluorokrom konjugerade antikroppar som specifikt känner igen CD8, TCR Vα2 och TCR V β5 molekyler som uttrycks på cellytan.
    7. Mus överlevnad. Figur 6.
      Efter tumör utmaning kommer mus överlevnad övervakas noggrant.

4. Representativa resultat

CD3 och TCRβ används som markörer för Tceller. För att avgöra om stimulering av iPS-celler med Notch-ligand DL1 kan bidra till T-cell differentiering bedömde vi uttryck av CD3 och TCRβ + på iPS cell-härledda celler, och analyseras vidare uttryck av CD4 och CD8, gating på CD3 + och TCRβ + befolkning. Som visas här, på dag 22, CD3 + TCRβ + CD4 - CD8 + enstaka positiva (SP) T-celler genererades från iPS-celler in vitro. Dessutom, var iPS-cellerna SP-celler kan producera IL-2 och IFN-γ när de stimuleras in vitro genom platta-belagd anti-CD3 och lösliga anti-CD28-antikroppar (fig. 2), vilket tyder på IPS-cell-härledd T-celler är funktionella.

Efter adoptiv överföring till mottagande möss, majoriteten av TCR gen-transducerade iPS-celler genomgick differentiering till CD8 + CTL, som svarade in vitro till peptid stimulering genom sigcreting IL-2 och IFN-γ (fig 3). Viktigast adoptiv överföring av TCR-transducerade iPS-celler utlöste infiltration av OVA-reaktiva CTL i tumörvävnad och skyddade djur från tumör utmaning (bild 5-6). Sålunda TCR gen-transducerade iPS-celler kan differentiera till funktionella antigen-specifika CTL in vivo.

Figur 1
Figur 1. Morfologi av IPS celldifferentiering. Vid olika dagar var mus iPS-celler samodlades med OP9-DL1 celler i α-MEM-medium kompletterat med 20% FCS och 2,2 g / L natriumbikarbonat i närvaro av 5 ng / ml mFlt3L och 1 ng / ml mIL-7 .

Figur 2
Figur 2. T-cell differentiering från iPS-celler. Mus iPS-celler samodlades med OP9-DL1 celler som beskrivs i figur 1. På Day 22 var iPS cell-härledda celler isoleras och analyseras. A) CD4 + CD8 - eller CD4 - CD8 + celler efter slussning på CD3 + och TCRβ + populationer. B) Celler stimulerades med platta belagd anti-CD3 och löslig anti-CD28-antikroppar för 5 timmar vid 37 ° C vid 5% CO 2. IL-2 och IFN-γ analyserades genom intracellulär färgning efter grindning på levande CD4 - CD8 +-T-celler.

Figur 3
Figur 3. Antigen-specifika CD8 + T-cellutveckling från iPS-celler in vivo. OT-I TCR gen-transducerade iPS-celler injicerades IV till C57BL / 6 möss. Efter 6-10 veckor, var OVA-specifika CD8 + Vβ5 + T-cell utveckling bestämdes. A) CD8 + Vβ5 + T-celler från sammanslagna LNS och mjälte analyserades genom flödescytometri efter grindning på CD8 + populationer. B) IL-2 och IFN-γ produktion (mörka linjer, skuggade områden anger isotyp kontroller) bestämdes genom intracellulär cytokin färgning, efter grindning på CD8 + Vβ5 + populationer. C) In vivo proliferation / cytotoxicitetsanalys. CFSE hi (högra toppar) och lo CFSE (vänster toppar) målceller pulsades med OVA 257-264 peptiden och kontroll, respektive, och injicerades i möss tio veckor efter iPS cellöverföring eller en dag efter OT-I CTL överföring.

Figur 4
Figur 4. Adoptiv överföring av OT-I TCR gen-transducerade iPS-celler undertrycker tumörtillväxt. OT-I TCR gen-transducerade iPS-celler adoptivt överförd till C57BL / 6 möss. En grupp av möss injicerades med OVA-reaktiva CD8 + T-celler från OT-I TCR transgena möss, och en grupp av möss hade ingen cellöverföring. Efter antingen sex veckor eller den följande dagen efter cellöverföring, möss underkastades stimulering med E. G7 tumörceller. På dag 20, var tumörceller i peritonealhålan uppräknade.

Figur 5
Figur 5. IPS celler härrörande antigenspecifika CTL infiltrera tumörvävnader. På dag 30 till 35 efter tumör utmaning, var tumörvävnader undersöktes för tumör-reaktiv T-cellinfiltration. A) H & E-färgning. Inflammatoriska celler infiltrerade i tumörvävnad (↓). B) immunhistologisk färgning. OVA-specifika Vα2 + CTL (röd) infiltrerade med ägg-uttryckande tumörer vävnader (grön). C) En-cellsuspensioner från tumörvävnader analyserades för expression av Vα2 + och Vβ5 + genom flödescytometri efter grindning på CD8 + populationen.

"Bild Figur 6. Adoptiv överföring av OT-I TCR gen-transducerade iPS-celler upprätthåller mus överlevnad. OVA TCR gen-transducerade iPS-celler adoptivt överfördes till C57BL / 6 möss som utsattes för provokation med E. G7 tumörceller såsom beskrivs i figur. 4. Mus överlevnad på dag 50 visades av Kaplan-Meier överlevnadskurvor (n = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För ACT-baserade terapier, är in vitro-generering av ett stort antal starkt reaktiva Ag-specifika T-celler för in vivo-återinfusion en optimal strategi. Även om vår in vitro-metod ger upphov av funktionella T-celler från iPS-celler, ett stort antal iPS cell-härledda celler dör i fyra veckor, särskilt i den fjärde veckan. Vi drar slutsatsen att överlevnad signalerna från Notch signalering medieras av DL1 liksom IL-7 och Flt3L är inte tillräcklig för att upprätthålla överlevnad iPS-cell-härledda progenitorceller T, kan andra överlevnadsfaktorer vara kooperativ att reglera dessa cellmognad. TCR gentransduktion och in vitro stimulering med Notch-ligand i stort sett direkt T-cell differentiering från iPS-celler, emellertid de iPS-cellerna antigen-specifika T-celler kan fortfarande inte överlevnad längre, vilket förhindrar att erhålla lämpliga antal iPS celler härrörande antigen- specifika T-celler för ACT-immunoterapi.

ve_content "> Utvecklingen av T-lymfocyter i tymus är en välordnad processen. De omogna tymocyter som saknar uttryck av CD4 och CD8 kallas dubbla negativa (DN)-celler. delas in utvecklingsmässiga undergrupper baserat på uttryck av CD44 DN prekursorer och CD25:. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) och DN4 (CD44 - CD25 -) Endast DN3 celler som har genererat en funktionell TCRβ kedja som par med invariant pre-Tai och CD3 kedjorna att bilda en pre-TCR och väljs för ytterligare differentiering. Denna händelse, kallas β-val, representerar den första checkpointen vid T-cell utveckling. Pre-TCR bildas signaler spridning, uppsägning av TCRβ locus ombildning , och differentiering av DN tymocyter till CD4 + CD8 + dubbelt positiva (DP) steget 17. Vår stimulering in vitro wed Notch-ligand DL1 driver iPS-celler att passera genom β-val kontrollstation 2 veckor, och blir pre-T-celler (CD3 + TCRβ +, CD25 - CD44 -, CD4 - CD8 -). Ytterligare 2-veckors stimulering tillåter pre-T-celler att passera in i mogna CD8 + T-celler (CD3 + TCRβ +, CD4 - CD8 +, CD62L + CCR7 + CD27 + CD127 +). De mogna SP-T-celler kommer att dö i frånvaro av en ytterligare stimulering av TCR och CD3-komplexet.

In vivo programmering av antigenspecifika CTL från iPS-celler kan övervinna bristen få tillräckligt antal T-celler för ACT-baserade behandlingar. Trots den observerade kontrollen av tumörtillväxt, identifierade vi vissa begränsningar av ACT med TCR gen-transducerade iPS-celler. Först, är minst sex veckor in vivo utveckling nödvändig för T-cell-differentiering som härrör från transferred iPS-celler. Andra märkte vi päls förlust, benskörhet och andra mindre autoimmuna manifestationer i möss som fick TCR-omvandlade iPS-celler som observerats i vissa kliniska prövningar förvaltar T-cell-baserad cancer immunterapi. Dessa effekter kan orsakas av generering av andra immuna celltyper från de överförda iPS-celler. Men hur dessa celler genereras in vivo är okänd. Tredje, adoptiv överföring av TCR gen-transducerade iPS-celler har risken att generera teratom grund av dess stam fenotyp. Men än så länge i vår studie identifierade vi bara extrathymic massa en Rag1 - / - mus och har inte observerats abnormitet i konventionellt C57BL / 6 möss. Därför föreslår vi, för att få maximal effektivitet, är det bättre att få genetisk bakgrund match för in vivo iPS differentiering.

I motsats till derivat av ekonomiska och sociala råd, onormal genuttryck i vissa celler särskiljas från iPS-celler har potential för att inducera T-cells-beroende immunsvar i syngena mottagare 18. Därför bör immunogeniciteten hos celler härledda från patient-specifika iPS-celler utvärderas innan någon klinisk tillämpning av dessa autologa celler övervägs. Genom att analysera genuttryck profiler IPS-celler erhållna celler har det visat sig att en grupp av 9 gener (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, SPT1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, Retn) uttrycktes till onormalt höga nivåer . Dessutom ökade inducera uttryck av tre av dessa gener (Hormad1, Zg16 och Cyp3a11) i ES-celler signifikant immunogenicitet på transplantation till genetiskt matchade mottagare 18. Sålunda har gruppen nio proteiner kan orsaka avstötning av IPS-cellerna celler efter adoptiv överföring och kan representera immunogena markörer. Trots den potentiella immunogenicitet IPS-cell-derived T-lymfocyter har inte fastställts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Shinya Yamanaka (Kyoto University) för att ge IPS-MEF-ng-20D-17 cellinje, Dr Dario Vignali (St Jude Barnens Research Hospital) för att stödja OT1-2A • pMig II konstruktion, Dr Juan carlos Zuniga-Pflucker (Institutionen för immunologi, University of Toronto) för att stödja OP9-DL1 cellinje, och Dr Kent E Vrana (Institutionen för farmakologi, Penn State University College of Medicine) för att hjälpa utformningen av denna studie. Detta projekt finansieras under bidrag med licensnummer K18CA151798 från National Cancer Institute, Barsumian Trust och melanom Research Foundation (J. Song).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Tags

Stamcellsbiologi immunologi T-celler inducerade pluripotenta stamceller differentiering Notch signalering T-cell receptor adoptiv cell överföring
Riktad Differentiering av inducerade pluripotenta stamceller mot T-lymfocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, … More

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter